Name: canine intestinal organoids in a dual-chamber permeable support system
Uploaded: 2022-03-02T13:00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Canine Intestinal Organoids in a Dual-Chamber Permeable Support System at JoVE.com

We willen onze dank uitspreken aan de medewerkers van het Veterinary Diagnostic Laboratory of Iowa State University, namelijk Haley Lambert, Emily Rahe, Rosalyn Branaman, Victoria Green en Jennifer Groeltz-Thrush, voor de tijdige verwerking van monsters. We willen ook Jodi Smith en Bethann Valentine bedanken voor het leveren van materiaal voor de permeabiliteitsexperimenten. We willen ook David Diaz-Reganon bedanken voor zijn hulp bij Figuur 9. Met uitzondering van figuur 6 zijn alle figuren in BioRender.com gemaakt. De auteurs willen de steun erkennen van de Faculty Startup, ISU VPR Miller Award, ISU VPR Miller Award en NSF SBIR subaward naar ISU # 1912948.

K. Allenspach is mede-oprichter van LifEngine Animal Health en 3D Health Solutions. Ze is consultant voor Ceva Animal Health, Bioiberica, LifeDiagnostics, Antech Diagnostics, Deerland Probiotics en Mars. J.P. Mochel is mede-oprichter van LifEngine Animal Health en 3D Health Solutions en fungeert als consultant voor Ceva Animal Health en Ethos Animal Health. Dit artikel weerspiegelt de standpunten van de auteurs en mag niet worden geïnterpreteerd als de goedkeuring, mening of het beleid van de Food and Drug Administration. Andere auteurs hebben geen belangenverstrengeling te melden.

Canine intestinale organoïde culturen in het permeabele ondersteuningsapparaat zijn een uniek concept dat traditionele geneesmiddeldoorlaatbaarheidstests40 verbindt met een nieuw in vitro hondenmodel41. Verschillende soorten canine intestinale organoïden kunnen worden gebruikt en geëvalueerd op basis van het doel van het experiment met minimale aanpassingen. Het testen van meerdere concentraties van het medicijn van belang in 3-4 putten per groep wordt aanbevolen. De concentraties kunnen gebaseerd zijn op de verwachte darmconcentratie van het geneesmiddel. Bovendien kan het gebruik van eerder onderzoek helpen bij het bepalen van geschikte tijdstippen voor de onderzoeksopzet. Passende documentatie van de onderzoeksopzet moet worden gemaakt om de repliceerbaarheid te vergroten en te helpen bij het oplossen van problemen.
Deze technologie heeft verschillende beperkingen vanwege de nieuwheid van de methode42, vooral vanwege het gebrek aan standaardisatie in experimenteel ontwerp en uitvoering van het protocol in laboratoria. Dit gebrek aan standaardisatie is erkend door andere groepen43, en de Canine 3D Organoid Monolayer Protocols zullen leiden tot interlaboratoriumreproduceerbaarheid en standaardisatie introduceren in dit systeem. Gestandaardiseerde benaderingen van gegevensanalyse verbeteren de repliceerbaarheid en kunnen de resultaten van voorlopige drugstests met behulp van de hondenorganoïden in het permeabele ondersteuningssysteem in verschillende laboratoria versterken. Het canine 3D organoïde model mist ook datasets die in vitro Papp-waarden van modelgeneesmiddelen vergelijken met hun bekende menselijke of canine in vivo intestinale absorptie, net als Caco-2-cellen 44,45,46. Zodra dergelijke gegevens zijn gegenereerd, kan dit canine organoïde model worden gebruikt om de darmdoorlaatbaarheid tijdens de ontwikkeling van geneesmiddelen te beoordelen.
Het is van cruciaal belang dat er bij het zaaien van de organoïden op het permeabele ondersteuningssysteem op wordt gelet op het zaaien van een voldoende hoge dichtheid van op de juiste manier gedissocieerde cellen. De TEER-waarden van het systeem zijn betrouwbaarder en reproduceerbaarder wanneer ze in strikte monolagen worden gekweekt. Langdurige kweek van de monolagen kan leiden tot een exponentiële toename van TEER-waarden die verder reiken dan de fysiologische waarden van de darm. H & E-secties van dergelijke 3D-structuren tonen vervolgens verschillende lagen cellen boven elkaar met veranderde structuren van enterocyten dichter bij het membraan.
Na succesvolle uitbreiding van de canine intestinale organoïde monolaag, kunnen de resultaten op dezelfde manier worden geanalyseerd als traditionele 2D-celtests door de schijnbare permeabiliteitscoëfficiënt (Papp) formule44 van een geneesmiddel te berekenen. DeP-appwaarde (zie Eq (2)) beschrijft de transportsnelheid over de cellulaire monolaag47.
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63612/63612eq02.jpg" style="margin: auto;"> (2)
De <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63612/63612eq03.jpg" style="margin: auto;"> is de beginhelling van de concentratie ten opzichte van de tijdcurve (bijvoorbeeld nmol/s). A is het gebied van de insert (cm2) en C0 is de beginconcentratie van het geneesmiddel of de verbinding in de donorkamer37. Betrouwbare herkenning van monolaagintegriteit is een cruciaal onderdeel van de permeabiliteitstest die standaardisatie vereist. Lichtmicroscopie en TEER-metingen worden aanbevolen om hondenorganoïden in een doorlaatbaar ondersteuningssysteem te beoordelen en de juiste timing van het experiment te helpen bepalen. Bovendien kunnen nul moleculaire permeabiliteitsmarkers (bijv. FITC-dextran, Lucifer yellow, PEG-400) worden gebruikt om de integriteit van organoïde monolagen functioneel te evalueren. Er moet op worden gelet of de geteste verbinding wordt aangetast door een transporteur. P-glycoproteïne (P-gp) wordt gebruikt als een veel voorkomend voorbeeld van een effluxpomp. Er moet een effluxverhouding worden gegenereerd (P-app, BL-AP / P-app, AP-BL) met vergelijking met een bekend P-gp-sondesubstraat.
Lichtmicroscopie (gewoon of verbeterd met fasecontrast) is een methode van onschatbare waarde om te controleren op de integriteit van de 2D- of 3D-monolaag en het filterinzetstuk bij het beoordelen van mogelijke cellulaire overgroei. Figuur 7 kan dienen als een gids voor het herkennen van gezonde intestinale intestinale organoïde celculturen bij honden. TEER-waarden zijn een belangrijke maat voor de vorming van intercellulaire juncties en differentiatie van de organoïde culturen in een intact darmepitheel. De intestinale organoïden van de hond differentiëren tot enterocyten en bokaalcellen (figuur 6). Deze slijmproducerende cellen maken de studie van geneesmiddel-slijminteracties mogelijk, wat moeilijk te bereiken is met behulp van traditionele 2D-celculturen48. De aanwezigheid van entero-endocriene cellen is eerder bevestigd in intestinale organoïden van honden door Chandra et al.33.
Verdere karakterisering van de canine organoïde monolagen afgeleid van jejunale, ileale en colonorganoïden met behulp van TEM wordt verstrekt. TEM-afbeeldingen tonen cellulaire microarchitectuur, inclusief tight junctions en microvilli-vorming, wat de complexiteit en bruikbaarheid van deze organoïde modellen in de translationele geneeskunde verder illustreert. Op basis van de experimentele resultaten waren de organoïde culturen op de doorlatende drager klaar voor experimenten tussen dag 11 en dag 13 na het zaaien (figuur 9). De TEER-waarden varieerden op dit moment tussen 1.500 en 2.500 Ω,cm2. De plateaufase van TEER-waarden duurt een zeer beperkt tijdsbestek waarin het experiment moet worden gestart voordat de TEER-waarden langzaam beginnen af te nemen. TEER-waarden kunnen ook een cruciaal onderdeel zijn van het weergeven van belangrijke experimentele resultaten, omdat sommige geneesmiddelen of hulpstoffen van geneesmiddelen kunnen interageren met de monolaag (bijv. tight junctions), wat een grote invloed kan hebben op teer-waarde-uitlezingen. Dit alleen al kan dienen als gegevens voor een experiment.
Canine intestinale organoïden in een celkweekapparaat met twee kamers kunnen worden toegepast op andere gebieden dan orale geneesmiddeldoorlaatbaarheid vanwege de unieke architectuur van de resulterende celmonolaag. Ze kunnen bijvoorbeeld worden gebruikt in microbiologisch onderzoek (bijvoorbeeld de impact van het veranderen van gi-microbiële flora), virale opnamestudies, geneesmiddel-geneesmiddelinteracties en mechanismen voor medicijntransport49. De donorkamer is meestal gevuld met het testgeneesmiddel of de verbinding van keuze en aliquots uit de ontvangstkamer worden op verschillende tijdstippen genomen. Deze aliquots kunnen worden geanalyseerd met behulp van hoogwaardige vloeistofchromatografie, massaspectrometrie, enzymgebonden immunosorbenttest of andere technieken om de hoeveelheid en snelheid te bepalen waarmee de opgeloste stof door de monolaag dringt.
Deze studies vereisen een intacte monolaag om de permeabiliteit van geneesmiddelen nauwkeurig te beoordelen. Dit vereist meestal groeiende monolagen die groter zijn dan die nodig zijn om rekening te houden met onbruikbare putten. Organoïde cel monolagen kunnen ook worden gebruikt om virale opname te meten, hetzij van de apicale of basale kant van een monolaag, met uitlezingen waaronder immunofluorescentie-assays- gebruikmakende antilichamen om de cellulaire opname van het virus te detecteren. Ten slotte kunnen meerdere geneesmiddelen (d.w.z. substraat en remmer) op de donorkamer worden aangebracht om op transporter gebaseerde geneesmiddel-geneesmiddelinteracties te identificeren.
Op basis van de huidige waarnemingen zullen deze methoden niet alleen toepasbaar zijn op hondenorganoïden in kweekinzetstukken, maar ook geschikt zijn voor andere veterinaire soorten en orgaansystemen, met kleine aanpassingen die nodig zijn om het beste bij de soort of het orgaanmodel van keuze te passen. Protocollen voor de intestinale organoïde groei van honden moesten worden aangepast op basis van de unieke eigenschappen van de cultuur. Het protocol kan dus worden aangepast aan een andere soort, maar vereist subtiele wijzigingen in het protocol. Modificaties kunnen beginnen met veranderingen in de dichtheid van het zaaien van cellen en zich uitbreiden tot veranderingen in de mediasamenstelling om de organoïden van belang goed te differentiëren.
De standaardisatie, gedetailleerde documentatie van experimentele procedures en consistente monitoring van de celmonolagen zijn cruciale praktijken die nodig zijn voor de doorlaatbare ondersteuningstests en zijn niet beperkt tot het hondensysteem. Deze mogelijke soorten of orgaanmodificaties zijn van cruciaal belang om te documenteren en te rapporteren voor verdere vooruitgang in het veld. Dit model heeft verschillende beperkingen, bijvoorbeeld de kostenvereisten, interlaboratoriumvariabiliteit en beperkte gegevens over het vermogen om intestinale absorptie in vivo te voorspellen. Honden bezitten in sommige gevallen andere medicijntransporters en metaboliserende enzymen dan mensen50.
Verder moet het organoïde systeem voor honden worden getest op een verscheidenheid aan andere apparaten met twee kamers van andere fabrikanten om de geschiktheid van een dergelijk model te bepalen (de geschiktheid van verschillende filtermembraansamenstellingen moet bijvoorbeeld worden bepaald). Een ander nadeel is dat het medicijndoorlaatbaarheidsexperiment van het manuscript minder beschrijvend is dan de vorige delen. Dit wordt veroorzaakt door een overdaad aan informatie op dit gebied. Het doel van dit deel van het manuscript was om deze methoden op een aanpasbare manier te beschrijven zonder de randen van de hoekstenen van deze experimenten te snijden. Meer gedetailleerde informatie over permeabiliteitsexperimenten is verzameld door Hubatsch et al.37. Bovendien kunnen permeabele inserts worden gebruikt in cocultuur-, celmigratie- en invasietestexperimenten4.
Kortom, de canine intestinale organoïden in kweekapparatuur met twee kamers hebben het potentieel om te worden gebruikt in een breed scala aan toepassingen, waaronder biomedische velden en translationele geneeskunde, om er maar een paar te noemen. De protocollen creëren verschillende strategieën om een experiment te plannen en de betrouwbaarheid van interlaboratoriumgegevens voor organoïde modellen op het gebied van biologie te bevorderen.

Permeabele ondersteuningssystemen worden meestal gebruikt om de schijnbare permeabiliteit van therapeutische kandidaat-geneesmiddelen door de intestinale epitheliale barrièrete bepalen 1,2. Ze kunnen ook worden gebruikt om cellulaire secretie3, celmigratie4 en geneesmiddeltoxiciteit5 te beoordelen. In vitro orale geneesmiddelpermeabiliteitstests zijn een belangrijke stap in het ontdekkings- en ontwikkelingsprocesvan geneesmiddelen 2, waarbij individuele kandidaat-geneesmiddelen worden getest in het vroege stadium van de R&D-levenscyclus van het geneesmiddel6. Het doorlatende ondersteuningssysteem is een celkweekapparaat met twee kamers dat bestaat uit een insert met een semiporeus membraan dat in een multiwellplaat is geplaatst. Dit systeem biedt directe toegang tot de apicale en basolaterale zijden van een cel-monolaag gekweekt in de insert7. De monolaag die in deze systemen wordt gebruikt, is meestal afgeleid van gastro-intestinale epitheelcellen (bijv. Humaan colorectaal adenocarcinoom Caco-2 cellijn)8. Celculturen groeien in een gepolariseerde toestand die de natuurlijke microarchitectuur van intestinale epitheelcellen nabootst, waardoor verdere cellulaire differentiatie, vergelijkbare microanatomie en functiemogelijk is 7. Details van de doorlatende steuninzet zijn te vinden in figuur 1. Het zaaien van de inserts met 2D-celculturen, traditioneel gebruikt voor het beoordelen van de darmdringingspermeabiliteit van geneesmiddelen, is relatief betaalbaar en gemakkelijk tekweken 9. Deze systemen vertonen verschillende belangrijke beperkingen, waaronder hun beperkte capaciteit om het darmmetabolisme van therapeutische kandidaat-geneesmiddelen te voorspellen10,11. Dit geldt voor alle mechanismen van medicijnabsorptie, of het nu passieve absorptie is door de tight junctions tussen epitheelcellen, actieve transepitheliale absorptie door efflux of opnametransporters (bijv. P-glycoproteïne, monocarboxylaattransporter 1) en geneesmiddelen die worden gemetaboliseerd door enterocyten.
Honden delen een gemeenschappelijke omgeving en dieet met mensen12. De darmanatomie en de samenstelling van het microbioom van honden lijken sterk op die van mensen13, die de afgelopen 36.000 jaar is toegeschreven aan domesticatie en gedeelde diëten14. Helaas kunnen deze overeenkomsten ook veel voorkomende oorzaken / triggers zijn voor de ontwikkeling van ziekten. Honden ontwikkelen vergelijkbare chronische morbiditeiten als mensen, zoals obesitas15, inflammatoire darmziekte16, colorectaal adenocarcinoom17, gastro-intestinale stromale tumor (GIST)18 en verschillende andere pathologieën geassocieerd met hun relatieve levensduur19. Dienovereenkomstig kunnen hondenorganoïden met succes worden gebruikt voor omgekeerd translationeel onderzoek naar deze chronische multifactoriële ziekten in de geest van het One Health Initiative20.
Caco-2-cellen zijn de meest gebruikte cellijnen voor orale absorptietests van geneesmiddelen21. Deze cellen worden momenteel beschouwd als het "gouden standaard" model voor in vitro intestinale permeabiliteitstests 2,22,23. De Caco-2 cellijn drukt efflux- en opnametransporters uit die in het menselijke darmkanaal worden aangetroffen, hoewel op verschillende expressieniveaus 24,25,26. Caco-2-cellen worden ook veel gebruikt als modellen om te bepalen of een medicijn een substraat of remmer is van intestinale effluxtransporters22,27. Hoewel de Caco-2-cellen van colonoorsprong zijn, bootsen ze een enterocytcel na. Helaas vertegenwoordigen Caco-2-cellen slechts één celtype uit de epitheellaag van de dunne darm9, die er niet in slaagt om de complexe samenstelling van het intestinale epitheelceltype nauwkeurig samen te vatten. Gobletcellen die zich bijvoorbeeld toeleggen op slijmproductie zijn afwezig in Caco-2-culturen, zodat slijm-geneesmiddelinteracties niet kunnen worden beoordeeld zonder cocultuur met andere cellijnen28. Bovendien brengen Caco-2-culturen geen enkele van de belangrijke nucleaire receptoren tot expressie die typisch in de darm aanwezig zijn, zoals pregnane X-receptor (PXR), steroïde X-receptor (SXR) en constitutieve androstaanreceptor (CAR)29. Bijgevolg slagen Caco-2-culturen er niet in om de inductie van medicijntransporters en enzymen door bepaalde geneesmiddelen die inductoren van deze receptoren zijn (bijv. rifampicine) te modelleren30.
De 3D intestinale organoïde technologie pakt enkele van deze beperkingen aan19. Organoïden zijn zelfgeassembleerde constructies afgeleid van volwassen stamcellen die kunnen worden vastgesteld uit weefselmonsters die zijn geoogst met behulp van micro-invasieve technieken20. Door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen worden gebruikt voor intestinale permeabiliteitsmodellen31,32. Canine organoids bieden een relevant alternatief voor menselijke organoïden omdat menselijk stamcelonderzoek wordt beperkt door ethische kwesties33. Bovendien bieden hondenorganoïden een in vitro systeem voor het onderzoeken van de permeabiliteit van hondengeneesmiddelen, metabolisme, actief transport en interacties tussen geneesmiddelen en geneesmiddelen. Om deze technologische kloof aan te pakken, is de consistente en betrouwbare groei van canine intestinale organoïden in een doorlatend ondersteuningssysteem beschreven34. Een permeabiliteitstest met canine intestinale organoïden kan mogelijk de intestinale permeabiliteit en het metabolisme van kleine geneesmiddelmoleculen voorspellen in vergelijking met momenteel gebruikte assays (Caco-2). Bevestiging van deze cruciale kenmerken leent dit nieuwe in vitro systeem voor toekomstig werk dat de potentiële impact van inductoren op intracellulair metabolisme en actief transport onderzoekt.
Canine organoïden zijn samengesteld uit alle celtypen die typisch aanwezig zijn in de epitheellaag van de darm. Vanuit een functioneel en microanatomisch beeld repliceren ze op betrouwbare wijze de omgeving van de epitheliale laag van de hondendarm19,35. Bovendien is de aanwezigheid van slijm, hondenspecifieke medicijntransporters en enzymen en de algehele cellulaire differentiatie in intestinale organoïden van honden vergelijkbaar met wat in vivo bij honden wordt gezien34. Organoïden kunnen dus worden geïsoleerd van zieke veterinaire patiënten en worden gebruikt om het effect van verschillende ziekteprocessen (bijv. Chronische darmontsteking) op de orale permeabiliteit van geneesmiddelen bij honden te modelleren19,36. Het canine intestinale organoïde systeem kan ook worden gebruikt in andere omgevingen dan experimenten met de permeabiliteit van geneesmiddelen. Deze 3D-structuren kunnen ook worden geïsoleerd van zieke patiënten zoals eerder beschreven door Chandra et al. voor inflammatoire darmaandoeningen, colorectaal adenocarcinoom en gastro-intestinale stromale tumor19.
Het Permeable Support Seeding Protocol beschrijft methoden voor het vaststellen van canine intestinale organoïde culturen in de inserts. Dit eerste protocol schetst methoden om gevestigde canine organoïde culturen te dissociëren die in de extracellulaire membraanmatrix zijn opgenomen. Verder wordt het voorcoaten van de inserts met collageen I en de extracellulaire membraanmatrix besproken in dit protocol. Het inbedden van hondenorganoïden in de doorlatende steuninzetstukken wordt ook in detail beschreven.
Het tweede protocol is het Monolayer Maintenance Protocol, dat algemeen onderhoud van honden 3D-organoïden in een insert omvat. De frequentie en volumes van de organoïde media die worden gebruikt om de cultuur te vernieuwen, en manieren om celkweekschade te voorkomen, worden gepresenteerd in dit tweede protocol, samen met experimentele methoden voor het beoordelen van de samenvloeiing van de epitheliale monolaag.
Ten slotte richt het Permeability Experimental Protocol zich op manieren om te bepalen of de intestinale 3D-organoïden van honden in een permeabiliteitstest klaar zijn voor experimenteel gebruik en de verificatiestappen die nodig zijn voordat een experiment wordt uitgevoerd. Deze sectie beschrijft ook de opzet en de succesvolle uitvoering van een permeabiliteitsexperiment, samen met de incubatie en bemonstering van therapeutische kandidaat-geneesmiddelen in de kamers van de monolaagcultuur. Het gebruik van het fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC-dextran) met lage permeabiliteit om de integriteit van de monolaag te bewaken, wordt ook besproken. Ten slotte wordt een in vitro evaluatiemethode beschreven voor het valideren van de resultaten na afloop van een experiment. Permeabiliteitsexperimenten zijn een extreem uitgebreid onderwerp en worden zeer goed samengevat door Hubatsch et al.37. De workflow van de protocollen is samengevat in figuur 2.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63612/63612fig01.jpg"> Figuur 1: Canine intestinale organoïden op een doorlatend ondersteuningssysteem. De doorlatende steuninzet is geplaatst in een put van een 24-well plaat. Het microporeuze membraan maakt het zaaien van gedissocieerde canine intestinale organoïden mogelijk, en deze cellen zullen uiteindelijk een organoïde 2D-monolaag vormen. Deze technologie biedt toegang tot zowel de AP- als de BL-zijde van de monolaag. Organoïde medium wordt geïntroduceerd in zowel de AP- als bl-kamers van de permeabele ondersteuning. De absorptie (AP→BL) en secretie (BL→AP) van het kandidaat-geneesmiddel worden geïllustreerd, evenals twee mogelijke vormen van drugstransport. Afkortingen: AP = apiical; BL = basolateraal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/63612fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63612/63612fig02.jpg"> Figuur 2: Workflow van canine organoid permeabele ondersteuningsprotocollen. De permeabele steuninzet is voorgecoat met een mengsel van de extracellulaire membraanmatrix en collageen I en gedurende 1 uur geïncubeerd. Tijdens het incubatieproces wordt de organoïde cultuur gedissocieerd. Individuele organoïde cellen worden in de insert gezaaid, medium in de basolaterale kamer wordt onmiddellijk na het zaaien toegevoegd, terwijl medium aan de apicale kamer wordt toegevoegd 24 uur nadat het zaaiproces is voltooid. Onderhoud en monitoring van de organoïden omvatten regelmatige mediumveranderingen, TEER-waardemetingen en lichtmicroscopie om de integriteit van de monolaag te evalueren. Vóór het experiment moeten de organoïden worden gedifferentieerd door ROCK-remmer en GSKiβ uit de media te verwijderen. De TEER-waarden worden gemeten op de dag van het experiment en de organoïde monolaag wordt via lichtmicroscopie geïnspecteerd op schade aan de cellen. Medium wordt vervolgens geruild voor een geschikte buffer en voorafgaand aan het experiment geïncubeerd. De FITC-dextran-test wordt gebruikt tijdens intestinale permeabiliteitsexperimenten39 als een marker van monolaagintegriteit. TEER-metingen worden na het experiment uitgevoerd en lichtmicroscopie valideert de resultaten na 24 uur. Afkortingen: TEER = transepitheliale elektrische weerstand; ROCK = rho-geassocieerd kinase; GSKiβ = glycogeensynthase kinase bèta; F = fluorescentie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/63612fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Organoid media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;ROCK inhibitor (Y-27632)</td>
			<td>EMD Millipore Corp.</td>
			<td>SCM 075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[Leu15]-Gastrin I human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9145-.5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-83-01</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>9094360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>glutamine substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>J848-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human R-Spondin-1</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>120-38-500UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine EGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-09-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Noggin</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>250-38-250UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Wnt-3a</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-20-10UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetyl-L-cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9165-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0636-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190 (P38 inhibitor)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7067-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemolecule CHIR99021 (GSK3&#946;)</td>
			<td>Reprocell</td>
			<td>04-0004-base</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMS (trimethoprim sulfate)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7883-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid, Glacial</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A38-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alpha-D(+)-Glucose, 99+%, anhydrous</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>170080010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, Rat Tail 3 mg/mL</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A10483-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-CM-Dextran</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>68059-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde (37%)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>F79P-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (1x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Matrix For Organoid Culture</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356255</td>
			<td>Extracellular Membrane Matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 97%</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 1x (Phosphate-Buffered Saline)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604-021</td>
			<td>Trypsin-like Protease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials and Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9&#34; Pasteur Pipets</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-678-6B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Transwell 6.5 mm Polyester Membrane Inserts Preloaded in 24-Well Culture Plates, Pore Size: 0.4 &#181;m, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3470</td>
			<td>Permeable Support</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell ERS (Probes)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MERSSTX01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell ERS-2 Voltohmmeter</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MERS00002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panasonic incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-170ML-PA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M Wrapping Film</td>
			<td>Bemis Company Inc</td>
			<td>PM996/EMD</td>
			<td>Flexible Laboratory Film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Plate 24 wells</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB012929</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

canine intestinal organoids in a dual-chamber permeable support system

Het permeabele ondersteuningssysteem wordt meestal gebruikt in combinatie met traditionele tweedimensionale (2D) cellijnen als een in vitro hulpmiddel voor het evalueren van de orale permeabiliteit van nieuwe therapeutische kandidaat-geneesmiddelen. Het gebruik van deze conventionele cellijnen heeft echter beperkingen, zoals veranderde expressie van tight junctions, gedeeltelijke celdifferentiatie en de afwezigheid van belangrijke nucleaire receptoren. Ondanks deze tekortkomingen zijn de Caco-2- en MDCK-modellen algemeen geaccepteerd en gevalideerd voor de voorspelling van menselijke in vivo orale permeabiliteit.
Honden zijn een relevant translationeel model voor biomedisch onderzoek vanwege hun overeenkomsten in gastro-intestinale anatomie en darmmicroflora met mensen. Dienovereenkomstig, en ter ondersteuning van de parallelle ontwikkeling van geneesmiddelen, is de uitwerking van een efficiënt en nauwkeurig in vitro hulpmiddel voor het voorspellen van in vivo permeabiliteitskenmerken van geneesmiddelen, zowel bij honden als bij mensen, zeer wenselijk. Een dergelijk hulpmiddel zou het canine intestinale organoïde systeem kunnen zijn, gekenmerkt door driedimensionale (3D), zelfgeassembleerde epitheelstructuren afgeleid van volwassen stamcellen.
Het (1) Permeable Support Seeding Protocol beschrijft de experimentele methoden voor het dissociëren en zaaien van hondenorganoïden in de inserts. Canine organoïde isolatie, cultuur en oogst zijn eerder beschreven in een afzonderlijke set protocollen in dit speciale nummer. Methoden voor algemeen onderhoud van de canine intestinale organoïde monolaag worden grondig besproken in het (2) Monolayer Maintenance Protocol. Daarnaast beschrijft dit protocol methoden om de structurele integriteit van de monolaag te beoordelen via transepitheliale elektrische weerstand (TEER) metingen en lichtmicroscopie. Ten slotte beschrijft het (3) Permeabiliteit Experimenteel Protocol de taken die direct aan een experiment voorafgaan, waaronder in vitro validatie van experimentele resultaten.
Over het algemeen overwint het canine organoïde model, gecombineerd met een dual-chamber celkweektechnologie, beperkingen die verband houden met 2D-experimentele modellen, waardoor de betrouwbaarheid van voorspellingen van de schijnbare orale permeabiliteit van therapeutische kandidaat-geneesmiddelen zowel bij de hond als bij de menselijke patiënt wordt verbeterd.

Standaard operationele procedures voor de kweek van hondenorganoïden werden eerder beschreven33, en het Canine Organoid Protocol is ook in detail besproken in dit speciale nummer38. Canine intestinale organoïden gekweekt op permeabele steunen werden gefixeerd en paraffine-ingebed om de microanatomie van de monolaag en de celpopulaties te onderzoeken. Het paraffine-inbeddingsproces werd eerder besproken door Gabriel et al.38. Routinematige kleuring (hematoxyline en eosine) is uitgevoerd en de Alcian Blue-kleuringstechniek werd gebruikt om bokaalcellen in de canine organoïde monolaag te detecteren (zie figuur 7).
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63612/63612fig07.jpg"> Figuur 7: Canine intestinale organoïde monolayer kleuring. Canine intestinale organoïden van colonoorsprong in de permeabele ondersteuning zijn paraffine-ingebed en gekleurd met H &E en AB. Representatieve beelden werden genomen met behulp van lichtmicroscopie bij 40x (A) en 60x (B) vergroting. H &E-kleuring onthult een kolomvormige epitheliale monolaag en de microvilli in het apicale deel van de cellen kan worden waargenomen bij 60x vergroting. AB-kleuring onthult verder de aanwezigheid van bokaalcellen (donkerblauw) in de canine intestinale organoïde monolaag. Schaalstaven = 20 μm (A), 50 μm (B). Afkortingen: H&E = hematoxyline en eosine; AB = Alcian Blauw. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/63612fig07large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
De organoïde cultuur op de permeabele steun moet gedurende 10 tot 14 dagen worden gekweekt om klaar te zijn voor een permeabiliteitsexperiment. Lichtmicroscopie wordt gebruikt in combinatie met TEER-waardemetingen om de gereedheid van de organoïde cultuur voor permeabiliteitstests van kandidaat-geneesmiddelen te bevestigen. Representatieve lichtmicroscopische beelden van verschillende canine intestinale organoïde monolagen van gezonde en zieke dieren zijn weergegeven in figuur 8.
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63612/63612fig08.jpg"> Figuur 8: Canine intestinal organoid monolayer microscopie. Beelden van groeiende monolagen zoals gezien onder lichtmicroscopie. Organoïde monolagen afgeleid van gezonde donoren worden vertegenwoordigd door jejunale enteroïde (10x; 40x) en colonoïde (20x; 40x) culturen. Organoïde monolagen van zieke donoren worden vertegenwoordigd door duodenale (5x; 10x) en ileale (5x; 10x) enteroïden afgeleid van een hond met de diagnose PLE. Beide PLE-organoïde culturen zijn voorbeelden van onjuiste celisolatie tijdens het zaaien van organoïden, en deze culturen konden niet worden gebruikt voor medicijndoorlaatbaarheidstests vanwege de aanwezigheid van 3D-organoïden. Voorbeelden van afwijkingen van de juiste monolaagvorming, zoals monolaagscheuren (5x), worden veroorzaakt door onzorgvuldige manipulatie van de biologische monsters. De langdurige kweek van organoïden (10x; 20x) wordt veroorzaakt door het lange onderhoud van de organoïden op het insert wanneer de organoïden beginnen te lijken op hun oorspronkelijke 3D-structuur. Ter vergelijking worden afbeeldingen van traditionele 2D-cellijnen op de permeabele dragers gepresenteerd die vaak worden gebruikt voor geneesmiddelendoorlaatbaarheidsstudies (MDCK-10x; 40x en Caco-2-10x; 20x). Afkortingen: PLE = eiwit-verliezende enteropathie; MDCK = Madin-Darby hondennier. Schaalstaven = 500 μm (5x), 200 μm (10x), 100 μm (20x), 50 μm (40x). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/63612fig08large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Organoïde monolagen werden ook gefixeerd in 3% Paraformaldehyde-3% Glutaaraldehyde in fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS). Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) werd gebruikt om de ultrastructuur van de organoïde cultuur op de doorlatende steunen te karakteriseren. Microanatomische structuren van microvilli en tight junctions zijn te zien in figuur 9.
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63612/63612fig09.jpg"> Figuur 9: TEM-beelden van gezonde intestinale organoïde monolagen bij honden. TEM werd gebruikt om de cellulaire microarchitectuur van jejunale (A), ileale (B) en colon (C) organoïde monolagen te onthullen. Het microporeuze membraan van het doorlatende steunelement is gemarkeerd met een gele pijl. De aanwezigheid van microvilli (blauwe pijl) en tight junctions (rode pijl) wordt in de beelden afgebakend. Afkorting: TEM = Transmissie elektronenmicroscopie. Schaalstaven = 5 μm (A), 2 μm (B, C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/63612fig09large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Zowel TEER-metingen als lichtmicroscopie moeten worden uitgevoerd om ervoor te zorgen dat het systeem klaar is voor permeabiliteitstests. De test is klaar voor gebruik wanneer TEER een stabiele toestand bereikt, terwijl lichtmicroscopie zal helpen om schade of overgroei van de organoïden uit te sluiten. Een samenvatting van typische TEER-metingen van vijf groepen bestaande uit jejunale enteroïden en colonoïden bij honden is weergegeven in figuur 6.
Tabel 1: Samenstelling van organoïde media en FAA. De volledige samenstelling van CMGF+, CMGF+ R/G en FAA zijn samengevat in deze tabel. Afkortingen: ROCK = rho-associated kinase; GSKiβ = glycogeensynthase kinase bèta; CMGF + R/G = Compleet medium met groeifactoren versterkt met ROCK-remmer en GSKiβ; CMGF+ = Compleet medium met groeifactoren maar zonder ROCK-remmer of GSKiβ; FAA = formaline-azijnzuur-alcohol; EFG =epidermale groeifactor. Deze tabel is aangepast van 38. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/Table%201%20(8).xlsx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>
Aanvullende tabel 1: Tabel voor het maken van aantekeningen op hondenorganoïde het permeabele ondersteuningssysteem. Afkortingen: TEER = transepitheliale elektrische weerstand; ROCK = rho-geassocieerd kinase; GSKiβ = glycogeensynthase kinase bèta; CMGF + R/G = Compleet medium met groeifactoren versterkt met ROCK-remmer en GSKiβ; CMGF+ = Compleet medium met groeifactoren maar zonder ROCK inhibitor of GSKiβ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/Supplementary%20Table%201%20(1).xlsx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Canine Intestinal Organoids in a Dual-Chamber Permeable Support System at JoVE.com

Canine Intestinal Organoids in a Dual-Chamber Permeable Support System

Hier presenteren we een protocol dat de cultuur van canine intestinale organoïden beschrijft in een tweekamerig, permeabel ondersteuningssysteem. Organoïde zaaien in de doorlatende steunen, het onderhoud van de monolaag en de daaropvolgende experimenten met de permeabiliteit van geneesmiddelen worden beschreven.

Canine intestinale organoïden in een tweekamer permeabel ondersteuningssysteem

The permeable support system is typically used in conjunction with traditional two-dimensional (2D) cell lines as an in vitro tool for evaluating the oral ...

The combination of canine organoid technology and a dual chamber permeable support system overcomes the limitations of experimental 2D cell lines traditionally used in biomedical research models.The technology can increase the reliability of predictions of the apparent oral permeability of therapeutic drug candidates both in canine and human patients.The system can be applied to other fields of biomedical research including microbiology research, viral uptake studies, drug-drug interactions, and drug transport mechanisms.The standardization, detailed documentation of experimental procedures and consistent monitoring of the cell monolayers are crucial practices needed for the permeable support assays.Place the extracellular membrane matrix on ice to begin thawing.Submerge it in ice to protect against rapid thawing and avoid solidification.Pre-chill a refrigerated centrifuge to 4

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

Ontwikkeling van een negatieve selecteerbare marker voor Entamoeba histolytica</em

Entamoeba histolytica is the causative agent of amebiasis and infects up to 10% of the world's population. The molecular techniques that have enabled the ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Kweken Microglia van de neonatale en volwassen centrale zenuwstelsel

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

De<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultuur en Pattern Recognition Receptor Stimulatie van de Muis Intestinal Organoids

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the ...

Implementation of a Permeable Membrane Insert-based Infection System to Study the Effects of Secreted Bacterial Toxins on Mammalian Host Cells

Implementatie van een permeabel membraan Insert-gebaseerde infectiesysteem: Effecten van uitgescheiden bacteriële toxinen op zoogdiergastheercellen Studie

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate ...

A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release

A Simple Fluorescence Assay voor het kwantificeren van Canine neutrofielen extracellulaire inklembeveiliging

Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although ...

Induction of Paralysis and Visual System Injury in Mice by T Cells Specific for Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4

Inductie van verlamming en visuele systeem schade in muizen door T cellen specifiek voor Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4

While it is recognized that aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells and antibodies participate in the pathogenesis of neuromyelitis optica (NMO), a human ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

Isoleren van lymfocyten van het immuunsysteem intestinale kleine muis

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In Vitro Canine neutrofiele extracellulaire Trap vorming: Dynamische en kwantitatieve analyse door fluorescentie microscopie

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

Menselijke Colonoid Monolayers studie van interacties tussen ziekteverwekkers, Commensals en Host intestinaal epitheel

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens

Met behulp van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen-afgeleide intestinale Organoids te bestuderen en te wijzigen epitheel cel bescherming tegen salmonella en andere pathogenen

The intestinal &#8216;organoid&#8217; (iHO) system, wherein 3-D structures representative of the epithelial lining of the human gut can be produced from ...