Name: global level quantification of histone post-translational modifications in a 3d cell culture model of hepatic tissue
Uploaded: 2022-05-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Global Level Quantification of Histone Post-Translational Modifications in a 3D Cell Culture Model of Hepatic Tissue at JoVE.com

Лаборатория Сидоли с благодарностью отмечает Фонд исследований лейкемии (Hollis Brownstein New Investigator Research Grant), AFAR (sagol Network GerOmics award), Deerfield (премия Xseed), Relay Therapeutics, Merck и Офис директора NIH (1S10OD030286-01).

1. Подготовка буферов и реагентов
<ol><li>Среда роста клеток (для клеток HepG2 / C3A): Добавьте фетальную бычью сыворотку (FBS) (10% v / v), заменимые аминокислоты (1% v / v), добавку L-глутамина (1% v / v) и пенициллин / стрептомицин (0,5% v / v) в модифицированную среду Dulbecco Eagle 's Medium (DMEM, содержащую 4,5 г / л гл...

Анализ гистоновых ПТМ принципиально отличается от типичного конвейера анализа протеомики. Большинство гистоновых ПТМ по-прежнему имеют загадочные биологические функции; в результате аннотации, такие как Генная онтология или базы данных путей, недоступны. Существует несколько ресурс...

С конца 19века системы клеточных культур использовались в качестве модели для изучения роста и развития клеток вне человеческого организма 1,2. Их использование также было расширено для изучения того, как ткани и органы функционируют как в здоровом, так и в больном контексте 1,3. Суспензионные клетки (например, клетки крови) растут в чашках или колбах Петри плавно и взаимозаменяемо, поскольку они не собираются в трехмерные (3D) структуры in vivo. Клетки, полученные из твердых органов, могут расти как в двумерных (2D), так и в 3D-системах культур. В 2D культуре клетки выращиваются в монослое, который прилипает к плоской поверхности 2,4. Системы 2D-культур клеток характеризуются экспоненциальным ростом и быстрым временем удвоения, обычно от 24 ч до нескольких дней5. Клетки в 3D-системах растут, образуя сложные клеточные взаимодействия, моделирующие тканеподобные конгломераты более тесно, и они характеризуются своей способностью достигать динамического равновесия, где их время удвоения может достигать 1 месяца или дольше5.
В этой статье представлена инновационная методология выращивания 3D-сфероидов во вращающихся системах клеточных культур, которые имитируют пониженную гравитацию6. Это упрощенная производная системы клеточных культур, введенная НАСА в 1990-хгодах 7. Этот подход сводит к минимуму силы сдвига, которые возникают в существующих методах, таких как вращающиеся колбы, и увеличивает сфероидную воспроизводимость6. Кроме того, вращающийся биореактор увеличивает активную диффузию питательных веществ, сводя к минимуму некротическое образование, которое происходит в таких системах, как висячая культура капельных клеток, где обмен средой непрактичен6. Таким образом, клетки растут в основном без помех, что позволяет формировать структурные и физиологические характеристики, связанные с клетками, растущими в ткани. Гепатоциты C3A (HepG2/C3A), культивируемые таким образом, не только имели ультраструктурные органеллы, но и продуцировали количества АТФ, аденилаткиназы, мочевины и холестерина, сопоставимые с уровнями, наблюдаемыми in vivo 1,2. Кроме того, клетки, выращенные в системах 2D и .3D клеточных культур, демонстрируют различные паттерны экспрессии генов8. Анализ экспрессии генов гепатоцитов C3A, выращенных в виде 3D-сфероидов, показал, что эти клетки экспрессируют широкий спектр специфических для печени белков, а также генов, участвующих в ключевых путях, которые регулируют функцию печени8. Предыдущие публикации продемонстрировали различия между протеомами экспоненциально растущих клеток в 2D-культуре и клетками в динамическом равновесии в 3D-сфероидных культурах5. Эти различия включают клеточный метаболизм, который, в свою очередь, влияет на структуру, функцию и физиологию клетки5. Протеом клеток, выращенных в 2D-культуре, был более обогащен белками, участвующими в репликации клеток, в то время как протеом 3D-сфероидов был более обогащен функциональностью печени5.
Более медленная скорость репликации клеток, выращенных в виде 3D-сфероидов, более точно моделирует конкретные явления, связанные с состоянием хроматина и модификациями (например, отсечение гистонов9). Гистоновое обрезание является необратимой посттрансляционной модификацией гистона (PTM), которая вызывает протеолитическое расщепление части N-концевого хвоста гистона. Хотя его биологическая функция все еще обсуждается 10,11,12,13, ясно, что его присутствие в первичных клетках и ткани печени моделируется клетками HepG2 / C3A, выращенными как сфероиды, но не как плоские клетки 9. Это имеет решающее значение, поскольку состояние хроматина и его модификации регулируют считывание ДНК в основном путем модуляции доступности генов и, следовательно, их экспрессии14. Гистоновые ПТМ либо влияют на состояние хроматина напрямую, воздействуя на чистый заряд нуклеосом, где собраны гистоны, либо косвенно, привлекая хроматиновых писателей, читателей и ластиков14. Сотни гистоновых ПТМ были идентифицированы на сегодняшний день15, что подтверждает гипотезу о том, что хроматин содержит «гистоновый код», используемый клеткой для интерпретации ДНК16. Однако идентификация множества комбинацийPTM 15 и открытие того, что комбинации гистоновых PTM часто имеют различные биологические функции от PTM, присутствующих изолированно (например, Fischle, et al.17), подчеркивает, что для расшифровки «гистонового кода» требуется больше работы.
В настоящее время анализ Гистонового ПТМ основан либо на методах, использующих антитела (например, западные блоты, иммунофлуоресценцию или иммунопреципитацию хроматина с последующим секвенированием [ChIP-seq]), либо масс-спектрометрию (МС). Методы, основанные на антителах, обладают высокой чувствительностью и могут предоставить подробную информацию о общегеномной локализации гистоновых меток, но часто ограничены в изучении редких ПТМ или ПТМ, присутствующих в комбинациях 18,19,20. MS больше подходит для высокопроизводительной и непредвзятой идентификации и количественной оценки одиночных и сосуществующих модификаций белков, в частности гистоновых белков 18,19,20. По этим причинам эта и несколько других лабораторий оптимизировали конвейер MS для анализа гистоновых пептидов (снизу вверх MS), интактных гистоновых хвостов (middle-down MS) и полноразмерных гистоновых белков (сверху вниз MS)21,22,23.
Ниже подробно описан рабочий процесс выращивания сфероидов HepG2 / C3A и подготовки их к анализу гистоновых пептидов (снизу вверх MS) с помощью наножидкой хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией (nLC-MS / MS). Выращивали 2D-культуру клеток, и клетки собирали и передавали в биореактор, где они начинали образовывать сфероиды (рисунок 1). После 18 дней в культуре сфероиды обрабатывали бутиратом натрия или сукцинатом натрия для увеличения относительного обилия ацетилирования и сукцинилирования гистонов. Примечательно, что 3D-культуры могут быть обработаны генотоксическими соединениями так же, как и их эквиваленты плоских культур; фактически, последние публикации подчеркивают, что токсикологический ответ клеток в 3D-культуре больше похож на первичные ткани, чем на те, которые находятся в 2D плоской культуре24,25. Затем клетки собирали в определенные моменты времени и проводили ядерную изоляцию. Затем гистоны экстрагировали и дериватизировали пропионовым ангидридом до и после переваривания трипсина в соответствии с протоколом, впервые разработанным Garcia et al.26. Эта процедура генерирует пептиды соответствующего размера для онлайн-разделения с помощью обратнофазной хроматографии (C18) и обнаружения при РС. Наконец, гистоновые пептиды были идентифицированы и количественно определены, а полученные данные были представлены несколькими способами для более полной биологической интерпретации.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5-20 &#181;L pipet tips</td>
			<td>BRAND</td>
			<td>13-889-172 (Fisher Scientific)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>2239480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L multi-channel pipette</td>
			<td>BRAND</td>
			<td>BR7059000 (Millipore Sigma)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>Henke Sass Wolf</td>
			<td>14-817-31 (Fisher Scientific)</td>
			<td>Luer lock tip, graduated to 12 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10, 20, 200, and 1000 &#181;L single-channel pipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>14-285-904 (Fisher Scientific)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L pipet tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>30389164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 G syringe needle</td>
			<td>Air-Tite</td>
			<td>14-817-100 (Fisher Scientific)</td>
			<td>3&#34; length, 0.05&#34; diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L multi-channel pipette</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-200 &#181;L pipet tips</td>
			<td>BRAND</td>
			<td>Z740118 (Millipore Sigma)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well ultra-low attachment microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>07-200-602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2&#160; U-shaped cell culture flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>461464U</td>
			<td>Untreated, with vent cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well skirted plate</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-96-FS-C (Corning)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A949-1</td>
			<td>Acetone should be used cold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate (NH4HCO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6141-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC423300250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture grade water</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-055-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClinoReactor</td>
			<td>CelVivo</td>
			<td>10004-12</td>
			<td>Bioreactor for 3D cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClinoStar</td>
			<td>CelVivo</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Clinostat CO2 incubator for 3D cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control unit</td>
			<td>CelVivo</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Tablet for ClinoStar settings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>17-205-CV</td>
			<td>1X solution with 4.5 g/L glucose and sodium pyruvate, without L-glutamine and phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fume hood</td>
			<td>Mott</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Model 7121000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-8B</td>
			<td>9&#34;, cotton-plugged, borosilicate glass, non-sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutagro supplement</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-015-CI</td>
			<td>200 mM L-ananyl-L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-022-CV</td>
			<td>1X solution without calcium, magnesium, and phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC grade acetonitrile</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A955-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC grade water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A481-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM non-essential amino acids</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-025-CI</td>
			<td>100X solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oasis HLB resin</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186007549</td>
			<td>Hydrophilic-Lipophilic-Balanced (HLB) Resin with 30&#181;m particle size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>IQLAAEGAAPFADBMBHQ</td>
			<td>High resolution mass spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oro-Flex I polypropylene filter plate</td>
			<td>Orochem</td>
			<td>OF1100</td>
			<td>96-well polypropylene filter plate w/ 10 &#181;M PE frit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td>100X solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH paper</td>
			<td>Hydrion</td>
			<td>Z111848 (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>0-13 pH test paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette gun</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z666467 (Millipore Sigma)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymicro capillary</td>
			<td>Molex</td>
			<td>50-110-7740 (Fisher Scientific)</td>
			<td>Flexible fused silica capillary tubing with polymide coating, 75 &#181;M ID x 363 &#181;M OD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene 10 mL serological pipets, sterile</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1367549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propionic anhydride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>240311-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75-217-420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reprosil-Pur resin</td>
			<td>MSWIL</td>
			<td>R13.AQ.0003</td>
			<td>120 &#197; pore size, C18-AQ phase, 3 &#181;M bead size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td>Clay Adams</td>
			<td>25477 (American Laboratory Trading)</td>
			<td>Nutator Mixer 1105</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing grade modified trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium butyrate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A11079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium succinate dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>14160-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac vacuum concentrator (1.5 mL microcentrifuge tubes)</td>
			<td>Savant</td>
			<td>20249 (American Laboratory Trading)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac vacuum concentrator (96-well)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15308325</td>
			<td>Savant SPD1010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile hood</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1375</td>
			<td>Class II, Type A2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid (H2SO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-004-375</td>
			<td>Baker Analyzed ACS reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-culture treated 100 mm x 20 mm dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid (TCA)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AC421451000</td>
			<td>Resuspend 100% w/v in HPLC grade water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI28904</td>
			<td>Sequencing grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum manifold 96-well</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAVM0960R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z258415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FSGPD10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide bore pipet tips 1000 &#181;L</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>14-222-703 (Fisher Scientific)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide bore pipet tips 200 &#181;L</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>14-222-730 (Fisher Scientific)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

global level quantification of histone post-translational modifications in a 3d cell culture model of hepatic tissue

Плоские культуры клеток млекопитающих являются широко используемым подходом in vitro для понимания физиологии клеток, но эта система ограничена в моделировании твердых тканей из-за неестественно быстрой репликации клеток. Это особенно сложно при моделировании зрелого хроматина, поскольку быстро реплицирующиеся клетки часто участвуют в репликации ДНК и имеют гетерогенную полиплоидную популяцию. Ниже представлен рабочий процесс для моделирования, обработки и анализа модификаций покоящегося хроматина с использованием трехмерной (3D) системы клеточных культур. Используя этот протокол, клеточные линии гепатоцеллюлярной карциномы выращиваются в виде воспроизводимых 3D-сфероидов в инкубаторе, обеспечивающих активную диффузию питательных веществ и низкие силы сдвига. Лечение бутиратом натрия и сукцинатом натрия индуцировало увеличение ацетилирования гистонов и сукцинилирования соответственно. Повышение уровней ацетилирования гистонов и сукцинилирования связано с более открытым состоянием хроматина. Сфероиды затем собираются для выделения клеточных ядер, из которых извлекаются гистоновые белки для анализа их посттрансляционных модификаций. Анализ гистонов выполняется с помощью жидкостной хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией, за которой следует собственный вычислительный конвейер. Наконец, приведены примеры представления данных для исследования частоты и возникновения комбинаторных гистоновых меток.

В этом протоколе сфероиды HepG2/C3A обрабатывали 20 мМ NaBut и 10 мМ NaSuc, оба из которых влияли на глобальные уровни гистоновых ПТМ (рисунок 3А). Затем гистоновые ПТМ были идентифицированы и количественно определены на уровне одного остатка с помощью сбора MS/MS (рису...

Watch this Scientific Journal Video about Global Level Quantification of Histone Post-Translational Modifications in a 3D Cell Culture Model of Hepatic Tissue at JoVE.com

Global Level Quantification of Histone Post-Translational Modifications in a 3D Cell Culture Model of Hepatic Tissue

Этот протокол описывает, как трехмерная система клеточных культур может быть использована для моделирования, обработки и анализа модификаций хроматина в почти физиологическом состоянии.

Количественная оценка гистонов на глобальном уровне посттрансляционных модификаций в 3D-модели клеточной культуры печеночной ткани

Flat cultures of mammalian cells are a widely used in vitro approach for understanding cell physiology, but this system is limited in modeling solid ...

Было показано, что глобальная динамика хроматина является важным медиатором нескольких болезненных состояний, таких как рак и старение. Наш протокол предоставляет физиологически значимую модель для изучения этого процесса. Стандартный лабораторный анализ посттрансляционных модификаций гистонов или PTMS обычно ограничивается зондированием одного ПТМ за один раз с использованием анализов на основе антител.Жидкостная хроматографическая масс-спектрометрический анализ гистонов ПТМС позволяет измерить обилие сотен ПТМС за один эксперимент. Продемонстрировать процедуру будут Стефани Странски, Рональд Катлер и Джули Ким, постдок, аспирант и научный техник, соответственно, из лаборатории. Во-первых, используя стандартные питательные среды, выращивайте клетки как монослой до тех пор, пока они не станут на 80% сливающимися.Затем промыть клетки HBSS. Добавьте пять миллилитров 0,05% трипсина-ЭДТА, разведенных в HBSS. Инкубируйте клетки в течение пяти минут при 37 градусах Цельсия с 5% углекислым газом.Используйте микроскоп для проверки отслоения клеток. После подсчета клеток разбавьте клеточную суспензию свежими питательными средами. Добавьте 0,5 миллилитра питательной среды, чтобы уравновесить сверхнизкую прикрепленную 24-луночную круглодонную пластину с несколькими микролунками в каждой.Затем центрифугируют пластины при 3000 х г, чтобы удалить пузырьки воздуха с поверхности пластины. Теперь переложите ранее изготовленную клеточную суспензию на 24-луночную пластину и центрифугу на три минуты при 120 х г. Проверьте клетки в 24-луночной пластине, а затем инкубируйте пластины при 37 градусах Цельсия с 5% углекислым газом в течение 24 часов для образования сфероидов.Между тем, чтобы уравновесить биореактор, добавьте 25 миллилитров стерильной воды в камеру влажности и девять миллилитров питательных сред в камеру клеток. Инкубируйте биореактор во вращающемся клиностатном инкубаторе в течение 24 часов при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом. Отсоедините сфероиды от сверхнизкой 24-луночной пластины путем осторожного пипетирования с использованием одного миллилитра широких наконечников отверстия и перенесите их в чашку для культуры тканей.Чтобы выбрать достаточно форм сфероидов, проверьте качество сфероидов под микроскопом. Сфероиды хорошего качества имеют равномерный размер, компактность и округлость. Заполните уравновешенный биореактор пятью миллилитрами свежих питательных сред и перенесите в него сфероиды.Затем заполните биореактор полностью свежими питательными средами и поместите биореактор в инкубатор клиностата при 10-11 оборотах в минуту. Каждые два-три дня обменивайтесь питательными носителями, заменяя 10 миллилитров старых носителей свежими носителями. По мере того, как сфероиды увеличиваются в размерах и количестве, увеличивают скорость вращения инкубатора.После получения сфероидной гранулы добавьте пять объемов холодной 0,2 молярной серной кислоты в гранулу и пипетку вверх и вниз, чтобы разрушить гранулу и высвободить гистоны. После получения супернатанта после центрифугирования добавляют холодную концентрированную трихлоруксусную кислоту, так что конечная концентрация становится от 25 до 30% объема по объему. И смешайте его, перевернув трубку несколько раз и центрифугу, как описано в рукописи.После выброса надосадочного вещества, используя стеклянную пастбищную пипетку, промыть гранулу и стенки трубки примерно 500 микролитрами холодного ацетона и 0,1% соляной кислоты, а затем центрифугу при 3 400 х г в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Затем переверните трубку, чтобы выбросить супернатант. Используя стеклянную пастбищную пипетку, добавьте 500 микролитров 100% холодного ацетона для промывки гранул и центрифуги, как было продемонстрировано ранее.После выброса супернатанта полностью удалите ацетон путем тщательной пипетки и дайте образцу высохнуть с открытой крышкой в течение примерно 20 минут. Повторно суспендировать гранулу в 20 микролитрах от 15 до 20% ацетонитрила в 100-миллимолярном бикарбонате аммония рН 8. После вихря открутите суспензию на 1000 х g в течение 30 секунд.Для восьми или более образцов перенесите каждый повторно взвешенный образец на 96-луночную пластину. Затем в вытяжку добавляют два микролитра пропионового ангидрида и перемешивают путем пипетирования пять раз. Быстро добавьте 10 микролитров гидроксида аммония и перемешайте путем пипетки пять раз.Смешайте HLB-смолу на магнитной перемешиваемой пластине. Затем добавьте 70 микролитров суспензии HLB в каждую скважину фильтрующей пластины из 96 скважин на 96-луночной коллекторной пластине. После отбрасывания потока промыть смолу 100 микролитрами 0,1% трифторуксусной кислоты.После повторного использования каждого образца в 100 микролитрах 0,1% трифторуксусной кислоты загрузите каждый образец в каждую скважину и предотвратите разбрызгивание с помощью вакуума. После отбрасывания потока промыть образцы 100 микролитрами 0,1% трифторуксусной кислоты и поместить фильтрующую пластину на новую пластину сбора. Затем добавьте 60 микролитров 60% ацетонитрила в 0,1% трифторуксусной кислоты в каждую лунку и предотвратите разбрызгивание с помощью вакуума.Соберите поток и высушите в вакууме со скоростью. Загрузите высушенную коллекционную пластину в ВЭЖХ и запустите метод LC/MS/MS, как описано в рукописи. В этом исследовании относительное обилие общих посттрансляционных модификаций гистона наблюдалось в гепатоцитах C3A, выращенных в виде трехмерных сфероидов.Посттрансляционные модификации также могут наблюдаться на одном остатке в пептидах, полученных из гистоновых белков. Лечение сфероидов бутиратом натрия увеличивало относительное обилие ацетилирования гистонов, тогда как лечение сукцинатом натрия усиливало сукцинилирование гистонового остатка. Метод также продемонстрировал схему распределения ацетилирования гистонов после обработки бутиратом натрия и сукцинилирования гистонов после обработки сукцинатом натрия.Результат также показал общие паттерны различных модификаций гистонов. Обработка бутиратом натрия значительно усиливала ацетилирование остатка лизина 14 на пептиде, полученном из гистонового белка H3, только тогда, когда его девятый остаток лизина имел две метильные группы, но не одну или три метильные группы. Также было рассчитано относительное обилие отдельных модификаций и различных комбинаций посттрансляционных модификаций в пептиде, полученном из H3.Комбинаторные паттерны посттрансляционных модификаций после обработки бутиратом натрия также наблюдались в пептиде, полученном из гистонового белка H4. Здесь также лечение бутиратом натрия привело к значительному увеличению ацетилирования. Критическое внимание следует уделять тому, чтобы сфероиды находились на скамейке как можно меньше и на стадии обессоливания, чтобы избежать разлива образца. Этот рабочий процесс может быть использован для исследования хроматина в твердых тканях с использованием более физиологической модели, чем быстро реплицирующиеся плоские клеточные культуры.

Research

JoVE Journal

Biology

Electrospinning Fibrous Polymer Scaffolds for Tissue Engineering and Cell Culture

Электропрядения Волокнистые Строительные леса Полимер для тканевой инженерии и клеточной культуры

As the field of tissue engineering evolves, there is a tremendous demand to produce more suitable materials and processing techniques in order to address ...

Detection of Post-translational Modifications on Native Intact Nucleosomes by ELISA

Обнаружение посттрансляционной Изменения по земельному Неповрежденный нуклеосом с помощью ИФА

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 ...

Detection of Histone Modifications in Plant Leaves

Обнаружение модификации гистонов в листьях растений

Chromatin structure is important for the regulation of gene expression in eukaryotes. In this process, chromatin remodeling, DNA methylation, and covalent ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Выделение и первичной культуре клеток крысы Печеночная

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Многообещающая Добыча дрожжевого белка и очистка по изучению функций, взаимодействия и пост-трансляционных модификаций

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Идентификация пост-трансляционных модификаций растительных белковых комплексов

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Анализ глобальной РНК синтеза на уровне одной клетки следующем Гипоксия

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Высокое разрешение Количественное кристаллической целлюлозы Накопление в<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Корни для мониторинга Тканеспецифическая клеточной стенки Модификации

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis

Полный рабочий процесс для анализа гистонов посттрансляционные модификации Использование снизу вверх Масс-спектрометрия: От Гистона добычи до анализа данных

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone ...

A Tissue Culture Model of Estrogen-producing Primary Bovine Granulosa Cells

Культура ткани модель эстроген производителей первичного говядину гранулезы ячейки

Ovarian granulosa cells (GC) are the major source of estradiol synthesis. Induced by the preovulatory luteinizing hormone (LH) surge, cells of the theca ...