Name: global level quantification of histone post-translational modifications in a 3d cell culture model of hepatic tissue
Uploaded: 2022-05-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Global Level Quantification of Histone Post-Translational Modifications in a 3D Cell Culture Model of Hepatic Tissue at JoVE.com

Sidoli-laboratoriet erkänner tacksamt Leukemia Research Foundation (Hollis Brownstein New Investigator Research Grant), AFAR (Sagol Network GerOmics Award), Deerfield (Xseed Award), Relay Therapeutics, Merck och NIH Office of the Director (1S10OD030286-01).

1. Beredning av buffertar och reagenser
<ol><li>Celltillväxtmedia (för HepG2/C3A-celler): Tillsätt fetalt bovint serum (FBS) (10% v/v), icke-essentiella aminosyror (1% v/v), L-glutamintillskott (1% v/v) och penicillin/streptomycin (0,5 % v/v) till Dulbeccos Modified Eagle's Medium (DMEM, innehållande 4,5 g/L glukos). Tillväxtmedier lagras vid 4 °C i högst 2 veckor.</li>
	<li>200 mM natriumbutyrat (NaBut) lösning: För att bereda 10 ml, återsuspendera 220,18 mg NaBut i 10 ml ddH2O. F...

Analysen av histon-PTM skiljer sig fundamentalt från den typiska proteomikanalyspipelinen. De flesta histon-PTM har fortfarande gåtfulla biologiska funktioner; Som ett resultat är anteckningar som genontologi eller pathway databaser inte tillgängliga. Det finns flera resurser som associerar histonmodifieringar med enzymet som är ansvarigt för deras katalys eller proteiner som innehåller domäner som binder dessa PTM (t.ex. HISTome36). Det är också möjligt att spekulera i kromatinets öve...

Sedan slutet av 1800-talet har cellodlingssystem använts som en modell för att studera tillväxt och utveckling av celler utanför människokroppen 1,2. Deras användning har också utvidgats till att studera hur vävnader och organ fungerar i både friska och sjuka sammanhang 1,3. Suspensionsceller (t.ex. blodceller) växer i petriskålar eller kolvar sömlöst och omväxlande eftersom de inte monteras i tredimensionella (3D) strukturer in vivo. Celler som härrör från fasta organ kan växa i antingen tvådimensionella (2D) eller 3D-odlingssystem. I 2D-odling odlas celler i ett monolager som fäster vid en plan yta 2,4. 2D-cellodlingssystem kännetecknas av exponentiell tillväxt och en snabb fördubblingstid, vanligtvis 24 timmar till några dagar5. Celler i 3D-system växer för att bilda invecklade cell-cellinteraktioner som modellerar vävnadsliknande konglomerat närmare, och de kännetecknas av deras förmåga att nå en dynamisk jämvikt där deras fördubblingstid kan nå 1 månad eller längre5.
Presenteras i denna uppsats är en innovativ metod för att odla 3D-sfäroider i roterande cellodlingssystem som simulerar minskad gravitation6. Detta är ett förenklat derivat av ett cellodlingssystem som introducerades av NASA på 1990-talet7. Detta tillvägagångssätt minimerar skjuvkrafterna, som förekommer i befintliga metoder som spinnkolvar, och ökar sfäroidreproducerbarheten6. Dessutom ökar den roterande bioreaktorn aktiv näringsdiffusion, vilket minimerar nekrotisk bildning som uppstår i system som hängande droppcellkultur där medieutbytet är opraktiskt6. På detta sätt växer cellerna mestadels ostörda, vilket möjliggör bildandet av strukturella och fysiologiska egenskaper associerade med celler som växer i vävnad. C3A-hepatocyter (HepG2 / C3A) odlade på detta sätt hade inte bara ultrastrukturella organeller utan producerade också mängder ATP, adenylatkinas, urea och kolesterol jämförbara med nivåer som observerats in vivo 1,2. Dessutom uppvisar celler som odlas i 2D vs.3D cellodlingssystem olika genuttrycksmönster8. Genuttrycksanalys av C3A-hepatocyter odlade som 3D-sfäroider visade att dessa celler uttryckte ett brett spektrum av leverspecifika proteiner, liksom gener som är involverade i viktiga vägar som reglerar leverfunktionen8. Tidigare publikationer visade skillnaderna mellan proteom hos exponentiellt växande celler i 2D-odling jämfört med celler vid dynamisk jämvikt i 3D-sfäroidkulturer5. Dessa skillnader inkluderar cellulär metabolism, vilket i sin tur påverkar cellens struktur, funktion och fysiologi5. Proteomet hos celler som odlades i 2D-odling var mer berikat i proteiner som var involverade i cellreplikation, medan proteomet av 3D-sfäroider var mer berikat ileverfunktionalitet 5.
Den långsammare replikationshastigheten hos celler som odlas som 3D-sfäroider modellerar mer exakt specifika fenomen associerade med kromatintillstånd och modifieringar (t.ex. histonklippning9). Histonklippning är en irreversibel histon post-translationell modifiering (PTM) som orsakar proteolytisk klyvning av en del av histonens N-terminala svans. Medan dess biologiska funktion fortfarande diskuteras 10,11,12,13, är det uppenbart att dess närvaro i primära celler och levervävnad modelleras av HepG2 / C3A-celler odlade som sfäroider, men inte som platta celler 9. Detta är kritiskt, eftersom kromatintillstånd och modifieringar reglerar DNA-avläsning mestadels genom att modulera tillgängligheten till gener och därmed deras uttryck14. Histon-PTM påverkar antingen kromatintillståndet direkt genom att påverka nettoladdningen av nukleosomerna där histoner monteras, eller indirekt genom att rekrytera kromatinförfattare, läsare och suddgummin14. Hundratals histon-PTM har hittills identifierats15, vilket förstärker hypotesen att kromatin är värd för en "histonkod" som används av cellen för att tolka DNA16. Identifieringen av en myriad av PTM-kombinationer15, och upptäckten att kombinationer av histon-PTM ofta har olika biologiska funktioner från PTM som finns isolerat (t.ex. Fischle, et al.17), belyser dock att mer arbete krävs för att dekryptera "histonkoden".
För närvarande är histon PTM-analys antingen baserad på tekniker som använder antikroppar (t.ex. western blots, immunofluorescens eller kromatinimmunutfällning följt av sekvensering [ChIP-seq]) eller masspektrometri (MS). Antikroppsbaserade tekniker har hög känslighet och kan ge detaljerad information om genomomfattande lokalisering av histonmärken men är ofta begränsade när det gäller att studera sällsynta PTM eller PTM som finns i kombinationer 18,19,20. MS är mer lämpad för hög genomströmning och opartisk identifiering och kvantifiering av enskilda och samexisterande proteinmodifieringar, särskilt histonproteiner 18,19,20. Av dessa skäl har detta och flera andra laboratorier optimerat MS-pipelinen för analys av histonpeptider (bottom-up MS), intakta histonsvansar (mellanliggande MS) och histonproteiner i full längd (top-down MS)21,22,23.
Nedan beskrivs ett arbetsflöde för odling av HepG2/C3A-sfäroider och förberedelse av dem för histonpeptidanalys (bottom-up MS) via nanovätskekromatografi, kopplad online med tandemmasspektrometri (nLC-MS/MS). En 2D-cellodling odlades och cellerna skördades och överfördes till en bioreaktor där de skulle börja bilda sfäroider (Figur 1). Efter 18 dagar i odling behandlades sfäroider med natriumsufyrat eller natriumsuccinat för att öka de relativa överflöden av histonacetylering och succinylering. I synnerhet kan 3D-kulturer behandlas med genotoxiska föreningar lika bra som deras platta kulturekvivalenter; Faktum är att de senaste publikationerna belyser att det toxikologiska svaret hos celler i 3D-odling liknar primära vävnader än de i 2D-platt kultur24,25. Celler samlades sedan in vid angivna tidpunkter och kärnisolering utfördes. Därefter extraherades histoner och derivatiserades med propionsyraanhydrid före och efter trypsinsmältning enligt ett protokoll som först utvecklades av Garcia et al.26. Denna procedur genererar peptider av lämplig storlek för online-separation med omvänd faskromatografi (C18) och detektion med MS. Slutligen identifierades och kvantifierades histonpeptider, och de genererade data representerades på flera sätt för en mer fullständig biologisk tolkning.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5-20 &#181;L pipet tips</td>
			<td>BRAND</td>
			<td>13-889-172 (Fisher Scientific)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>2239480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L multi-channel pipette</td>
			<td>BRAND</td>
			<td>BR7059000 (Millipore Sigma)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>Henke Sass Wolf</td>
			<td>14-817-31 (Fisher Scientific)</td>
			<td>Luer lock tip, graduated to 12 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10, 20, 200, and 1000 &#181;L single-channel pipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>14-285-904 (Fisher Scientific)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L pipet tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>30389164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 G syringe needle</td>
			<td>Air-Tite</td>
			<td>14-817-100 (Fisher Scientific)</td>
			<td>3&#34; length, 0.05&#34; diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L multi-channel pipette</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-200 &#181;L pipet tips</td>
			<td>BRAND</td>
			<td>Z740118 (Millipore Sigma)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well ultra-low attachment microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>07-200-602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2&#160; U-shaped cell culture flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>461464U</td>
			<td>Untreated, with vent cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well skirted plate</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-96-FS-C (Corning)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A949-1</td>
			<td>Acetone should be used cold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate (NH4HCO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6141-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC423300250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture grade water</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-055-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClinoReactor</td>
			<td>CelVivo</td>
			<td>10004-12</td>
			<td>Bioreactor for 3D cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClinoStar</td>
			<td>CelVivo</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Clinostat CO2 incubator for 3D cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control unit</td>
			<td>CelVivo</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Tablet for ClinoStar settings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>17-205-CV</td>
			<td>1X solution with 4.5 g/L glucose and sodium pyruvate, without L-glutamine and phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fume hood</td>
			<td>Mott</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Model 7121000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-8B</td>
			<td>9&#34;, cotton-plugged, borosilicate glass, non-sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutagro supplement</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-015-CI</td>
			<td>200 mM L-ananyl-L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-022-CV</td>
			<td>1X solution without calcium, magnesium, and phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC grade acetonitrile</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A955-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC grade water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A481-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM non-essential amino acids</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-025-CI</td>
			<td>100X solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oasis HLB resin</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186007549</td>
			<td>Hydrophilic-Lipophilic-Balanced (HLB) Resin with 30&#181;m particle size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>IQLAAEGAAPFADBMBHQ</td>
			<td>High resolution mass spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oro-Flex I polypropylene filter plate</td>
			<td>Orochem</td>
			<td>OF1100</td>
			<td>96-well polypropylene filter plate w/ 10 &#181;M PE frit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td>100X solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH paper</td>
			<td>Hydrion</td>
			<td>Z111848 (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>0-13 pH test paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette gun</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z666467 (Millipore Sigma)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymicro capillary</td>
			<td>Molex</td>
			<td>50-110-7740 (Fisher Scientific)</td>
			<td>Flexible fused silica capillary tubing with polymide coating, 75 &#181;M ID x 363 &#181;M OD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene 10 mL serological pipets, sterile</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1367549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propionic anhydride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>240311-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75-217-420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reprosil-Pur resin</td>
			<td>MSWIL</td>
			<td>R13.AQ.0003</td>
			<td>120 &#197; pore size, C18-AQ phase, 3 &#181;M bead size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td>Clay Adams</td>
			<td>25477 (American Laboratory Trading)</td>
			<td>Nutator Mixer 1105</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing grade modified trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium butyrate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A11079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium succinate dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>14160-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac vacuum concentrator (1.5 mL microcentrifuge tubes)</td>
			<td>Savant</td>
			<td>20249 (American Laboratory Trading)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac vacuum concentrator (96-well)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15308325</td>
			<td>Savant SPD1010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile hood</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1375</td>
			<td>Class II, Type A2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid (H2SO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-004-375</td>
			<td>Baker Analyzed ACS reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-culture treated 100 mm x 20 mm dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid (TCA)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AC421451000</td>
			<td>Resuspend 100% w/v in HPLC grade water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI28904</td>
			<td>Sequencing grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum manifold 96-well</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAVM0960R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z258415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FSGPD10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide bore pipet tips 1000 &#181;L</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>14-222-703 (Fisher Scientific)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide bore pipet tips 200 &#181;L</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>14-222-730 (Fisher Scientific)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

global level quantification of histone post-translational modifications in a 3d cell culture model of hepatic tissue

Platta kulturer av däggdjursceller är en allmänt använd in vitro-metod för att förstå cellfysiologi, men detta system är begränsat vid modellering av fasta vävnader på grund av onaturligt snabb cellreplikation. Detta är särskilt utmanande vid modellering av moget kromatin, eftersom snabbreplikerande celler ofta är involverade i DNA-replikation och har en heterogen polyploid population. Nedan presenteras ett arbetsflöde för modellering, behandling och analys av vilande kromatinmodifieringar med hjälp av ett tredimensionellt (3D) cellodlingssystem. Med hjälp av detta protokoll odlas hepatocellulära karcinomcellinjer som reproducerbara 3D-sfäroider i en inkubator som ger aktiv näringsdiffusion och låga skjuvkrafter. Behandling med natriumsmörjat och natriumsuccinat inducerade en ökning av histonacetylering respektive bärnstensbehandling. Ökningar av nivåer av histonacetylering och succinylering är förknippade med ett mer öppet kromatintillstånd. Sfäroider samlas sedan in för isolering av cellkärnor, från vilka histonproteiner extraheras för analys av deras post-translationella modifieringar. Histonanalys utförs via vätskekromatografi kopplad online med tandemmasspektrometri, följt av en intern beräkningspipeline. Slutligen visas exempel på datarepresentation för att undersöka frekvensen och förekomsten av kombinatoriska histonmärken.

I detta protokoll behandlades HepG2/C3A-sfäroider med 20 mM NaBut och 10 mM NaSuc, som båda påverkade globala nivåer av histon-PTM (Figur 3A). Histon PTM identifierades sedan och kvantifierades på nivån av enstaka rester via MS/MS-förvärv (figur 3B).
När prover körs i replikat kan statistisk analys utföras för att bedöma veckförändringsanrikningen av en PTM mellan prover, liksom observationens reproducerbarhet....

Watch this Scientific Journal Video about Global Level Quantification of Histone Post-Translational Modifications in a 3D Cell Culture Model of Hepatic Tissue at JoVE.com

Global Level Quantification of Histone Post-Translational Modifications in a 3D Cell Culture Model of Hepatic Tissue

Detta protokoll beskriver hur ett tredimensionellt cellodlingssystem kan användas för att modellera, behandla och analysera kromatinmodifieringar i ett nästan fysiologiskt tillstånd.

Global nivåkvantifiering av histon posttranslationella modifieringar i en 3D-cellodlingsmodell av levervävnad

Flat cultures of mammalian cells are a widely used in vitro approach for understanding cell physiology, but this system is limited in modeling solid ...

Global kromatindynamik har visat sig vara en viktig medlare av flera sjukdomstillstånd, såsom cancer och åldrande. Vårt protokoll ger en fysiologiskt relevant modell för att studera denna process. Standard laboratorieanalys av histon post-translationella modifieringar eller PTMS är vanligtvis begränsad till sondering för en enda PTM i taget med hjälp av antikroppsbaserade analyser.Vätskekromatografi masspektrometrianalys av histon PTMS gör det möjligt för oss att mäta överflödet av hundratals PTMS i ett enda experiment. Demonstrerar proceduren kommer stephanie Stransky, Ronald Cutler och Julie Kim, en postdoc, gradstudent respektive forskningsteknik från labbet. Först, med hjälp av standardtillväxtmedier, växer cellerna som ett monolager tills de är 80% sammanflytande.Tvätta sedan cellerna med HBSS. Tillsätt fem milliliter 0,05% trypsin-EDTA utspätt i HBSS. Inkubera cellerna i fem minuter vid 37 grader Celsius med 5% koldioxid.Använd ett mikroskop för att kontrollera cellavskiljning. Efter att ha räknat cellerna, späd cellsuspensionen med färska tillväxtmedier. Tillsätt 0,5 ml tillväxtmedia för att balansera en ultralåg fastsättning 24-brunns rund bottenplatta med flera mikrobrunnar i varje.Centrifugera sedan plattorna vid 3000 x g för att avlägsna luftbubblor från plattans yta. Överför nu den tidigare gjorda cellsuspensionen till 24-brunnsplattan och centrifugen i tre minuter vid 120 x g. Kontrollera cellerna i 24-brunnsplattan och inkubera sedan plattorna vid 37 grader Celsius med 5% koldioxid i 24 timmar för sfäroidbildning.Under tiden, för att balansera bioreaktorn, tillsätt 25 ml sterilt vatten till fuktighetskammaren och nio milliliter tillväxtmedier till cellkammaren. Inkubera bioreaktorn i en roterande klimatinkubator i 24 timmar vid 37 grader Celsius med 5% koldioxid. Lossa sfäroiderna från den ultralåga fästplattan med 24 brunnar genom att försiktigt pipettera med en milliliter breda borrspetsar och överför dem till en vävnadsodlingsskål.För att välja tillräckligt med former sfäroider, kontrollera kvaliteten på sfäroider under ett mikroskop. Sfäroider av god kvalitet har enhetlig storlek, kompaktitet och rundhet. Fyll den jämviktade bioreaktorn med fem milliliter färska tillväxtmedier och överför sfäroiderna till den.Fyll sedan bioreaktorn helt med färska tillväxtmedier och sätt bioreaktorn i klinostatinkubatorn vid 10 till 11 RPM. Varannan till var tredje dag, byt ut tillväxtmedier genom att ersätta 10 ml gamla medier med färska medier. När dessa sfäroider ökar i storlek och antal, öka inkubatorns rotationshastighet.Efter erhållande av sfäroidpelleten tillsätt fem volymer kall 0,2 molär svavelsyra till pelletsen och pipetten upp och ner för att störa pelletsen och släppa histoner. När supernatanten har erhållits efter centrifugering, tillsätt kall koncentrerad triklorättiksyra, så att den slutliga koncentrationen blir 25 till 30 volymprocent. Och blanda det genom att invertera röret några gånger och centrifug som beskrivs i manuskriptet.Efter att ha kasserat supernatanten, med hjälp av en glasbetespipett, tvätta pelleten och rörets väggar med cirka 500 mikroliter kall aceton och 0,1% saltsyra och centrifug sedan vid 3 400 x g i fem minuter vid fyra grader Celsius. Vänd sedan röret för att kasta supernatanten. Använd en glasbetespipett, tillsätt 500 mikroliter 100% kall aceton för att tvätta pellets och centrifug som visats tidigare.Efter att ha kasserat supernatanten, ta bort aceton helt genom pipettering försiktigt och låt provet torka med ett öppet lock i cirka 20 minuter. Resuspend pelletsen i 20 mikroliter av 15 till 20% acetonitril i en 100 millimolär ammoniumbikarbonat med pH 8. Efter virvel, snurra ner upphängningen vid 1000 x g i 30 sekunder.För åtta eller fler prover, överför varje suspenderat prov till en 96-brunnsplatta. Tillsätt sedan två mikroliter propionsyraanhydrid i en huva och blanda genom pipettering fem gånger. Tillsätt snabbt 10 mikroliter ammoniumhydroxid och blanda genom pipettering fem gånger.Blanda HLB-harts på en magnetisk omrörningsplatta. Tillsätt sedan 70 mikroliter av HLB-suspensionen till varje brunn på en 96-brunns filterplatta på en 96-brunns uppsamlingsplatta. Efter att ha kasserat flödet genom, tvätta hartset med 100 mikroliter 0,1% trifluorättiksyra.Efter att ha återanvänt varje prov i 100 mikroliter av 0,1% trifluorättiksyra, ladda varje prov i varje brunn och förhindra stänk med vakuum. Efter att ha kasserat genomflödet, tvätta proverna med 100 mikroliter 0,1% trifluorättiksyra och lägg filterplattan på en ny uppsamlingsplatta. Tillsätt sedan 60 mikroliter 60% acetonitril i 0,1% trifluorättiksyra till varje brunn och förhindra stänk med vakuum.Samla flödet genom och torka i ett hastighetsvakuum. Fyll i den torkade uppsamlingsplattan i HPLC och kör LC/MS/MS-metoden enligt beskrivningen i manuskriptet. I denna studie observerades det relativa överflödet av vanliga histonpostöversättningsmodifieringar i C3A-hepatocyter odlade som tredimensionella sfäroider.Post-translationella modifieringar kunde också observeras på en enda rest i peptider genererade från histonproteiner. Behandling av sfäroiderna med natriumsubyrat ökade den relativa överflödet av histonacetylering, medan det med natriumsuccinat förbättrade histonresternasuccinylering. Metoden visade också distributionsmönstret för histonacetylering efter natriumsyratbehandling och histonsuccinylering efter behandling med natriumsuccinat.Resultatet visade också gemensammaatoriska mönster av olika histonmodifieringar. Natriumbutyratbehandlingar förbättrade signifikant acetyleringen av lysinresten 14 på en peptid genererad från histonproteinet H3, endast när dess nionde lysinrest hade två metylgrupper, men inte en eller tre metylgrupper. De relativa överflöden av individuella modifieringar och olika kombinationer av post-translationella modifieringar i den H3-härledda peptiden beräknades också.Kombinatoriska mönster av post-translationella modifieringar efter natriumsuslatratbehandling observerades också i en peptid genererad från histonproteinet H4. Även här resulterade natriumsmöratbehandling i en signifikant ökning av acetyleringen. Kritisk uppmärksamhet bör läggas på att hålla sfäroiderna på bänken så lite som möjligt och i ett avsaltningssteg för att undvika provspill. Detta arbetsflöde kan användas för att utforska kromatin i fasta vävnader med hjälp av en mer fysiologisk modell än snabb replikering av platta cellkulturer.

Research

JoVE Journal

Biology

Electrospinning Fibrous Polymer Scaffolds for Tissue Engineering and Cell Culture

Electrospinning Fibrer Polymer Byggnadsställningar för tissue engineering och cellodling

As the field of tissue engineering evolves, there is a tremendous demand to produce more suitable materials and processing techniques in order to address ...

Detection of Post-translational Modifications on Native Intact Nucleosomes by ELISA

Upptäckt av post-translationella modifieringar på inhemska intakt nukleosomer med ELISA

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 ...

Detection of Histone Modifications in Plant Leaves

Upptäckt av Histon Ändringar i blad

Chromatin structure is important for the regulation of gene expression in eukaryotes. In this process, chromatin remodeling, DNA methylation, and covalent ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Isolering och Primär kultur av celler Rat Hepatiska

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Spirande jästprotein extraktion och rening för studien av funktion, interaktioner, och post-translationella modifieringar

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Identifiering av posttranslationella modifieringar av växtproteinkomplex

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Analys av global RNA syntes vid den inre cellnivå efter Hypoxi

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Högupplöst Kvantifiering av kristallin cellulosa Ackumulering i<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Roots att övervaka Vävnadsspecifik cellvägg Ändringar

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis

Komplett arbetsflöde för analys av Histon posttranslationella modifieringar med botten upp masspektrometri: Från Histon Extraction till dataanalys

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone ...

A Tissue Culture Model of Estrogen-producing Primary Bovine Granulosa Cells

En vävnadskultur modell av östrogen-producerande primära nötkreatur Granulosa celler

Ovarian granulosa cells (GC) are the major source of estradiol synthesis. Induced by the preovulatory luteinizing hormone (LH) surge, cells of the theca ...