Name: global level quantification of histone post-translational modifications in a 3d cell culture model of hepatic tissue
Uploaded: 2022-05-05T14:00:00
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Sidoli研究室は、白血病研究財団(Hollis Brownstein New Investigator Research Grant)、AFAR(Sagol Network GerOmics Award)、Deerfield(Xseed Award)、Relay Therapeutics、Merck、NIH所長室(1S10OD030286-01)を感謝の意をもって認めています。

1. 緩衝液および試薬の調製
<ol><li>細胞増殖培地(HepG2/C3A細胞の場合):ダルベッコの改変イーグル培地(DMEM、4.5g/Lグルコースを含む)にウシ胎児血清(FBS)(10%v/v)、非必須アミノ酸(1%v/v)、L-グルタミンサプリメント(1%v/v)およびペニシリン/ストレプトマイシン(0.5%v/v)を加える。増殖培地は、4°Cで最大2週間保存される。</li>
	<li>200 mM 酪酸ナトリウム (NaBut) 溶液: 10 mL を調製するために、220.1...

ヒストンPTMの分析は、典型的なプロテオミクス分析パイプラインとは根本的に異なります。ほとんどのヒストンPTMは依然として謎めいた生物学的機能を持っています。その結果、遺伝子オントロジーや経路データベースなどの注釈は利用できません。ヒストン修飾をそれらの触媒作用を担う酵素またはこれらのPTMに結合するドメインを含むタンパク質(例えば、HISTome36)に関?...

19世紀後半以来、細胞培養システムは、人体外の細胞の成長と発達を研究するためのモデルとして使用されてきました1,2。それらの使用はまた、組織および器官が健康な状況および罹患した文脈の両方でどのように機能するかを研究するために拡張されている1,3。浮遊細胞(例えば、血液細胞)は、インビボで三次元(3D)構造で集合しないので、ペトリ皿またはフラスコ中でシームレスかつ交換的に増殖する。固体器官に由来する細胞は、二次元(2D)または3D培養系のいずれかで増殖することができる。2D培養では、細胞は平坦な表面2,4に接着する単層で増殖する。2D細胞培養システムは、指数関数的な増殖および速い倍加時間(典型的には24時間〜数日5)によって特徴付けられる。3Dシステム内の細胞は、組織のようなコングロマリットをより密接にモデル化する複雑な細胞間相互作用を形成するように成長し、倍加時間が1ヶ月以上に達することができる動的平衡に達する能力によって特徴付けられる5。
この論文では、低重力をシミュレートする回転細胞培養システムで3Dスフェロイドを増殖させる革新的な方法論を紹介します6。これは、1990年代にNASAによって導入された細胞培養システムの単純化された派生物です7。このアプローチは、スピニングフラスコのような既存の方法で発生するせん断力を最小限に抑え、回転楕円体の再現性を高めます6。さらに、回転バイオリアクターは活性栄養素拡散を増加させ、培地交換が実用的でない吊り下げドロップ細胞培養のようなシステムで起こる壊死形成を最小限に抑える6。このようにして、細胞はほとんど乱れずに成長し、組織内で増殖する細胞に関連する構造的および生理学的特性の形成を可能にする。このようにして培養されたC3A肝細胞(HepG2/C3A)は、超構造細胞小器官を有するだけでなく、インビボで観察されたレベルに匹敵する量のATP、アデニル酸キナーゼ、尿素、およびコレステロールも産生した1,2。加えて、2D対.3D細胞培養系で増殖した細胞は、異なる遺伝子発現パターンを示す8。3Dスフェロイドとして増殖したC3A肝細胞の遺伝子発現解析は、これらの細胞が広範囲の肝臓特異的タンパク質、ならびに肝機能を調節する重要な経路に関与する遺伝子を発現することを示した8。以前の出版物は、2D培養における指数関数的に増殖する細胞のプロテオームと、3Dスフェロイド培養における動的平衡状態の細胞との間の違いを実証した5。これらの違いには、細胞代謝が含まれ、これは今度は細胞5の構造、機能、および生理機能に影響を及ぼす。2D培養で増殖した細胞のプロテオームは、細胞複製に関与するタンパク質がより豊富であったが、3Dスフェロイドのプロテオームは肝機能においてより豊富であった5。
3Dスフェロイドとして増殖した細胞の複製速度が遅いほど、クロマチン状態および修飾に関連する特定の現象(例えば、ヒストンクリッピング9)がより正確にモデル化される。ヒストンクリッピングは、ヒストンN末端尾部の一部のタンパク質分解的切断を引き起こす不可逆的なヒストン翻訳後修飾(PTM)である。その生物学的機能はまだ議論中である10,11,12,13が、初代細胞および肝臓組織におけるその存在は、スフェロイドとして増殖させたHepG2/C3A細胞によってモデル化されるが、平坦な細胞としてはモデル化されていないことは明らかである9。クロマチンの状態と修飾は、主に遺伝子へのアクセス可能性、ひいては遺伝子の発現を調節することによってDNAの読み出しを調節するため、これは非常に重要です14。ヒストンPTMは、ヒストンが組み立てられるヌクレオソームの正味電荷に影響を与えることによってクロマチン状態に直接影響を及ぼすか、またはクロマチンを作家、読者、および消しゴム14に募集することによって間接的に影響する。現在までに数百のヒストンPTMが同定されており15、クロマチンがDNA16を解釈するために細胞によって使用される「ヒストンコード」を宿主とする仮説を補強している。しかしながら、無数のPTMの組み合わせ15の同定、およびヒストンPTMの組み合わせが、孤立して存在するPTMとは異なる生物学的機能をしばしば有するという発見(例えば、Fischle、et al.17)は、「ヒストンコード」を解読するためにより多くの作業が必要であることを強調する。
現在、ヒストンPTM分析は、抗体を利用する技術(例えば、ウェスタンブロット、免疫蛍光、またはクロマチン免疫沈降に続いてシーケンシング[ChIP-seq])または質量分析(MS)のいずれかに基づいている。抗体ベースの技術は高感度であり、ヒストンマークのゲノムワイド局在化に関する詳細な情報を提供することができるが、まれなPTMまたは組み合わせに存在するPTMを研究する際にはしばしば制限される18、19、20。MSは、単一および共存するタンパク質修飾、特にヒストンタンパク質18、19、20のハイスループットかつ偏りのない同定および定量により適している。これらの理由から、この研究所と他のいくつかの研究所は、ヒストンペプチド(ボトムアップMS)、無傷のヒストンテール(ミドルダウンMS)、および全長ヒストンタンパク質(トップダウンMS)の分析のためにMSパイプラインを最適化しました21,22,23。
以下に詳述するのは、HepG2/C3Aスフェロイドを増殖させ、タンデム質量分析(nLC-MS/MS)とオンラインで組み合わせたナノ液体クロマトグラフィーによるヒストンペプチド分析(ボトムアップMS)の準備ワークフローです。2D細胞培養物を増殖させ、細胞を回収し、バイオリアクターに移し、そこでスフェロイドを形成し始める(図1)。培養の18日後、スフェロイドを酪酸ナトリウムまたはコハク酸ナトリウムで処理して、ヒストンアセチル化およびスクシニル化の相対的存在量を増加させた。特に、3D培養物は、遺伝子毒性化合物およびそれらの平坦な培養物と同等の化合物で処理することができる。実際、最近の出版物は、3D培養における細胞の毒物学的応答が、2D平坦培養におけるものよりも初代組織に類似していることを強調している24,25。次いで、指定された時点で細胞を回収し、核単離を行った。次いで、ヒストンを抽出し、ガルシアらによって最初に開発されたプロトコールに従ってトリプシン消化の前後に無水プロピオン酸で誘導体化した。この手順により、逆相クロマトグラフィー(C18)によるオンライン分離およびMSによる検出に適したサイズのペプチドが生成されます。最後に、ヒストンペプチドを同定および定量し、生成されたデータを、より完全な生物学的解釈のために複数の方法で表した。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5-20 &#181;L pipet tips</td>
			<td>BRAND</td>
			<td>13-889-172 (Fisher Scientific)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>2239480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L multi-channel pipette</td>
			<td>BRAND</td>
			<td>BR7059000 (Millipore Sigma)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>Henke Sass Wolf</td>
			<td>14-817-31 (Fisher Scientific)</td>
			<td>Luer lock tip, graduated to 12 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10, 20, 200, and 1000 &#181;L single-channel pipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>14-285-904 (Fisher Scientific)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L pipet tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>30389164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 G syringe needle</td>
			<td>Air-Tite</td>
			<td>14-817-100 (Fisher Scientific)</td>
			<td>3&#34; length, 0.05&#34; diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L multi-channel pipette</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-200 &#181;L pipet tips</td>
			<td>BRAND</td>
			<td>Z740118 (Millipore Sigma)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well ultra-low attachment microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>07-200-602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2&#160; U-shaped cell culture flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>461464U</td>
			<td>Untreated, with vent cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well skirted plate</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-96-FS-C (Corning)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A949-1</td>
			<td>Acetone should be used cold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate (NH4HCO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6141-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC423300250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture grade water</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-055-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClinoReactor</td>
			<td>CelVivo</td>
			<td>10004-12</td>
			<td>Bioreactor for 3D cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClinoStar</td>
			<td>CelVivo</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Clinostat CO2 incubator for 3D cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control unit</td>
			<td>CelVivo</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Tablet for ClinoStar settings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>17-205-CV</td>
			<td>1X solution with 4.5 g/L glucose and sodium pyruvate, without L-glutamine and phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fume hood</td>
			<td>Mott</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Model 7121000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-8B</td>
			<td>9&#34;, cotton-plugged, borosilicate glass, non-sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutagro supplement</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-015-CI</td>
			<td>200 mM L-ananyl-L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-022-CV</td>
			<td>1X solution without calcium, magnesium, and phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC grade acetonitrile</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A955-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC grade water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A481-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM non-essential amino acids</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-025-CI</td>
			<td>100X solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oasis HLB resin</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186007549</td>
			<td>Hydrophilic-Lipophilic-Balanced (HLB) Resin with 30&#181;m particle size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>IQLAAEGAAPFADBMBHQ</td>
			<td>High resolution mass spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oro-Flex I polypropylene filter plate</td>
			<td>Orochem</td>
			<td>OF1100</td>
			<td>96-well polypropylene filter plate w/ 10 &#181;M PE frit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td>100X solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH paper</td>
			<td>Hydrion</td>
			<td>Z111848 (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>0-13 pH test paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette gun</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z666467 (Millipore Sigma)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymicro capillary</td>
			<td>Molex</td>
			<td>50-110-7740 (Fisher Scientific)</td>
			<td>Flexible fused silica capillary tubing with polymide coating, 75 &#181;M ID x 363 &#181;M OD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene 10 mL serological pipets, sterile</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1367549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propionic anhydride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>240311-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75-217-420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reprosil-Pur resin</td>
			<td>MSWIL</td>
			<td>R13.AQ.0003</td>
			<td>120 &#197; pore size, C18-AQ phase, 3 &#181;M bead size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td>Clay Adams</td>
			<td>25477 (American Laboratory Trading)</td>
			<td>Nutator Mixer 1105</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing grade modified trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium butyrate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A11079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium succinate dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>14160-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac vacuum concentrator (1.5 mL microcentrifuge tubes)</td>
			<td>Savant</td>
			<td>20249 (American Laboratory Trading)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac vacuum concentrator (96-well)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15308325</td>
			<td>Savant SPD1010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile hood</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1375</td>
			<td>Class II, Type A2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid (H2SO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-004-375</td>
			<td>Baker Analyzed ACS reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-culture treated 100 mm x 20 mm dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid (TCA)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AC421451000</td>
			<td>Resuspend 100% w/v in HPLC grade water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI28904</td>
			<td>Sequencing grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum manifold 96-well</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAVM0960R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z258415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FSGPD10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide bore pipet tips 1000 &#181;L</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>14-222-703 (Fisher Scientific)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide bore pipet tips 200 &#181;L</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>14-222-730 (Fisher Scientific)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

global level quantification of histone post-translational modifications in a 3d cell culture model of hepatic tissue

哺乳動物細胞の扁平培養は、細胞生理機能を理解するために広く使用されている インビトロ アプローチであるが、このシステムは、不自然に速い細胞複製のために固体組織のモデリングにおいて制限されている。これは、高速複製細胞がDNA複製に頻繁に関与し、不均一な倍数体集団を有するため、成熟クロマチンをモデル化する場合に特に困難である。以下に、3次元(3D)細胞培養システムを使用して静止クロマチン修飾をモデル化、処理、および分析するためのワークフローを示します。このプロトコールを使用して、肝細胞癌細胞株は、活発な栄養拡散および低い剪断力を提供するインキュベーター内で再現性のある3Dスフェロイドとして増殖される。酪酸ナトリウムおよびコハク酸ナトリウムによる処理は、それぞれヒストンアセチル化およびスクシニル化の増加を誘導した。ヒストンアセチル化およびスクシニル化のレベルの増加は、より開放的なクロマチン状態と関連している。次いで、スフェロイドを回収して細胞核を単離し、そこからヒストンタンパク質を抽出し、翻訳後修飾を分析する。ヒストン分析は、タンデム質量分析とオンラインで結合された液体クロマトグラフィー を介して 実行され、その後に社内の計算パイプラインが続きます。最後に、組み合わせヒストンマークの頻度および出現を調査するためのデータ表現の例が示されている。

このプロトコルでは、HepG2/C3Aスフェロイドを20 mM NaButおよび10 mM NaSucで処理し、どちらもヒストンPTMの全球レベルに影響を与えました(図3A)。その後、ヒストンPTMを同定し、MS/MS取得 により 単一残基レベルで定量化しました(図3B)。
サンプルを反復で実行する場合、統計解析を実行して、サンプル間のPTMのフォールド変化?...

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Global Level Quantification of Histone Post-Translational Modifications in a 3D Cell Culture Model of Hepatic Tissue

このプロトコルは、3次元細胞培養システムを使用して、ほぼ生理学的状態のクロマチン修飾をモデル化、処理、および分析する方法を概説しています。

肝組織の3D細胞培養モデルにおけるヒストン翻訳後修飾のグローバルレベルの定量化

Flat cultures of mammalian cells are a widely used in vitro approach for understanding cell physiology, but this system is limited in modeling solid ...

グローバルなクロマチンダイナミクスは、がんや加齢などのいくつかの疾患状態の重要なメディエーターであることが示されています。私たちのプロトコルは、このプロセスを研究するための生理学的に関連するモデルを提供します。ヒストン翻訳後修飾またはPTMSの標準的な実験室分析は、通常、抗体ベースのアッセイを使用して一度に1つのPTMについてプロービングすることに限定される。ヒストンPTMSの液体クロマトグラフィー質量分析により、1回の実験で数百のPTMSの存在量を測定することができます。手順を実演するのは、ステファニー・ストランスキー、ロナルド・カトラー、ジュリー・キム、それぞれ研究室のポスドク、大学院生、研究技術者です。まず、標準的な増殖培地を用いて、細胞を80%コンフルエントになるまで単層として増殖させる。その後、HBSSで細胞を洗浄する。HBSSで希釈した5ミリリットルの0.05%トリプシン-EDTAを加える。細胞を5%の二酸化炭素で摂氏37度で5分間インキュベートする。顕微鏡を使用して細胞の剥離を確認します。細胞を計数した後、細胞懸濁液を新鮮な増殖培地で希釈する。0.5ミリリットルの成長培地を加えて、それぞれに複数のマイクロウェルを有する超低付着24ウェル丸底プレートを平衡化する。次いで、プレートを3000 x gで遠心分離し、プレートの表面から気泡を除去した。次に、以前に作製した細胞懸濁液を24ウェルプレートに移し、120 x gで3分間遠心分離する。24ウェルプレート内の細胞を確認し、スフェロイド形成のためにプレートを摂氏37度で5%二酸化炭素で24時間インキュベートします。一方、バイオリアクターを平衡化するために、25ミリリットルの滅菌水を湿度チャンバーに、9ミリリットルの成長培地を細胞チャンバーに加える。バイオリアクターを回転式クリノスタットインキュベーター内で、摂氏37度で5%の二酸化炭素で24時間インキュベートします。1ミリリットル幅のボアチップを用いて穏やかにピすることにより、超低付着24ウェルプレートからスフェロイドを剥離し、組織培養皿に移す。十分に形成されたスフェロイドを選択するには、顕微鏡下でスフェロイドの品質を確認してください。良質の回転楕円体は、均一なサイズ、コンパクトさ、および真円度を有する。平衡化したバイオリアクターを5ミリリットルの新鮮な成長培地で満たし、スフェロイドをその中に移す。次いで、バイオリアクターを新鮮な成長媒体で完全に満たし、バイオリアクターをクリノスタットインキュベーターに10〜11RPMで入れる。2〜3日ごとに、10ミリリットルの古いメディアを新しいメディアに置き換えて、成長メディアを交換します。この回転楕円体のサイズと数が増えるにつれて、インキュベーターの回転速度を上げます。回転楕円体ペレットを得た後、ペレットに5倍量の冷たい0.2モル硫酸を加え、ピペットを上下にしてペレットを破壊し、ヒストンを放出する。遠心分離後に上清が得られたら、最終濃度が体積比で25〜30体積%になるように、冷濃縮トリクロロ酢酸を加える。そして、原稿に記載されているようにチューブを数回反転させ、遠心分離機で混合します。上清を捨てた後、ガラス牧草地ピペットを用いて、ペレットおよびチューブの壁を約500マイクロリットルの冷アセトンおよび0.1%塩酸で洗浄し、次いで3,400 x gで摂氏4度で5分間遠心分離する。その後、チューブをひっくり返して上清を捨てる。ガラスの牧草地ピペットを使用して、500マイクロリットルの100%冷アセトンを加えてペレットを洗浄し、前述のように遠心分離機で洗浄します。上澄み液を捨てた後、丁寧にピしてアセトンを完全に除去し、開いた蓋で約20分間試料を乾燥させた。ペレットを20マイクロリットルの15〜20%のアセトニトリル中にpH8の100ミリモルの炭酸水素アンモニウムに再懸濁する。ボルテックスの後、サスペンションを1000 x gで30秒間スピンダウンします。8つ以上のサンプルについて、各再懸濁サンプルを96ウェルプレートに移す。次に、フードに、2マイクロリットルの無水プロピオン酸を加え、ピにより5回混合する。水酸化アンモニウム10マイクロリットルを素早く加え、ピで5回混合する。HLB樹脂をマグネチックスタープレート上で混合する。次いで、70マイクロリットルのHLB懸濁液を、96ウェル収集プレート上の96ウェルフィルタープレートの各ウェルに加える。フロースルーを破棄した後、100マイクロリットルの0.1%トリフルオロ酢酸で樹脂を洗浄する。各サンプルを100マイクロリットルの0.1%トリフルオロ酢酸に再懸濁した後、各サンプルを各ウェルにロードし、真空を使用して飛散を防ぎます。フロースルーを廃棄した後、100マイクロリットルの0.1%トリフルオロ酢酸でサンプルを洗浄し、フィルタープレートを新しい収集プレートの上に置いた。次に、0.1%トリフルオロ酢酸に60%アセトニトリル60マイクロリットルを各ウェルに加え、真空を使用して飛沫を防ぎます。流れを集め、速度真空中で乾燥させる。乾燥した収集プレートをHPLCにロードし、原稿に記載されているようにLC/MS/MS法を実行します。この研究では、三次元スフェロイドとして増殖したC3A肝細胞において、一般的なヒストン翻訳後修飾の相対的存在量が観察された。翻訳後修飾は、ヒストンタンパク質から生成されたペプチド中の単一残基でも観察することができた。酪酸ナトリウムによるスフェロイドの処理は、ヒストンアセチル化の相対的存在量を増加させたが、コハク酸ナトリウムによるものは、スクシニル化を増強したヒストン残基を有する。この方法はまた、酪酸ナトリウム処理後のヒストンアセチル化の分布パターンと、コハク酸ナトリウムによる処理後のヒストンコハク酸化の分布パターンを実証した。結果はまた、異なるヒストン修飾の一般的なパターンを示した。酪酸ナトリウム処理は、ヒストンタンパク質H3から生成されたペプチド上のリジン残基14のアセチル化を有意に増強したが、それは、その第9のリジン残基が2つのメチル基を有し、1つまたは3つのメチル基を有しなかった場合のみである。H3由来ペプチドにおける個々の修飾および翻訳後修飾の様々な組み合わせの相対的存在量も計算した。酪酸ナトリウム処理後の翻訳後修飾の組合せパターンも、ヒストンタンパク質H4から生成されたペプチドにおいて観察された。ここでも、酪酸ナトリウム処理はアセチル化の有意な増加をもたらした。回転楕円体をできるだけベンチに置かないようにし、サンプルのこぼれを避けるために脱塩ステップで重要な注意を払う必要があります。このワークフローは、高速複製扁平細胞培養よりも生理学的モデルを使用して、固体組織中のクロマチンを探索するために使用することができる。

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Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis

ヒストンの抽出からデータ解析まで：ボトムアップ質量分析法を用いてヒストンの翻訳後修飾の解析のための完全なワークフロー

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone ...

A Tissue Culture Model of Estrogen-producing Primary Bovine Granulosa Cells

細胞のエストロゲン産生主ウシ顆粒の組織培養モデル

Ovarian granulosa cells (GC) are the major source of estradiol synthesis. Induced by the preovulatory luteinizing hormone (LH) surge, cells of the theca ...