Name: global level quantification of histone post-translational modifications in a 3d cell culture model of hepatic tissue
Uploaded: 2022-05-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Global Level Quantification of Histone Post-Translational Modifications in a 3D Cell Culture Model of Hepatic Tissue at JoVE.com

Sidoli-laboratoriet anerkjenner takknemlig Leukemia Research Foundation (Hollis Brownstein New Investigator Research Grant), AFAR (Sagol Network GerOmics award), Deerfield (Xseed Award), Relay Therapeutics, Merck og NIH Office of the Director (1S10OD030286-01).

1. Utarbeidelse av buffere og reagenser
<ol><li>Cellevekstmedier (for HepG2/C3A-celler): Tilsett foster bovint serum (FBS) (10 % v/v), ikke-essensielle aminosyrer (1 % v/v), L-glutamintilskudd (1 % v/v) og penicillin/streptomycin (0,5 % v/v) til Dulbeccos modifiserte ørns medium (DMEM, DMEM, inneholder 4,5 g/l glukose). Vekstmedier lagres ved 4 °C i maksimalt 2 uker.</li>
	<li>200 mM natrium butyrat (NaBut) oppløsning: For å forberede 10 ml, resuspend 220.18 mg NaBut i 10 ml ddH2O. Oppbe...

Analysen av histone PTMer er fundamentalt forskjellig fra den typiske proteomiske analyserørledningen. De fleste histone PTMs har fortsatt gåtefulle biologiske funksjoner; Som et resultat er merknader som Gene Ontology eller pathway-databaser ikke tilgjengelige. Det finnes flere ressurser som forbinder histone modifikasjoner med enzymet som er ansvarlig for deres katalyse eller proteiner som inneholder domener som binder disse PTM-ene (f.eks. HISTome36). I tillegg er det mulig å spekulere på d...

Siden slutten av 1800-tallet har cellekultursystemer blitt brukt som modell for å studere vekst og utvikling av celler utenfor menneskekroppen 1,2. Deres bruk har også blitt utvidet for å studere hvordan vev og organer fungerer i både sunne og syke sammenhenger 1,3. Suspensjonsceller (f.eks. blodceller) vokser i Petri-retter eller kolber sømløst og om hverandre, da de ikke samles i tredimensjonale (3D) strukturer in vivo. Celler avledet fra faste organer kan vokse i enten todimensjonale (2D) eller 3D-kultursystemer. I 2D-kultur dyrkes celler i en monolayer som holder seg til en flat overflate 2,4. 2D-cellekultursystemer er preget av eksponentiell vekst og en rask doblingstid, vanligvis 24 timer til noen dager5. Celler i 3D-systemer vokser for å danne intrikate cellecelleinteraksjoner som modellerer vevlignende konglomerater nærmere, og de er preget av deres evne til å nå en dynamisk likevekt der deres doblingstid kan nå 1 måned eller lenger5.
Presentert i dette dokumentet er en innovativ metodikk for å vokse 3D-sfæroider i roterende cellekultursystemer som simulerer redusert tyngdekraft6. Dette er et forenklet derivat av et cellekultursystem introdusert av NASA på 1990-tallet7. Denne tilnærmingen minimerer skjærekrefter, som forekommer i eksisterende metoder som spinnende kolber, og øker sfæroid reproduserbarhet6. I tillegg øker den roterende bioreaktoren aktiv næringsdiffusjon, og minimerer nekrotisk formasjon som forekommer i systemer som hengende dråpecellekultur der medieutveksling er upraktisk6. På denne måten vokser cellene for det meste uforstyrret, noe som muliggjør dannelse av strukturelle og fysiologiske egenskaper forbundet med celler som vokser i vev. C3A hepatocytter (HepG2/C3A) dyrket på denne måten hadde ikke bare ultrastrukturelle organeller, men produserte også mengder ATP, adenylatkinase, urea og kolesterol som kan sammenlignes med nivåer observert i vivo 1,2. I tillegg viser celler som vokser i 2D vs.3D cellekultursystemer forskjellige genuttrykksmønstre8. Genuttrykksanalyse av C3A-hepatocytter dyrket som 3D-sfæroider viste at disse cellene uttrykte et bredt spekter av leverspesifikke proteiner, samt gener involvert i viktige veier som regulerer leverfunksjonen8. Tidligere publikasjoner viste forskjellene mellom proteomer av eksponentielt voksende celler i 2D-kultur vs. celler ved dynamisk likevekt i 3D-sfæroidkulturer5. Disse forskjellene inkluderer cellulær metabolisme, som igjen påvirker strukturen, funksjonen og fysiologien til cellen5. Proteomet av celler dyrket i 2D-kultur var mer beriket i proteiner involvert i cellereplikering, mens proteomet av 3D-sfæroider var mer beriket i leverfunksjonalitet5.
Den langsommere replikeringshastigheten til celler som vokser som 3D-sfæroider, modellerer mer nøyaktig spesifikke fenomener forbundet med kromatintilstand og modifikasjoner (f.eks. histoneklipping9). Histone klipping er en irreversibel histone post-translasjonell modifikasjon (PTM) som forårsaker proteolytisk spalting av en del av histone N-terminal halen. Mens den biologiske funksjonen fortsatt er under diskusjon 10,11,12,13, er det klart at dens tilstedeværelse i primære celler og levervev er modellert av HepG2 / C3A celler vokst som sfæroider, men ikke som flate celler 9. Dette er kritisk, da kromatintilstand og modifikasjoner regulerer DNA-avlesning hovedsakelig ved å modulere tilgjengelighet til gener og dermed deres uttrykk14. Histone PTMer påvirker enten kromatintilstanden direkte ved å påvirke nettoladningen til nukleosomene der histoner er samlet, eller indirekte ved å rekruttere kromatinforfattere, lesere og viskelær14. Hundrevis av histone PTMer har blitt identifisert til dags dato15, forsterke hypotesen om at kromatin er vert for en "histone kode" som brukes av cellen til å tolke DNA16. Imidlertid er identifiseringen av et utall PTM-kombinasjoner15, og oppdagelsen av at kombinasjoner av histone PTMer ofte har forskjellige biologiske funksjoner fra PTMer tilstede isolert (f.eks. Fischle, et al.17), fremhever at det kreves mer arbeid for å dekryptere "histonekoden".
For tiden er histone PTM-analyse enten basert på teknikker som bruker antistoffer (f.eks. vestlige flekker, immunfluorescens eller kromatinimoprecipitation etterfulgt av sekvensering [ChIP-seq]) eller massespektrometri (MS). Antistoffbaserte teknikker har høy følsomhet og kan gi detaljert informasjon om genom-bred lokalisering av histone merker, men er ofte begrenset i å studere sjeldne PTMer eller PTMer til stede i kombinasjoner 18,19,20. MS er mer egnet for høy gjennomstrømning og objektiv identifisering og kvantifisering av enkelt- og sameksisterte proteinmodifikasjoner, spesielt histoneproteiner 18,19,20. Av disse grunnene har dette og flere andre laboratorier optimalisert MS-rørledningen for analyse av histonepeptider (bottom-up MS), intakte histonehaler (middels ned MS) og histoneproteiner i full lengde (ovenfra og ned MS)21,22,23.
Nedenfor er en arbeidsflyt for dyrking av HepG2/C3A-sfæroider og klargjøring av dem for histonepeptidanalyse (bottom-up MS) via nano-flytende kromatografi, kombinert online med tandemmassespektrometri (nLC-MS/MS). En 2D-cellekultur ble dyrket og cellene ble høstet og overført til en bioreaktor hvor de skulle begynne å danne sfæroider (figur 1). Etter 18 dager i kultur ble sfæroider behandlet med natrium butyrat eller natrium succinate for å øke de relative overflodene av histonacetylering og kortfattethet. Spesielt kan 3D-kulturer behandles med gentoksiske forbindelser like godt som deres flate kulturekvivalenter; Faktisk fremhever nyere publikasjoner at toksikologiresponsen til celler i 3D-kultur er mer lik primærvev enn de i 2D flat kultur24,25. Celler ble deretter samlet inn på bestemte tidspunkter og kjernefysisk isolasjon ble utført. Deretter ble histoner ekstrahert og avlet med propionisk anhydrid før og etter trypsin fordøyelse i henhold til en protokoll først utviklet av Garcia et al.26. Denne prosedyren genererer peptider av riktig størrelse for online separasjon med omvendt fasekromatografi (C18) og deteksjon med MS. Til slutt ble histonepeptider identifisert og kvantifisert, og de genererte dataene var representert på flere måter for en mer fullstendig biologisk tolkning.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5-20 &#181;L pipet tips</td>
			<td>BRAND</td>
			<td>13-889-172 (Fisher Scientific)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>2239480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L multi-channel pipette</td>
			<td>BRAND</td>
			<td>BR7059000 (Millipore Sigma)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>Henke Sass Wolf</td>
			<td>14-817-31 (Fisher Scientific)</td>
			<td>Luer lock tip, graduated to 12 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10, 20, 200, and 1000 &#181;L single-channel pipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>14-285-904 (Fisher Scientific)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L pipet tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>30389164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 G syringe needle</td>
			<td>Air-Tite</td>
			<td>14-817-100 (Fisher Scientific)</td>
			<td>3&#34; length, 0.05&#34; diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L multi-channel pipette</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-200 &#181;L pipet tips</td>
			<td>BRAND</td>
			<td>Z740118 (Millipore Sigma)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well ultra-low attachment microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>07-200-602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2&#160; U-shaped cell culture flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>461464U</td>
			<td>Untreated, with vent cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well skirted plate</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-96-FS-C (Corning)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A949-1</td>
			<td>Acetone should be used cold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate (NH4HCO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6141-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC423300250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture grade water</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-055-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClinoReactor</td>
			<td>CelVivo</td>
			<td>10004-12</td>
			<td>Bioreactor for 3D cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClinoStar</td>
			<td>CelVivo</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Clinostat CO2 incubator for 3D cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control unit</td>
			<td>CelVivo</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Tablet for ClinoStar settings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>17-205-CV</td>
			<td>1X solution with 4.5 g/L glucose and sodium pyruvate, without L-glutamine and phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fume hood</td>
			<td>Mott</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Model 7121000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-8B</td>
			<td>9&#34;, cotton-plugged, borosilicate glass, non-sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutagro supplement</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-015-CI</td>
			<td>200 mM L-ananyl-L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-022-CV</td>
			<td>1X solution without calcium, magnesium, and phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC grade acetonitrile</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A955-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC grade water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A481-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM non-essential amino acids</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-025-CI</td>
			<td>100X solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oasis HLB resin</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186007549</td>
			<td>Hydrophilic-Lipophilic-Balanced (HLB) Resin with 30&#181;m particle size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>IQLAAEGAAPFADBMBHQ</td>
			<td>High resolution mass spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oro-Flex I polypropylene filter plate</td>
			<td>Orochem</td>
			<td>OF1100</td>
			<td>96-well polypropylene filter plate w/ 10 &#181;M PE frit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td>100X solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH paper</td>
			<td>Hydrion</td>
			<td>Z111848 (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>0-13 pH test paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette gun</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z666467 (Millipore Sigma)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymicro capillary</td>
			<td>Molex</td>
			<td>50-110-7740 (Fisher Scientific)</td>
			<td>Flexible fused silica capillary tubing with polymide coating, 75 &#181;M ID x 363 &#181;M OD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene 10 mL serological pipets, sterile</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1367549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propionic anhydride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>240311-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75-217-420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reprosil-Pur resin</td>
			<td>MSWIL</td>
			<td>R13.AQ.0003</td>
			<td>120 &#197; pore size, C18-AQ phase, 3 &#181;M bead size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td>Clay Adams</td>
			<td>25477 (American Laboratory Trading)</td>
			<td>Nutator Mixer 1105</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing grade modified trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium butyrate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A11079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium succinate dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>14160-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac vacuum concentrator (1.5 mL microcentrifuge tubes)</td>
			<td>Savant</td>
			<td>20249 (American Laboratory Trading)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac vacuum concentrator (96-well)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15308325</td>
			<td>Savant SPD1010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile hood</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1375</td>
			<td>Class II, Type A2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid (H2SO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-004-375</td>
			<td>Baker Analyzed ACS reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-culture treated 100 mm x 20 mm dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid (TCA)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AC421451000</td>
			<td>Resuspend 100% w/v in HPLC grade water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI28904</td>
			<td>Sequencing grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum manifold 96-well</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAVM0960R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z258415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FSGPD10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide bore pipet tips 1000 &#181;L</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>14-222-703 (Fisher Scientific)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide bore pipet tips 200 &#181;L</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>14-222-730 (Fisher Scientific)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

global level quantification of histone post-translational modifications in a 3d cell culture model of hepatic tissue

Flate kulturer av pattedyrceller er en mye brukt in vitro tilnærming for å forstå cellefysiologi, men dette systemet er begrenset i modellering av faste vev på grunn av unaturlig rask cellereplikering. Dette er spesielt utfordrende når modellering av moden kromatin, da raske replikeringsceller ofte er involvert i DNA-replikasjon og har en heterogen polyploid populasjon. Presentert nedenfor er en arbeidsflyt for modellering, behandling og analyse av quiescent kromatin modifikasjoner ved hjelp av en tredimensjonal (3D) cellekultur system. Ved hjelp av denne protokollen vokser hepatocellulære karsinomcellelinjer som reproduserbare 3D-sfæroider i en inkubator som gir aktiv næringsdiffusjon og lave skjærekrefter. Behandling med natrium butyrat og natrium succinate induserte en økning i henholdsvis histonacetylering og kortfattethet. Økning i nivåer av histon acetylering og kortfattethet er forbundet med en mer åpen kromatintilstand. Sfæroider samles deretter inn for isolering av cellekjerner, hvorfra histoneproteiner ekstraheres for analyse av deres postoversettelsesendringer. Histone analyse utføres via flytende kromatografi koblet online med tandem masse spektrometri, etterfulgt av en intern beregningsrørledning. Til slutt vises eksempler på datarepresentasjon for å undersøke frekvensen og forekomsten av kombinatoriske histonemerker.

I denne protokollen ble HepG2/C3A-sfæroider behandlet med 20 mM NaBut og 10 mM NaSuc, som begge påvirket globale nivåer av histone PTMer (figur 3A). Histone PTM-er ble deretter identifisert og kvantifisert på enkeltrester via MS/MS-oppkjøp (figur 3B).
Når prøver kjøres i repliker, kan statistisk analyse utføres for å vurdere foldeendringsberikelsen av en PTM mellom prøver, samt reproduserbarheten av observasjonen. ...

Watch this Scientific Journal Video about Global Level Quantification of Histone Post-Translational Modifications in a 3D Cell Culture Model of Hepatic Tissue at JoVE.com

Global Level Quantification of Histone Post-Translational Modifications in a 3D Cell Culture Model of Hepatic Tissue

Denne protokollen skisserer hvordan et tredimensjonalt cellekultursystem kan brukes til å modellere, behandle og analysere kromatinmodifikasjoner i en nesten fysiologisk tilstand.

Global nivå kvantifisering av Histone post-oversettelsesendringer i en 3D-cellekulturmodell av levervev

Flat cultures of mammalian cells are a widely used in vitro approach for understanding cell physiology, but this system is limited in modeling solid ...

Global kromatindynamikk har vist seg å være en viktig formidler av flere sykdomstilstander, som kreft og aldring. Vår protokoll gir en fysiologisk relevant modell for å studere denne prosessen. Standard laboratorieanalyse av histone post-translasjonelle modifikasjoner eller PTMS er vanligvis begrenset til å undersøke for en enkelt PTM om gangen ved hjelp av antistoffbaserte analyser.Flytende kromatografi massespektrometri analyse av histone PTMS tillater oss å måle overflod av hundrevis av PTMS i et enkelt eksperiment. Å demonstrere prosedyren vil være Stephanie Stransky, Ronald Cutler og Julie Kim, en postdoktor, gradstudent og forskningsteknologi, henholdsvis fra laboratoriet. For det første, ved hjelp av standard vekstmedier, vokser cellene som et monolag til de er 80% sammenløp.Vask deretter cellene med HBSS. Tilsett fem milliliter 0,05% trypsin-EDTA fortynnet i HBSS. Inkuber cellene i fem minutter ved 37 grader Celsius med 5% karbondioksid.Bruk et mikroskop til å kontrollere celleavløsning. Etter å ha talt cellene, fortynn cellefjæringen med friske vekstmedier. Tilsett 0,5 milliliter vekstmedier for å likevekte en ultralav 24-brønns rund bunnplate med flere mikrobrønner i hver.Sentrifuger deretter platene på 3000 x g for å fjerne luftbobler fra overflaten av platen. Overfør nå den tidligere laget cellefjæringen til 24-brønnsplaten og sentrifugen i tre minutter ved 120 x g. Kontroller cellene i 24-brønnsplaten og inkuber deretter platene ved 37 grader Celsius med 5% karbondioksid i 24 timer for sfæroiddannelse.I mellomtiden, for å likevekte bioreaktoren, tilsett 25 milliliter sterilt vann til fuktighetskammeret og ni milliliter vekstmedier til cellekammeret. Inkuber bioreaktoren i en roterende clinostatinkubator i 24 timer ved 37 grader Celsius med 5% karbondioksid. Løsne sfæroidene fra den ultralave festeplaten med 24 brønner ved å pipettere forsiktig ved hjelp av en milliliter brede borespisser, og overfør dem til en vevskulturfat.For å velge tilstrekkelig dannes sfæroider, kontroller kvaliteten på sfæroider under et mikroskop. Sfæroider av god kvalitet har jevn størrelse, kompaktitet og rundhet. Fyll den likevektede bioreaktoren med fem milliliter ferske vekstmedier, og overfør sfæroidene inn i den.Fyll deretter bioreaktoren helt med friske vekstmedier og legg bioreaktoren i clinostat-inkubatoren ved 10 til 11 RPM. Annenhver til tre dager utveksler vekstmedier ved å erstatte 10 milliliter gamle medier med friske medier. Etter hvert som disse sfæroidene øker i størrelse og antall, øker rotasjonshastigheten til inkubatoren.Etter å ha fått sfæroidpellet, legg til fem bind kald 0,2 molar svovelsyre til pellets og pipette opp og ned for å forstyrre pellets og frigjøre histoner. Når supernatanten er oppnådd etter sentrifugering, tilsett kald konsentrert trichloroacetic acid, slik at den endelige konsentrasjonen blir 25 til 30% volum etter volum. Og bland det ved å invertere røret et par ganger og sentrifuger som beskrevet i manuskriptet.Etter å ha kastet supernatanten, ved hjelp av en glassbeitepipette, vask pelletsen og veggene i røret med ca. 500 mikroliter kaldt aceton og 0,1% saltsyre, og sentrifuger deretter ved 3400 x g i fem minutter ved fire grader Celsius. Vend deretter røret for å kaste supernatanten. Bruk en glassbeitepipette, tilsett 500 mikroliter 100% kald aceton for å vaske pellets og sentrifuger som vist tidligere.Etter å ha kastet supernatanten, fjern acetonet helt ved å pipettere forsiktig, og la prøven tørke med et åpent lokk i ca. 20 minutter. Resuspend pellet i 20 mikroliter av 15 til 20% av acetonitril i en 100 millimolar ammonium bikarbonat av pH 8. Etter virveling, spinn ned suspensjonen ved 1000 x g i 30 sekunder.For åtte eller flere prøver, overfør hver re-suspendert prøve til en 96-brønns plate. Deretter legger du i en hette til to mikroliter propionisk anhydrid og blander ved pipettering fem ganger. Tilsett raskt 10 mikroliter ammoniumhydroksid og bland ved pipettering fem ganger.Bland HLB harpiks på en magnetisk røreplate. Tilsett deretter 70 mikroliter av HLB-fjæringen til hver brønn av en 96-brønns filterplate på en 96-brønns oppsamlingsplate. Etter å ha kastet gjennom strømmen, vask harpiksen med 100 mikroliter 0,1% trifluoroedinsyre.Etter å ha resuspendert hver prøve i 100 mikroliter med 0,1% trifluoroedtisk syre, last hver prøve i hver brønn og forhindre sprut ved hjelp av et vakuum. Etter å ha kastet gjennom strømmen, vask prøvene med 100 mikroliter 0,1% trifluoroedtisk syre, og legg filterplaten på en ny oppsamlingsplate. Deretter tilsetter du 60 mikroliter 60% acetonitril i 0,1% trifluoroeddiksyre til hver brønn og forhindrer sprut ved hjelp av vakuum.Samle gjennomstrømningen og tørk i et hastighetsvakuum. Legg den tørkede oppsamlingsplaten i HPLC og kjør LC/MS/MS-metoden som beskrevet i manuskriptet. I denne studien ble den relative overfloden av vanlige histone post-translasjonelle modifikasjoner observert i C3A hepatocytter vokst som tredimensjonale sfæroider.Post-translasjonelle modifikasjoner kan også observeres på en enkelt rest i peptider generert fra histone proteiner. Behandling av sfæroider med natrium butyrat økte den relative overflod av histon acetylering, mens det med natrium succinate forbedret histone rester succinylation. Metoden viste også distribusjonsmønsteret for histonacetylering etter natrium butyratbehandling og histonsuccinylering etter behandling med natriumsuccinat.Resultatet viste også vanlige mønstre av forskjellige histone modifikasjoner. Natrium butyrat behandlinger betydelig forbedret acetylering av lysinrester 14 på et peptid generert fra histone protein H3, bare når dens niende lysinrester hadde to metylgrupper, men ikke en eller tre metylgrupper. De relative overflodene av individuelle modifikasjoner og ulike kombinasjoner av post-translasjonelle modifikasjoner i det H3-avledede peptidet ble også beregnet.Kombinatoriske mønstre av post-translasjonelle modifikasjoner etter natrium butyrat behandling ble også observert i et peptid generert fra histone protein H4. Her resulterte også natrium butyratbehandling i en betydelig økning i acetylering. Kritisk oppmerksomhet bør settes på å holde sfæroidene på benken så lite som mulig og i et avsaltingstrinn for å unngå prøvesøl. Denne arbeidsflyten kan brukes til å utforske kromatin i faste vev ved hjelp av en mer fysiologisk modell enn rask replikering av flate cellekulturer.

Research

JoVE Journal

Biology

Electrospinning Fibrous Polymer Scaffolds for Tissue Engineering and Cell Culture

As the field of tissue engineering evolves, there is a tremendous demand to produce more suitable materials and processing techniques in order to address ...

Detection of Post-translational Modifications on Native Intact Nucleosomes by ELISA

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 ...

Detection of Histone Modifications in Plant Leaves

Chromatin structure is important for the regulation of gene expression in eukaryotes. In this process, chromatin remodeling, DNA methylation, and covalent ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Isolering og Primær kultur Rat Nedsatt Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Spirende Gjær Protein Extraction og rensing for studier av funksjon, interaksjoner, og posttranslasjonelle modifikasjoner

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Identifisering av Post-translasjonell Modifikasjoner av Plant Protein komplekser

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Analyse av global RNA syntese på celle-nivå etter Hypoksi

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

High Resolution Kvantifisering av krystallinsk cellulose akkumulering i<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Roots å overvåke Tissue-spesifikke Cell Wall Modifikasjoner

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis

Komplett arbeidsflyt for analyse av Histone posttranslasjonelle modifikasjoner hjelp Bottom-up massespektrometri: Fra Histone Utvinning til dataanalyse

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone ...

A Tissue Culture Model of Estrogen-producing Primary Bovine Granulosa Cells

En vev kultur modell av Estrogen-produserende primære bovin Granulosa celler

Ovarian granulosa cells (GC) are the major source of estradiol synthesis. Induced by the preovulatory luteinizing hormone (LH) surge, cells of the theca ...