Name: global level quantification of histone post-translational modifications in a 3d cell culture model of hepatic tissue
Uploaded: 2022-05-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Global Level Quantification of Histone Post-Translational Modifications in a 3D Cell Culture Model of Hepatic Tissue at JoVE.com

El laboratorio sidoli agradece a la Leukemia Research Foundation (Hollis Brownstein New Investigator Research Grant), AFAR (Sagol Network GerOmics award), Deerfield (Xseed award), Relay Therapeutics, Merck y la Oficina del Director de los NIH (1S10OD030286-01).

1. Preparación de tampones y reactivos
<ol><li>Medios de crecimiento celular (para células HepG2/C3A): Agregue suero fetal bovino (FBS) (10% v/v), aminoácidos no esenciales (1% v/v), suplemento de L-glutamina (1% v/v) y penicilina/estreptomicina (0,5% v/v) al Medio de Águila Modificada de Dulbecco (DMEM, que contiene 4,5 g/L de glucosa). Los medios de crecimiento se almacenan a 4 °C durante un máximo de 2 semanas.</li>
	<li>Solución de butirato de sodio (NaBut) de 200 mM: Para preparar 10 ml, re...

El análisis de los PTM de histonas es fundamentalmente diferente de la tubería típica de análisis proteómico. La mayoría de los PTM de histonas todavía tienen funciones biológicas enigmáticas; como resultado, no se dispone de anotaciones como Gene Ontology o bases de datos de vías. Existen varios recursos que asocian las modificaciones de histonas con la enzima responsable de su catálisis o proteínas que contienen dominios que se unen a estos PTM (por ejemplo, HISTome36). Además, es p...

Desde finales delsiglo 19, los sistemas de cultivo celular se han utilizado como modelo para estudiar el crecimiento y desarrollo de las células fuera del cuerpo humano 1,2. Su uso también se ha extendido para estudiar cómo funcionan los tejidos y órganos tanto en contextos sanos como enfermos 1,3. Las células de suspensión (por ejemplo, células sanguíneas) crecen en placas de Petri o matraces sin problemas e indistintamente, ya que no se ensamblan en estructuras tridimensionales (3D) in vivo. Las células derivadas de órganos sólidos pueden crecer en sistemas de cultivo bidimensionales (2D) o 3D. En cultivo 2D, las células se cultivan en una monocapa que se adhiere a una superficie plana 2,4. Los sistemas de cultivo celular 2D se caracterizan por un crecimiento exponencial y un rápido tiempo de duplicación, típicamente de 24 h a unos pocos días5. Las células en los sistemas 3D crecen para formar intrincadas interacciones célula-célula modelando conglomerados similares a tejidos más de cerca, y se caracterizan por su capacidad para alcanzar un equilibrio dinámico donde su tiempo de duplicación puede alcanzar 1 mes o más5.
En este trabajo se presenta una metodología innovadora para cultivar esferoides 3D en sistemas de cultivo celular rotativo que simulan la gravedad reducida6. Este es un derivado simplificado de un sistema de cultivo celular introducido por la NASA en la década de 19907. Este enfoque minimiza las fuerzas de cizallamiento, que ocurren en métodos existentes como los matraces giratorios, y aumenta la reproducibilidad de los esferoides6. Además, el biorreactor giratorio aumenta la difusión activa de nutrientes, minimizando la formación necrótica que se produce en sistemas como el cultivo de células de gota colgante donde el intercambio de medios no es práctico6. De esta manera, las células crecen en su mayoría sin ser molestadas, lo que permite la formación de características estructurales y fisiológicas asociadas con las células que crecen en el tejido. Los hepatocitos C3A (HepG2/C3A) cultivados de esta manera no solo tenían orgánulos ultraestructurales, sino que también producían cantidades de ATP, adenilato quinasa, urea y colesterol comparables a los niveles observados in vivo 1,2. Además, las células cultivadas en sistemas de cultivo celular 2D vs.3D exhiben diferentes patrones de expresión génica8. El análisis de la expresión génica de los hepatocitos C3A cultivados como esferoides 3D mostró que estas células expresaban una amplia gama de proteínas específicas del hígado, así como genes involucrados en vías clave que regulan la función hepática8. Publicaciones anteriores demostraron las diferencias entre proteomas de células de crecimiento exponencial en cultivo 2D vs. células en equilibrio dinámico en cultivos esferoides 3D5. Estas diferencias incluyen el metabolismo celular, que a su vez afecta la estructura, función y fisiología de la célula5. El proteoma de las células cultivadas en cultivo 2D estaba más enriquecido en proteínas implicadas en la replicación celular, mientras que el proteoma de los esferoides 3D estaba más enriquecido en la funcionalidad hepática5.
La tasa de replicación más lenta de las células cultivadas como esferoides 3D modela con mayor precisión fenómenos específicos asociados con el estado y las modificaciones de la cromatina (por ejemplo, recorte de histonas9). El recorte de histonas es una modificación post-traduccional de histonas (PTM) irreversible que causa la escisión proteolítica de parte de la cola N-terminal de la histona. Si bien su función biológica aún está en discusión 10,11,12,13, está claro que su presencia en células primarias y tejido hepático está modelada por células HepG2/C3A cultivadas como esferoides, pero no como células planas 9. Esto es crítico, ya que el estado de la cromatina y las modificaciones regulan la lectura del ADN principalmente modulando la accesibilidad a los genes y, por lo tanto, su expresión14. Los PTM de histonas influyen directamente en el estado de la cromatina al afectar la carga neta de los nucleosomas donde se ensamblan las histonas, o indirectamente al reclutar escritores, lectores y borradores de cromatina14. Cientos de PTM de histonas han sido identificados hasta la fecha15, reforzando la hipótesis de que la cromatina alberga un "código de histonas" utilizado por la célula para interpretar el ADN16. Sin embargo, la identificación de una miríada de combinaciones de PTM15, y el descubrimiento de que las combinaciones de PTM de histonas con frecuencia tienen funciones biológicas diferentes de las PTM presentes de forma aislada (por ejemplo, Fischle, et al.17), pone de relieve que se requiere más trabajo para descifrar el "código de histonas".
Actualmente, el análisis de histona PTM se basa en técnicas que utilizan anticuerpos (por ejemplo, western blots, inmunofluorescencia o inmunoprecipitación de cromatina seguida de secuenciación [ChIP-seq]) o espectrometría de masas (MS). Las técnicas basadas en anticuerpos tienen una alta sensibilidad y pueden proporcionar información detallada sobre la localización de las marcas de histonas en todo el genoma, pero con frecuencia son limitadas en el estudio de PTM raros o PTM presentes en combinaciones 18,19,20. La EM es más adecuada para la identificación y cuantificación imparcial y de alto rendimiento de modificaciones de proteínas únicas y coexistentes, en particular proteínas histonas 18,19,20. Por estas razones, este y varios otros laboratorios han optimizado la tubería de EM para el análisis de péptidos de histonas (EM de abajo hacia arriba), colas de histonas intactas (EM de medio hacia abajo) y proteínas de histonas de longitud completa (EM de arriba hacia abajo)21,22,23.
A continuación se detalla un flujo de trabajo para cultivar esferoides HepG2 / C3A y prepararlos para el análisis de péptidos de histonas (EM de abajo hacia arriba) a través de cromatografía de nanolíquidos, junto con espectrometría de masas en tándem (nLC-MS / MS). Se cultivó un cultivo celular 2D y las células se cosecharon y se transfirieron a un biorreactor donde comenzarían a formar esferoides (Figura 1). Después de 18 días en cultivo, los esferoides se trataron con butirato de sodio o succinato de sodio para aumentar las abundancias relativas de acetilación y succinilación de histonas. En particular, los cultivos 3D se pueden tratar con compuestos genotóxicos tan bien como sus equivalentes de cultivo plano; de hecho, publicaciones recientes destacan que la respuesta toxicológica de las células en cultivo 3D es más similar a las de los tejidos primarios que a las del cultivo plano 2D24,25. Las células se recogieron en puntos de tiempo específicos y se realizó el aislamiento nuclear. Luego, las histonas fueron extraídas y derivatizadas con anhídrido propiónico antes y después de la digestión de tripsina de acuerdo con un protocolo desarrollado por primera vez por Garcia et al.26. Este procedimiento genera péptidos de un tamaño adecuado para la separación en línea con cromatografía de fase inversa (C18) y la detección con EM. Finalmente, se identificaron y cuantificaron los péptidos de histonas, y los datos generados se representaron de múltiples maneras para una interpretación biológica más completa.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5-20 &#181;L pipet tips</td>
			<td>BRAND</td>
			<td>13-889-172 (Fisher Scientific)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>2239480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L multi-channel pipette</td>
			<td>BRAND</td>
			<td>BR7059000 (Millipore Sigma)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>Henke Sass Wolf</td>
			<td>14-817-31 (Fisher Scientific)</td>
			<td>Luer lock tip, graduated to 12 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10, 20, 200, and 1000 &#181;L single-channel pipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>14-285-904 (Fisher Scientific)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L pipet tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>30389164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 G syringe needle</td>
			<td>Air-Tite</td>
			<td>14-817-100 (Fisher Scientific)</td>
			<td>3&#34; length, 0.05&#34; diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L multi-channel pipette</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-200 &#181;L pipet tips</td>
			<td>BRAND</td>
			<td>Z740118 (Millipore Sigma)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well ultra-low attachment microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>07-200-602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2&#160; U-shaped cell culture flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>461464U</td>
			<td>Untreated, with vent cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well skirted plate</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-96-FS-C (Corning)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A949-1</td>
			<td>Acetone should be used cold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate (NH4HCO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6141-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC423300250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture grade water</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-055-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClinoReactor</td>
			<td>CelVivo</td>
			<td>10004-12</td>
			<td>Bioreactor for 3D cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClinoStar</td>
			<td>CelVivo</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Clinostat CO2 incubator for 3D cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control unit</td>
			<td>CelVivo</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Tablet for ClinoStar settings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>17-205-CV</td>
			<td>1X solution with 4.5 g/L glucose and sodium pyruvate, without L-glutamine and phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fume hood</td>
			<td>Mott</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Model 7121000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-8B</td>
			<td>9&#34;, cotton-plugged, borosilicate glass, non-sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutagro supplement</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-015-CI</td>
			<td>200 mM L-ananyl-L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-022-CV</td>
			<td>1X solution without calcium, magnesium, and phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC grade acetonitrile</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A955-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC grade water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A481-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM non-essential amino acids</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-025-CI</td>
			<td>100X solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oasis HLB resin</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186007549</td>
			<td>Hydrophilic-Lipophilic-Balanced (HLB) Resin with 30&#181;m particle size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>IQLAAEGAAPFADBMBHQ</td>
			<td>High resolution mass spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oro-Flex I polypropylene filter plate</td>
			<td>Orochem</td>
			<td>OF1100</td>
			<td>96-well polypropylene filter plate w/ 10 &#181;M PE frit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td>100X solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH paper</td>
			<td>Hydrion</td>
			<td>Z111848 (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>0-13 pH test paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette gun</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z666467 (Millipore Sigma)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymicro capillary</td>
			<td>Molex</td>
			<td>50-110-7740 (Fisher Scientific)</td>
			<td>Flexible fused silica capillary tubing with polymide coating, 75 &#181;M ID x 363 &#181;M OD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene 10 mL serological pipets, sterile</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1367549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propionic anhydride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>240311-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75-217-420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reprosil-Pur resin</td>
			<td>MSWIL</td>
			<td>R13.AQ.0003</td>
			<td>120 &#197; pore size, C18-AQ phase, 3 &#181;M bead size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td>Clay Adams</td>
			<td>25477 (American Laboratory Trading)</td>
			<td>Nutator Mixer 1105</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing grade modified trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium butyrate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A11079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium succinate dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>14160-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac vacuum concentrator (1.5 mL microcentrifuge tubes)</td>
			<td>Savant</td>
			<td>20249 (American Laboratory Trading)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac vacuum concentrator (96-well)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15308325</td>
			<td>Savant SPD1010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile hood</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1375</td>
			<td>Class II, Type A2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid (H2SO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-004-375</td>
			<td>Baker Analyzed ACS reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-culture treated 100 mm x 20 mm dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid (TCA)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AC421451000</td>
			<td>Resuspend 100% w/v in HPLC grade water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI28904</td>
			<td>Sequencing grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum manifold 96-well</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAVM0960R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z258415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FSGPD10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide bore pipet tips 1000 &#181;L</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>14-222-703 (Fisher Scientific)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide bore pipet tips 200 &#181;L</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>14-222-730 (Fisher Scientific)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

global level quantification of histone post-translational modifications in a 3d cell culture model of hepatic tissue

Los cultivos planos de células de mamíferos son un enfoque in vitro ampliamente utilizado para comprender la fisiología celular, pero este sistema está limitado en el modelado de tejidos sólidos debido a la replicación celular anormalmente rápida. Esto es particularmente desafiante cuando se modela la cromatina madura, ya que las células de replicación rápida están frecuentemente involucradas en la replicación del ADN y tienen una población poliploide heterogénea. A continuación se presenta un flujo de trabajo para modelar, tratar y analizar modificaciones de cromatina inactivas utilizando un sistema de cultivo celular tridimensional (3D). Usando este protocolo, las líneas celulares de carcinoma hepatocelular se cultivan como esferoides 3D reproducibles en una incubadora que proporciona difusión activa de nutrientes y bajas fuerzas de cizallamiento. El tratamiento con butirato de sodio y succinato de sodio indujo un aumento en la acetilación y succinilación de histonas, respectivamente. Los aumentos en los niveles de acetilación y succinilación de histonas se asocian con un estado de cromatina más abierto. Luego se recolectan esferoides para el aislamiento de núcleos celulares, de los cuales se extraen proteínas histonas para el análisis de sus modificaciones post-traduccionales. El análisis de histonas se realiza a través de cromatografía líquida junto con espectrometría de masas en línea, seguida de una tubería computacional interna. Finalmente, se muestran ejemplos de representación de datos para investigar la frecuencia y ocurrencia de marcas de histonas combinatorias.

En este protocolo, los esferoides HepG2/C3A fueron tratados con NaBut de 20 mM y NaSuc de 10 mM, los cuales afectaron los niveles globales de PTM de histonas (Figura 3A). A continuación, se identificaron y cuantificaron los PTM de histonas a nivel de residuo único mediante la adquisición de EM/EM (Figura 3B).
Cuando las muestras se ejecutan en réplicas, se puede realizar un análisis estadístico para evaluar el enriqueci...

Watch this Scientific Journal Video about Global Level Quantification of Histone Post-Translational Modifications in a 3D Cell Culture Model of Hepatic Tissue at JoVE.com

Global Level Quantification of Histone Post-Translational Modifications in a 3D Cell Culture Model of Hepatic Tissue

Este protocolo describe cómo se puede utilizar un sistema de cultivo celular tridimensional para modelar, tratar y analizar modificaciones de cromatina en un estado casi fisiológico.

Cuantificación a nivel global de modificaciones post-traduccionales de histonas en un modelo de cultivo celular 3D de tejido hepático

Flat cultures of mammalian cells are a widely used in vitro approach for understanding cell physiology, but this system is limited in modeling solid ...

Se ha demostrado que la dinámica global de la cromatina es un mediador importante de varios estados de enfermedad, como el cáncer y el envejecimiento. Nuestro protocolo proporciona un modelo fisiológicamente relevante para estudiar este proceso. El análisis de laboratorio estándar de modificaciones post-traduccionales de histonas o PTMS generalmente se limita a sondear un solo PTM a la vez utilizando ensayos basados en anticuerpos.El análisis de espectrometría de masas por cromatografía líquida de histonas PTMS nos permite medir la abundancia de cientos de PTMS en un solo experimento. Demostrando el procedimiento estarán Stephanie Stransky, Ronald Cutler y Julie Kim, un postdoctorado, estudiante de posgrado y técnico de investigación, respectivamente, del laboratorio. Primero, utilizando medios de crecimiento estándar, haga crecer las células como una monocapa hasta que sean 80% confluentes.Luego lave las células con HBSS. Añadir cinco mililitros de tripsina-EDTA al 0,05% diluida en HBSS. Incubar las células durante cinco minutos a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono.Use un microscopio para verificar el desprendimiento celular. Después de contar las células, diluya la suspensión celular con medios de crecimiento frescos. Agregue 0.5 mililitros de medios de crecimiento para equilibrar una placa inferior redonda de 24 pocillos de fijación ultra baja con múltiples micropocillos en cada uno.Luego centrifugue las placas a 3000 x g para eliminar las burbujas de aire de la superficie de la placa. Ahora transfiera la suspensión celular previamente hecha a la placa de 24 pocillos y la centrífuga durante tres minutos a 120 x g. Revise las células en la placa de 24 pocillos y luego incube las placas a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono durante 24 horas para la formación de esferoides.Mientras tanto, para equilibrar el biorreactor, agregue 25 mililitros de agua estéril a la cámara de humedad y nueve mililitros de medios de crecimiento a la cámara celular. Incubar el biorreactor en una incubadora de clinostat giratoria durante 24 horas a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono. Separe los esferoides de la placa de 24 pocillos de fijación ultra baja mediante pipeteos suaves con puntas de orificio de un mililitro de ancho y transfiéralos a un plato de cultivo de tejidos.Para seleccionar suficientes formas de esferoides, verifique la calidad de los esferoides bajo un microscopio. Los esferoides de buena calidad tienen un tamaño, compacidad y redondez uniformes. Llene el biorreactor equilibrado con cinco mililitros de medios de crecimiento frescos y transfiera los esferoides a él.Luego llene el biorreactor completamente con medios de crecimiento frescos y coloque el biorreactor en la incubadora de clinostat a 10 a 11 RPM. Cada dos o tres días, intercambie medios de crecimiento reemplazando 10 mililitros de medios antiguos con medios frescos. A medida que estos esferoides aumentan en tamaño y número, aumente la velocidad de rotación de la incubadora.Después de obtener el pellet esferoide, agregue cinco volúmenes de ácido sulfúrico molar 0.2 frío al pellet y pipetee hacia arriba y hacia abajo para interrumpir el pellet y liberar histonas. Una vez que se obtiene el sobrenadante después de la centrifugación, agregue ácido tricloroacético concentrado en frío, de modo que la concentración final se convierta en 25 a 30% volumen por volumen. Y mezclarlo invirtiendo el tubo un par de veces y centrifugando como se describe en el manuscrito.Después de desechar el sobrenadante, usando una pipeta de pasto de vidrio, lave el pellet y las paredes del tubo con aproximadamente 500 microlitros de acetona fría y ácido clorhídrico al 0.1%, y luego centrifugue a 3, 400 x g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Luego voltee el tubo para desechar el sobrenadante. Usando una pipeta de pasto de vidrio, agregue 500 microlitros de acetona 100% fría para lavar el pellet y la centrífuga como se demostró anteriormente.Después de desechar el sobrenadante, retire completamente la acetona pipeteando con cuidado y deje que la muestra se seque con una tapa abierta durante unos 20 minutos. Resusped el pellet en 20 microlitros de 15 a 20% de acetonitrilo en un bicarbonato de amonio 100 milimolar de pH 8. Después del vórtice, gire hacia abajo la suspensión a 1000 x g durante 30 segundos.Para ocho o más muestras, transfiera cada muestra re suspendida a una placa de 96 pocillos. Luego, en una campana, agregue dos microlitros de anhídrido propiónico y mezcle pipeteando cinco veces. Agregue rápidamente 10 microlitros de hidróxido de amonio y mezcle mediante pipeteo cinco veces.Mezcle la resina HLB en una placa de agitación magnética. Luego agregue 70 microlitros de la suspensión HLB a cada pozo de una placa de filtro de 96 pocillos en una placa de recolección de 96 pocillos. Después de desechar el flujo, lave la resina con 100 microlitros de ácido trifluoroacético al 0,1%.Después de resuspender cada muestra en 100 microlitros de ácido trifluoroacético al 0,1%, cargue cada muestra en cada pozo y evite salpicaduras utilizando un vacío. Después de desechar el flujo, lave las muestras con 100 microlitros de ácido trifluoroacético al 0,1% y coloque la placa de filtro en una nueva placa de recolección. A continuación, agregue 60 microlitros de 60% de acetonitrilo en ácido trifluoroacético al 0.1% a cada pozo y evite salpicaduras usando vacío.Recoge el flujo y sécalo a gran velocidad. Cargue la placa de recolección seca en el HPLC y ejecute el método LC/MS/MS como se describe en el manuscrito. En este estudio, se observó la abundancia relativa de modificaciones post-traduccionales de histonas comunes en hepatocitos C3A cultivados como esferoides tridimensionales.También se pudieron observar modificaciones post-traduccionales en un solo residuo en péptidos generados a partir de proteínas histonas. El tratamiento de los esferoides con butirato de sodio aumentó la abundancia relativa de acetilación de histonas, mientras que el tratamiento con succinato de sodio mejoró la succinilación de residuos de histonas. El método también demostró el patrón de distribución de la acetilación de histonas después del tratamiento con butirato de sodio y el de la succinilación de histonas después del tratamiento con succinato de sodio.El resultado también mostró patrones comunes de diferentes modificaciones de histonas. Los tratamientos con butirato de sodio mejoraron significativamente la acetilación del residuo de lisina 14 en un péptido generado a partir de la proteína histona H3, solo cuando su noveno residuo de lisina tenía dos grupos metilo, pero no uno o tres grupos metilo. También se calcularon las abundancias relativas de modificaciones individuales y varias combinaciones de modificaciones post-traduccionales en el péptido derivado de H3.También se observaron patrones combinatorios de modificaciones post-traduccionales después del tratamiento con butirato de sodio en un péptido generado a partir de la proteína histona H4. Aquí también, el tratamiento con butirato de sodio resultó en un aumento significativo de la acetilación. Se debe prestar especial atención a mantener los esferoides en el banco lo menos posible y en un paso de desalinización para evitar el derrame de muestras. Este flujo de trabajo se puede utilizar para explorar la cromatina en tejidos sólidos utilizando un modelo más fisiológico que los cultivos de células planas de replicación rápida.

Research

JoVE Journal

Biology

Electrospinning Fibrous Polymer Scaffolds for Tissue Engineering and Cell Culture

Electrospinning andamios fibroso polímero para ingeniería de tejidos y cultivos celulares

As the field of tissue engineering evolves, there is a tremendous demand to produce more suitable materials and processing techniques in order to address ...

Investigación

Biología

Detection of Post-translational Modifications on Native Intact Nucleosomes by ELISA

La detección de modificaciones post-traduccionales de los nativos intactos nucleosomas por ELISA

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 ...

Detection of Histone Modifications in Plant Leaves

La detección de modificaciones de las histonas en hojas de las plantas

Chromatin structure is important for the regulation of gene expression in eukaryotes. In this process, chromatin remodeling, DNA methylation, and covalent ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Aislamiento y cultivo primario de células hepáticas de ratas

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Florecimiento extracción de proteínas de levadura y purificación para el Estudio de la función, las interacciones y modificaciones post-traduccionales

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Identificación de modificaciones post-traduccionales de la proteína vegetal Complejos

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Análisis de RNA Global Síntesis en el nivel de células individuales siguiente Hipoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Alta resolución Cuantificación de celulosa cristalina acumulación en<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Las raíces para monitorear la célula específica de tejido de pared Modificaciones

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis

Flujo de trabajo completo para el análisis de las histonas modificaciones post-traduccionales El uso de espectrometría de masas de abajo hacia arriba: A partir de la histona Extracción de Análisis de Datos

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone ...

A Tissue Culture Model of Estrogen-producing Primary Bovine Granulosa Cells

Un modelo de cultivo de tejidos de Granulosa bovino primario producción de estrógeno de las células

Ovarian granulosa cells (GC) are the major source of estradiol synthesis. Induced by the preovulatory luteinizing hormone (LH) surge, cells of the theca ...