Name: canine intestinal organoids in a dual-chamber permeable support system
Uploaded: 2022-03-02T13:00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Canine Intestinal Organoids in a Dual-Chamber Permeable Support System at JoVE.com

אנו רוצים להביע תודה למעבדה לאבחון וטרינרי של עובדי אוניברסיטת איווה סטייט, כלומר היילי למברט, אמילי רהה, רוזלין בראנמן, ויקטוריה גרין וג'ניפר גרואלץ-ת'ראש, על העיבוד בזמן של דגימות. אנו רוצים גם להודות לג'ודי סמית' ובת'אן ולנטיין על שסיפקו חומר לניסויי החדירות. אנו רוצים גם להודות לדוד דיאז-רגנון על עזרתו באיור 9. למעט איור 6, כל הדמויות נוצרו BioRender.com. המחברים מבקשים להודות לתמיכה של סטארט-אפ הפקולטה, פרס ISU VPR Miller, פרס ISU VPR Miller, ו- NSF SBIR תת-מחלקה ל- ISU # 1912948.

ק. אלנספאך הוא מייסד שותף של LifEngine Animal Health ופתרונות בריאות בתלת-ממד. היא משמשת כיועצת ל-Ceva Animal Health, Bioiberica, LifeDiagnostics, Antech Diagnostics, Deerland Probiotics ו-Mars. J.P. Mochel הוא מייסד שותף של LifEngine Animal Health ופתרונות בריאות 3D ומשמש כיועץ לבריאות בעלי חיים של Ceva ולבריאות בעלי חיים אתוס. מאמר זה משקף את דעותיהם של המחברים ואין לפרשו כמייצג את התמיכה, ההשקפה או המדיניות של מנהל המזון והתרופות האמריקאי. למחברים אחרים אין כל ניגוד עניינים להצהיר עליו.

תרביות אורגנואידים של מעיים כלביות במנגנון התמיכה החדיר הן מושג ייחודי המחבר בין מבחני חדירות סמים מסורתיים40 לבין מודל חדשני של כלבי מבחנה 41. ניתן להשתמש ולהעריך סוגים שונים של אורגנואידים במעיים כלבים על סמך מטרת הניסוי עם התאמות מינימליות. מומלץ לבדוק ריכוזים מרובים של התרופה המעניינת 3-4 בארות לכל קבוצה. הריכוזים עשויים להתבסס על ריכוז המעיים הצפוי של התרופה. יתר על כן, שימוש במחקרים קודמים עשוי לסייע בקביעת נקודות זמן מתאימות לתכנון המחקר. יש לבצע תיעוד מתאים של תכנון המחקר כדי להגביר את השכפול ולסייע בפתרון בעיות.
לטכנולוגיה זו יש מספר מגבלות בשל החידוש של השיטה42, בעיקר בשל היעדר סטנדרטיזציה בתכנון הניסוי ובביצוע הפרוטוקול במעבדות שונות. חוסר סטנדרטיזציה זה הוכר על ידי קבוצות אחרות43, ופרוטוקולי האורגנואידים Monolayer של הכלבים 3D יובילו לשכפול בין-שכבתי ויכניסו סטנדרטיזציה למערכת זו. גישות סטנדרטיות לניתוח נתונים משפרות את השכפול ויכולות לחזק את התוצאות של בדיקות סמים ראשוניות באמצעות האורגנואידים הכלביים במערכת התמיכה החדירה במעבדות שונות. המודל האורגנואידי התלת-ממדי של הכלב חסר גם מערכי נתונים המשווים בין ערכיאפליקציית In vitro P של תרופות מודל לספיגת מעיים אנושית או כלבית in vivo הידועה שלהן, בדומה לתאי Caco-2 44,45,46. לאחר שנתונים כאלה נוצרו, ניתן להשתמש במודל האורגנואידים הכלבי הזה כדי להעריך את חדירות המעיים במהלך פיתוח תרופות.
חשוב מאוד להיזהר בעת זריעת האורגנואידים על מערכת התמיכה החדירה כדי לזרוע צפיפות גבוהה מספיק של תאים מנותקים כראוי. ערכי ה- TEER של המערכת אמינים יותר וניתנים לשחזור כאשר הם גדלים בשכבות חד-שכבתיות קפדניות. תרבית ממושכת של החד-שכבתיים יכולה להוביל לעלייה אקספוננציאלית בערכי TEER המגיעים רחוק יותר מהערכים הפיזיולוגיים של המעי. מקטעי H&E של מבנים תלת-ממדיים כאלה מראים מספר שכבות של תאים זה מעל זה עם מבנים משתנים של אנטרוציטים הקרובים יותר לממברנה.
לאחר הרחבה מוצלחת של מונולאייר האורגנואידי של מעי הכלבים, ניתן לנתח את התוצאות באותו אופן כמו מבחני תאים דו-ממדיים מסורתיים על ידי חישוב מקדם החדירות לכאורה של התרופה (P app) פורמולה44. ערךאפליקציית P (ראה Eq (2)) מתאר את קצב ההובלה על פני החד-שכבתי התאי47.
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63612/63612eq02.jpg" style="margin: auto;"> (2)
זהו <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63612/63612eq03.jpg" style="margin: auto;"> השיפוע ההתחלתי של הריכוז לעומת עקומת הזמן (למשל, nmol/s). A הוא שטח התוספת (ס"מ2), ו - C0 הוא הריכוז הראשוני של התרופה או התרכובת בתא התורם37. הכרה אמינה בשלמות החד-שכבתית היא חלק מכריע בבדיקת החדירות הדורשת סטנדרטיזציה. מיקרוסקופיית אור ומדידות TEER מומלצות כדי להעריך אורגנואידים של כלבים במערכת תמיכה חדירה ולסייע בקביעת התזמון הנכון של הניסוי. בנוסף, סמני חדירות מולקולרית אפסיים (למשל, FITC-dextran, לוציפר צהוב, PEG-400) יכולים לשמש להערכה פונקציונלית של שלמות חד-שכבתית אורגנואידית. יש לשים לב אם התרכובת שנבדקה מושפעת על ידי טרנספורטר. P-גליקופרוטאין (P-gp) משמש כדוגמה נפוצה למשאבת efflux. יש ליצור יחס efflux (אפליקציית P, אפליקציית BL-AP/P, AP-BL) בהשוואה למצע בדיקה P-gp ידוע.
מיקרוסקופיית אור (רגילה או משופרת עם ניגודיות פאזה) היא שיטה שלא תסולא בפז לבדוק את שלמות השכבה הדו-ממדית או התלת-ממדית ואת תוספת המסנן תוך הערכת צמיחת יתר תאית אפשרית. איור 7 יכול לשמש כמדריך לזיהוי תרביות תאי אורגנואידים בריאים של מעיים כלביים. ערכי TEER הם מדד חשוב להיווצרותם של צמתים בין-תאיים ולהבחנה של תרביות האורגנואידים לאפיתל מעיים שלם. האורגנואידים של המעי הכלבי מתמיינים לאנטרוציטים ולתאי גביע (איור 6). תאים אלה המייצרים ריר מאפשרים לחקור אינטראקציות בין תרופות לליחה, דבר שהיה קשה להשיג באמצעות תרביות תאים דו-ממדיות מסורתיות48. נוכחותם של תאים אנטרואנדוקריניים אושרה בעבר באורגנואידים של מעיים כלביים על ידי Chandra et al.33.
ניתן אפיון נוסף של מונו-שכבות האורגנואידים הכלביים שמקורם באורגנואידים ג'ונאליים, איליאליים ומעי גסים באמצעות TEM. תמונות TEM מראות מיקרו-ארכיטקטורה תאית, כולל צמתים הדוקים והיווצרות מיקרוווילי, מה שממחיש עוד יותר את המורכבות והתועלת של מודלים אורגנואידיים אלה ברפואה תרגומית. בהתבסס על תוצאות הניסוי, תרביות האורגנואידים על התמיכה החדירה היו מוכנות לניסויים בין הימים ה-11 ליום ה-13 לאחר הזריעה (איור 9). ערכי TEER בנקודת זמן זו נעו בין 1,500 ל- 2,500 Ω.cm2. שלב המישור של ערכי TEER נמשך לחלון זמן מוגבל מאוד שבו יש להתחיל בניסוי לפני שערכי TEER מתחילים לרדת לאט. ערכי TEER יכולים גם להיות חלק מכריע בהצגת תוצאות ניסוי חשובות מכיוון שתרופות מסוימות או תוצרי תרופות עשויים לקיים אינטראקציה עם החד-שכבתי (למשל, צמתים הדוקים), מה שיכול להשפיע מאוד על קריאות הערך של TEER. זה לבדו יכול לשמש כנתונים לניסוי.
ניתן ליישם אורגנואידים של מעיים כלביים במנגנון תרבית תאים דו-תאיים בתחומים שאינם חדירות תרופה דרך הפה בשל הארכיטקטורה הייחודית של חד שכבת התא המתקבלת. לדוגמה, ניתן להשתמש בהם במחקר מיקרוביולוגי (למשל, ההשפעה של שינוי הצומח המיקרוביאלי של מערכת העיכול), במחקרי ספיגה של נגיפים, באינטראקציות בין תרופות לתרופות ובמנגנוני הובלת תרופות49. תא התורם מלא בדרך כלל בתרופת הבדיקה או בתרכובת המועדפת, ואליקוטים מתא המקלט נלקחים בנקודות זמן שונות. ניתן לנתח את האליקוטים הללו באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים, ספקטרומטריית מסה, בדיקה חיסונית הקשורה לאנזים, או טכניקות אחרות כדי לקבוע את הכמות והמהירות שבה המומס מחלחל דרך המומס דרך החד-שכבתי.
מחקרים אלה דורשים מונו-שכבתי שלם כדי להעריך במדויק את חדירות התרופות. זה בדרך כלל דורש גידול מונו-שכבות העולה על אלה הדרושות כדי להסביר בארות שאינן שמישות. מונו-שכבות של תאים אורגנואידים יכולות לשמש גם למדידת ספיגה נגיפית מהצד האפיקלי או הבסיסי של מונולאייר, עם קריאות הכוללות נוגדנים המשתמשים בבדיקות אימונופלואורסצנטיות כדי לזהות את הספיגה התאית של הנגיף. לבסוף, ניתן ליישם מספר תרופות (כלומר, מצע ומעכב) על תא התורם כדי לזהות אינטראקציות בין תרופות לתרופות טרנספורטר.
בהתבסס על התצפיות הנוכחיות, שיטות אלה לא רק יחולו על אורגנואידים של כלבים בתוספות תרבית, אלא גם יתאימו למינים וטרינריים אחרים ולמערכות איברים, עם שינויים קלים הדרושים כדי להתאים בצורה הטובה ביותר למין או למודל האיברים המועדף. היה צורך להתאים את הפרוטוקולים לצמיחת האורגנואידים של המעי הכלבי על סמך התכונות הייחודיות של התרבית. לפיכך, ניתן להתאים את הפרוטוקול למין אחר אך ידרוש שינויים עדינים בפרוטוקול. שינויים עשויים להתחיל בשינויים בצפיפות זריעת התאים ולהתרחב לשינויים בהרכב המדיה כדי להבדיל כראוי בין האורגנואידים המעניינים.
הסטנדרטיזציה, התיעוד המפורט של ההליכים הניסוייים והניטור העקבי של חד-שכבתי התאים הם פרקטיקות חיוניות הדרושות במבחני התמיכה החדירים ואינם מוגבלים למערכת הכלבים. מינים אפשריים אלה או שינויים באיברים הם קריטיים לתיעוד ולדיווח על התקדמות נוספת בתחום. למודל זה יש מספר מגבלות, לדוגמה, דרישות העלות שלו, השתנות בין-שכבתית ונתונים מוגבלים על היכולת לחזות את ספיגת המעיים in vivo. לכלבים, במקרים מסוימים, יש מובילי סמים שונים ואנזימים מטבוליים מאשר בני אדם50.
יתר על כן, יש לבדוק את המערכת האורגנואידית הכלבית על מגוון מנגנונים דו-תאיים אחרים מיצרנים אחרים כדי לקבוע את התאמתו של דגם כזה (למשל, יש לקבוע את ההתאמה של הרכבי ממברנות מסנן שונים). חיסרון נוסף הוא שהחלק של ניסוי חדירות התרופה בכתב היד הוא פחות תיאורי מהחלקים הקודמים. זה נגרם על ידי עודף של מידע בתחום זה. המטרה של חלק זה של כתב היד הייתה לתאר את השיטות הללו בצורה ניתנת לשינוי, מבלי לחתוך את קצוות אבני היסוד של ניסויים אלה. מידע מפורט יותר על ניסויי חדירות נאסף על ידי Hubatsch et al.37. בנוסף, ניתן להשתמש בתוספות חדירות בקוקולטורה, נדידת תאים וניסויי בדיקת פלישה4.
לסיכום, לאורגנואידים של המעיים הכלביים במנגנוני תרבית דו-תאיים יש פוטנציאל לשמש במגוון רחב של יישומים, כולל תחומים ביו-רפואיים ורפואה תרגומית, בין היתר. הפרוטוקולים יוצרים מספר אסטרטגיות לתכנון ניסוי ולקידום מהימנות נתונים בין-שכבתית עבור מודלים אורגנואידים ברחבי תחום הביולוגיה.

מערכות תמיכה חדירות משמשות בדרך כלל לקביעת החדירות לכאורה של מועמדים לתרופות טיפוליות דרך מחסום אפיתלהמעיים 1,2. ניתן להשתמש בהם גם כדי להעריך הפרשה תאית3, נדידת תאים4 ורעילות סמים5. בדיקות חדירות של תרופות פומיות במבחנה הן שלב מפתח בתהליך הגילוי והפיתוח של התרופה2, כאשר מועמדים בודדים לתרופות נבדקים בשלב המוקדם של מחזור החיים של המו"פ של התרופה6. מערכת התמיכה החדירה היא מנגנון תרבית תאים דו-תאי המורכב מתוסף עם קרום חצי נקבובי הממוקם בלוח רב-תכליתי. מערכת זו מאפשרת גישה ישירה לצדדים האפיקליים והבזולטרליים של חד-שכבתי תאים הגדלים בתוסף7. החד-שכבתי המשמש במערכות אלה מופק בדרך כלל מתאי אפיתל במערכת העיכול (למשל, קו תאים של אדנוקרצינומה של המעי הגס האנושי Caco-2)8. תרביות תאים גדלות במצב מקוטב המחקה את המיקרו-ארכיטקטורה הטבעית של תאי אפיתל במעיים, ומאפשרות התמיינות תאית נוספת, מיקרואנטומיה דומה ותפקוד7. פרטים על תוספת התמיכה החדירה ניתן למצוא באיור 1. זריעת התוספות עם תרביות תאים דו-ממדיות, המשמשות באופן מסורתי להערכת חדירות תרופות מעיים, היא זולה יחסית וקלה לתרבית9. מערכות אלה מציגות מספר מגבלות עיקריות, כולל יכולתן המוגבלת לחזות את חילוף החומרים במעיים של מועמדים לתרופות טיפוליות10,11. זה נכון לגבי כל המנגנונים של ספיגת תרופות, בין אם זה ספיגה פסיבית דרך הצמתים ההדוקים בין תאי אפיתל, ספיגה טרנסאפיתליאלית פעילה באמצעות efflux, או מובילי ספיגה (למשל, P-גליקופרוטאין, טרנספורטר מונוקרבוקסילט 1), ותרופות שעברו חילוף חומרים על ידי אנטרוציטים.
כלבים חולקים סביבה משותפת ותזונה עם בני אדםבני 12. האנטומיה של המעיים הכלביים והרכב המיקרוביום דומים מאוד לאלה של בני אדםבני 13, המיוחסים לביות ולתזונה משותפת במהלך 36,000 השנים האחרונות14. למרבה הצער, קווי דמיון אלה יכולים להיות גם גורמים /טריגרים נפוצים להתפתחות המחלה. כלבים מפתחים תחלואה כרונית דומה לבני אדם, כגון השמנת יתר15, מחלת מעי דלקתית16, אדנוקרצינומה של המעי הגס17, גידול סטרומלי במערכת העיכול (GIST)18, ופתולוגיות שונות אחרות הקשורות לאריכות הימים היחסית שלהם19. בהתאם לכך, ניתן להשתמש בהצלחה באורגנואידים של כלבים למחקר תרגומי הפוך של מחלות רב-גורמיות כרוניות אלה ברוח יוזמת הבריאות האחת20.
תאי קאקו-2 הם קווי התאים הנפוצים ביותר לבדיקות ספיגה פומיות של תרופות21. תאים אלה נחשבים כיום למודל "תקן הזהב" לבדיקות חדירות מעיים במבחנה 2,22,23. קו התאים של Caco-2 מבטא את השטף ואת מובילי הקליטה שנמצאו במערכת העיכול האנושית, אם כי ברמות ביטוי שונות 24,25,26. תאי Caco-2 נמצאים בשימוש נרחב גם כמודלים כדי לקבוע אם תרופה היא מצע או מעכב של מובילי זרם מעיים22,27. למרות שתאי קאקו-2 הם ממקור המעי הגס, הם מחקים תא אנטרוציטים. למרבה הצער, תאי Caco-2 מייצגים רק סוג תא אחד משכבת האפיתל של המעי הדק9, אשר אינו מצליח לשחזר את הרכב סוג התאים המורכבים של אפיתל המעי במדויק. לדוגמה, תאי גביע המוקדשים לייצור ריר נעדרים מתרביות קאקו-2, כך שלא ניתן להעריך אינטראקציות של ליחה-תרופה ללא קוקולטורה עם קווי תאים אחרים28. יתר על כן, תרביות Caco-2 אינן מבטאות כמה מהקולטנים הגרעיניים החשובים הקיימים בדרך כלל במעי, כגון קולטן Pregnane X (PXR), קולטן סטרואיד X (SXR) וקולטן אנדרוסטן מכונן (CAR)29. כתוצאה מכך, תרביות Caco-2 אינן מצליחות לדגום את האינדוקציה של מובילי תרופות ואנזימים על ידי תרופות מסוימות המעוררות של קולטנים אלה (למשל, ריפאמפין)30.
טכנולוגיית האורגנואידים של המעי התלת-ממדי מטפלת בחלק מהמגבלות הללו19. אורגנואידים הם מבנים בהרכבה עצמית המופקים מתאי גזע בוגרים שניתן לבסס מדגימות רקמה שנקצרו באמצעות טכניקות מיקרו-פולשניות20. תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי האדם משמשים למודלים של חדירות מעיים31,32. אורגנואידים של כלבים מספקים אלטרנטיבה רלוונטית לאורגנואידים אנושיים מכיוון שמחקר תאי גזע אנושיים מוגבל על ידי סוגיות אתיות33. יתר על כן, אורגנואידים של כלבים מספקים מערכת חוץ גופית לחקר חדירות תרופות לכלבים, חילוף חומרים, הובלה פעילה ואינטראקציות בין תרופות לתרופות. כדי להתמודד עם הפער הטכנולוגי הזה, תוארה הצמיחה העקבית והאמינה של אורגנואידים במעיים של כלבים במערכת תמיכה חדירה34. בדיקת חדירות עם אורגנואידים של מעיים כלביים עשויה לחזות את חדירות מעי הכלבים ואת חילוף החומרים של מולקולות תרופות קטנות בהשוואה לבדיקות הנמצאות בשימוש כיום (Caco-2). אישור של תכונות מרכזיות אלה מעניק למערכת מבחנה חדשנית זו לעבודה עתידית הבוחנת את ההשפעה הפוטנציאלית של משרי ההשראה על חילוף החומרים התוך-תאי ועל ההובלה הפעילה.
האורגנואידים הכלביים מורכבים מכל סוגי התאים הקיימים בדרך כלל בשכבת האפיתל של המעי. מנקודת מבט פונקציונלית ומיקרואנטומית, הם משכפלים באופן מהימן את הסביבה של שכבת האפיתל של המעי הכלבי19,35. יתר על כן, נוכחותם של רירים, מובילי תרופות ואנזימים ספציפיים לכלבים, והתמיינות תאית כוללת באורגנואידים של מעיים כלביים דומה למה שנראה ב-in vivo אצל כלביםבני 34. לפיכך, ניתן לבודד אורגנואידים מחולים וטרינריים חולים ולהשתמש בהם כדי לדגום את ההשפעה של תהליכי מחלה שונים (למשל, דלקת מעיים כרונית) על חדירות תרופות אוראליות כלביות19,36. מערכת האורגנואידים של המעי הכלבי יכולה לשמש גם במסגרות אחרות מאשר ניסויים בחדירות תרופות. מבנים תלת-ממדיים אלה יכולים גם להיות מבודדים מחולים חולים כפי שתואר בעבר על ידי Chandra et al. למחלות מעי דלקתיות, אדנוקרצינומה של המעי הגס וגידול סטרומלי במערכת העיכול19.
פרוטוקול זריעת התמיכה החדירה מתאר שיטות לביסוס תרביות אורגנואידים במעיים של כלבים בתוספות. פרוטוקול ראשון זה מתווה שיטות לדיסוציאציה של תרביות אורגנואידים מבוססות של כלבים המצופים במטריצת הממברנה החוץ-תאית. יתר על כן, ההקדמה של התוספות עם קולגן I ומטריצת הממברנה החוץ-תאית נדונה בפרוטוקול זה. הטמעת אורגנואידים של כלבים בתוספות התמיכה החדירות מתוארת גם היא בפירוט.
הפרוטוקול השני הוא פרוטוקול התחזוקה Monolayer, הכולל תחזוקה כללית של אורגנואידים תלת-ממדיים של כלבים המצופים בתוסף. התדירות והנפחים של המדיה האורגנואידית המשמשת לרענון התרבית, ודרכים למניעת נזק לתרבית תאים, מוצגים בפרוטוקול השני, יחד עם שיטות ניסיוניות להערכת המפגש של חד שכבת האפיתל.
לבסוף, פרוטוקול ניסוי החדירות מתמקד בדרכים לקבוע אם האורגנואידים התלת-ממדיים של המעי הכלבי בבדיקת חדירות מוכנים לשימוש ניסיוני ולשלבי האימות הדרושים לפני ביצוע ניסוי כלשהו. חלק זה מתאר גם את ההתקנה והביצוע המוצלח של ניסוי חדירות, יחד עם הדגירה והדגימה של מועמדים לתרופות טיפוליות בתאי התרבות החד-שכבתית. כמו כן, נדון השימוש בפלואורסצ'ין איזותיוציאנט בעל חדירות נמוכה (FITC-dextran) לניטור שלמות חד-שכבתית. לבסוף, מתוארת שיטת הערכה חוץ גופית לאימות התוצאות לאחר סיום הניסוי. ניסויי חדירות הם נושא רחב ביותר ומסוכמים היטב על ידי Hubatsch et al.37. זרימת העבודה של הפרוטוקולים מסוכמת באיור 2.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63612/63612fig01.jpg"> איור 1: אורגנואידים של מעיים כלביים על מערכת תמיכה חדירה. תוספת התמיכה החדירה ממוקמת בבאר של צלחת של 24 בארות. הממברנה המיקרו-נקבובית מאפשרת זריעה של אורגנואידים של מעיים כלביים מנותקים, ותאים אלה ייצרו בסופו של דבר חד-שכבתית דו-ממדית אורגנואידית. טכנולוגיה זו מאפשרת גישה הן לצדדים AP והן ל- BL של החד-שכבתי. מדיום אורגנואידי מוצג הן בתאי AP והן בתאי BL של התמיכה החדירה. הקליטה (AP→BL) וההפרשה (BL→AP) של המועמד לתרופה מודגמות, כמו גם שני מצבים אפשריים של הובלת סמים. קיצורים: AP = apical; BL = basolateral. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/63612fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63612/63612fig02.jpg"> איור 2: זרימת עבודה של פרוטוקולי תמיכה חדירים אורגנואידים לכלבים. תוסף התמיכה החדיר מצופה מראש בתערובת של מטריצת הממברנה החוץ-תאית וקולגן I ומדגר במשך שעה אחת. במהלך תהליך הדגירה, תרבית האורגנואידים מנותקת. תאים אורגנואידים בודדים נזרעים בתוסף, מדיום בתא הבזולטרלי מתווסף מיד לאחר הזריעה, ואילו בינוני לתא האפי מתווסף 24 שעות לאחר סיום תהליך הזריעה. תחזוקה וניטור של האורגנואידים כוללים שינויים קבועים בתווך, מדידות ערך TEER ומיקרוסקופיית אור כדי להעריך את שלמות החד-שכבתי. לפני הניסוי, יש להבדיל בין האורגנואידים על ידי הסרת מעכב ROCK ו- GSKiβ מהתקשורת. ערכי ה-TEER נמדדים ביום הניסוי, והחד-שכבתית האורגנואידית נבדקת באמצעות מיקרוסקופיית אור לאיתור נזק לתאים. לאחר מכן מדיום מוחלף עבור חיץ מתאים ודגירה לפני הניסוי. בדיקת FITC-dextran משמשת במהלך ניסויי חדירות מעיים39 כסמן לשלמות חד-שכבתית. מדידות TEER נלקחות לאחר הניסוי, ומיקרוסקופיית אור תאמת את התוצאות לאחר 24 שעות. קיצורים: TEER = התנגדות חשמלית טרנס-פיתלית; ROCK = קינאז הקשור ל-rho; GSKiβ = גליקוגן סינתאז קינאז בטא; F = פלואורסצנציה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/63612fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Organoid media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;ROCK inhibitor (Y-27632)</td>
			<td>EMD Millipore Corp.</td>
			<td>SCM 075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[Leu15]-Gastrin I human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9145-.5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-83-01</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>9094360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>glutamine substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>J848-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human R-Spondin-1</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>120-38-500UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine EGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-09-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Noggin</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>250-38-250UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Wnt-3a</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-20-10UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetyl-L-cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9165-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0636-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190 (P38 inhibitor)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7067-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemolecule CHIR99021 (GSK3&#946;)</td>
			<td>Reprocell</td>
			<td>04-0004-base</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMS (trimethoprim sulfate)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7883-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid, Glacial</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A38-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alpha-D(+)-Glucose, 99+%, anhydrous</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>170080010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, Rat Tail 3 mg/mL</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A10483-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-CM-Dextran</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>68059-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde (37%)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>F79P-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (1x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Matrix For Organoid Culture</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356255</td>
			<td>Extracellular Membrane Matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 97%</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 1x (Phosphate-Buffered Saline)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604-021</td>
			<td>Trypsin-like Protease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials and Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9&#34; Pasteur Pipets</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-678-6B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Transwell 6.5 mm Polyester Membrane Inserts Preloaded in 24-Well Culture Plates, Pore Size: 0.4 &#181;m, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3470</td>
			<td>Permeable Support</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell ERS (Probes)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MERSSTX01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell ERS-2 Voltohmmeter</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MERS00002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panasonic incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-170ML-PA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M Wrapping Film</td>
			<td>Bemis Company Inc</td>
			<td>PM996/EMD</td>
			<td>Flexible Laboratory Film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Plate 24 wells</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB012929</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

canine intestinal organoids in a dual-chamber permeable support system

מערכת התמיכה החדירה משמשת בדרך כלל בשילוב עם קווי תאים דו-ממדיים מסורתיים (דו-ממדיים) ככלי חוץ גופי להערכת חדירות הפה של מועמדים חדשים לתרופות טיפוליות. עם זאת, לשימוש בקווי תאים קונבנציונליים אלה יש מגבלות, כגון ביטוי שונה של צמתים הדוקים, התמיינות תאים חלקית והיעדר קולטנים גרעיניים מרכזיים. למרות חסרונות אלה, המודלים של Caco-2 ו-MDCK מקובלים ומאומתים באופן נרחב לחיזוי החדירות האוראלית של האדם in vivo .
כלבים הם מודל תרגומי רלוונטי למחקר ביו-רפואי בשל הדמיון ביניהם באנטומיה של מערכת העיכול ובמיקרופלורה של המעיים עם בני אדם. בהתאם לכך, ולתמיכה בפיתוח תרופות מקבילות, רצוי מאוד להרחיב את השימוש בכלי יעיל ומדויק במבחנה לניבוי מאפייני חדירות של תרופות in vivo הן אצל כלבים והן אצל בני אדם. כלי כזה יכול להיות מערכת האורגנואידים של מעי הכלבים, המאופיינת במבני אפיתל תלת-ממדיים (תלת-ממדיים), המורכבים מעצמם, שמקורם בתאי גזע בוגרים.
(1) פרוטוקול זריעת תמיכה חדירה מתאר את השיטות הניסיוניות לניתוק וזריעה של אורגנואידים של כלבים בתוספות. בידוד אורגנואידים של כלבים, תרבית וקציר תוארו בעבר בסדרה נפרדת של פרוטוקולים בגיליון מיוחד זה. שיטות לתחזוקה כללית של monolayer אורגנואיד מעיים כלבים נדונים ביסודיות ב (2) פרוטוקול תחזוקה Monolayer. בנוסף, פרוטוקול זה מתאר שיטות להערכת השלמות המבנית של החד-שכבתי באמצעות מדידות התנגדות חשמלית טרנס-פיתלית (TEER) ומיקרוסקופיית אור. לבסוף, הפרוטוקול הניסויי (3) חדירות מתאר את המשימות שקדמו ישירות לניסוי, כולל אימות מבחנה של תוצאות הניסוי.
באופן כללי, המודל האורגנואידי של הכלב, בשילוב עם טכנולוגיית תרבית תאים דו-תאית, מתגבר על מגבלות הקשורות למודלים ניסיוניים דו-ממדיים, ובכך משפר את אמינות התחזיות של חדירות האוראלית לכאורה של מועמדים לתרופות טיפוליות הן אצל הכלב והן אצל המטופל האנושי.

נהלי הפעלה סטנדרטיים לתרבית האורגנואידים הכלביים תוארו בעבר33, וגם פרוטוקול האורגנואידים של הכלבים נדון בפירוט בגיליון מיוחד זה38. אורגנואידים של מעיים כלביים בתרבית על תמיכות חדירות תוקנו והוטמעו בפרפין כדי לבחון את המיקרואנטומיה של המונולייר ואת אוכלוסיות התאים. תהליך הטמעת הפרפין נדון בעבר על ידי Gabriel et al.38. בוצעו צביעה שגרתית (המטוקסילין ואוזין), וטכניקת הכתם הכחולה האלקיאנית שימשה לאיתור תאי גביע במונולייר האורגנואידי הכלבי (ראו איור 7).
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63612/63612fig07.jpg"> איור 7: צביעה חד-שכבתית אורגנואידית במעיים של כלבים. אורגנואידים של מעיים כלביים שמקורם במעי הגס בתמיכה החדירה הוטמעו בפרפין והוכתמו ב-H&E וב-AB. תמונות מייצגות צולמו באמצעות מיקרוסקופיה קלה בהגדלה של פי 40 (A) ו-60x (B). צביעת H&E חושפת חד-שכבת אפיתל טורית, וניתן לראות את המיקרוווילי בחלק האפיקלי של התאים בהגדלה של פי 60. צביעת AB חושפת עוד יותר את נוכחותם של תאי גביע (כחול כהה) במונולייה האורגנואידית של המעי הכלבי. סרגלי קנה מידה = 20 מיקרומטר (A), 50 מיקרומטר (B). קיצורים: H&E = המטוקסילין ואוזין; AB = כחול אלקי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/63612fig07large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
יש להגדיל את תרבית האורגנואידים על התמיכה החדירה למשך 10 עד 14 יום כדי להיות מוכנים לניסוי חדירות. מיקרוסקופיית אור משמשת בשילוב עם מדידות ערך TEER כדי לאשר את המוכנות של תרבית האורגנואידים לבדיקת חדירות של מועמדים לתרופות. איור 8 מוצגות תמונות מיקרוסקופיות קלות מייצגות של מונו-שכבות אורגנואידיות שונות במעיים כלביים מבעלי חיים בריאים וחולים.
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63612/63612fig08.jpg"> איור 8: מיקרוסקופיה חד-שכבתית אורגנואידית של מעיים כלביים. תמונות של חד-שכבתיים גדלים כפי שהם נראים תחת מיקרוסקופיית אור. מונו-שכבות אורגנואידיות שמקורן בתורמים בריאים מיוצגות על ידי תרביות אנטרואידיות (10x; 40x) וקולונואידים (20x; 40x). מונו-שכבות אורגנואידיות של תורמים חולים מיוצגות על ידי תריסריון (5x; 10x) ואיליאל (5x; 10x) אנטרואידים שמקורם בחולה כלבים המאובחן עם PLE. שתי תרביות האורגנואידים של PLE הן דוגמאות לבידוד תאים לא תקין במהלך זריעת אורגנואידים, ותרביות אלה לא יכלו לשמש לבדיקות חדירות סמים בגלל נוכחותם של אורגנואידים תלת-ממדיים. דוגמאות לסטיות מהיווצרות חד-שכבתית תקינה, כגון קרעים חד-שכבתיים (5x), נגרמות על ידי מניפולציה לא אכפתית של הדגימות הביולוגיות. התרבית הממושכת של האורגנואידים (10x; 20x) נגרמת על ידי תחזוקה ארוכה של האורגנואידים על התוספת כאשר האורגנואידים מתחילים להידמות למבנה התלת-ממדי המקורי שלהם. לשם השוואה, מוצגות תמונות של קווי תאים דו-ממדיים מסורתיים על התמיכות החדירות המשמשות בדרך כלל למחקרי חדירות תרופות (MDCK-10x; 40x, ו- Caco-2-10x; 20x). קיצורים: PLE = אנטרופתיה מאבדת חלבון; MDCK = הכליה הכלבית מאדין-דארבי. סרגלי קנה מידה = 500 מיקרומטר (5x), 200 מיקרומטר (10x), 100 מיקרומטר (20x), 50 מיקרומטר (40x). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/63612fig08large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
מונו-שכבות אורגנואידיות תוקנו גם ב-3% פרפורמלדהיד-3% גלוטראלדהיד במי מלח עם מאגר פוספט (PBS). מיקרוסקופיית אלקטרונים הולכה (TEM) שימשה לאפיון מבנה האולטרה-מבנה של תרבית האורגנואידים על התמיכות החדירות. מבנים מיקרואנטומיים של מיקרוווילי וצמתים הדוקים ניתן לראות באיור 9.
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63612/63612fig09.jpg"> איור 9: תמונות TEM של חד-שכבתיים אורגנואידים בריאים במעיים של כלבים. TEM שימש לחשיפת המיקרו-ארכיטקטורה התאית של חד-שכבתיים אורגנואידים ג'ג'ונאליים (A), איליאליים (B) וקולוניים (C). הממברנה המיקרו-נקבובית של תוסף התמיכה החדיר מסומנת בחץ צהוב. נוכחותם של מיקרוווילי (חץ כחול) וצמתים הדוקים (חץ אדום) מסומנת בתמונות. קיצור: TEM = מיקרוסקופ אלקטרונים שידור. סרגלי קנה מידה = 5 מיקרומטר (A), 2 מיקרומטר (B, C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/63612fig09large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
יש לבצע הן מדידות TEER והן מיקרוסקופיית אור כדי להבטיח שהמערכת מוכנה לבדיקת חדירות. הבדיקה מוכנה לשימוש כאשר TEER מגיע למצב יציב, בעוד שמיקרוסקופיה קלה תסייע למנוע נזק או צמיחת יתר של האורגנואידים. סיכום של מדידות TEER טיפוסיות של חמש קבוצות המורכבות מאנטרואידים כלביים וקולונואידים מוצג באיור 6.
טבלה 1: הרכב המדיה האורגנואידית וה-FAA. ההרכב המלא של CMGF+, CMGF+ R/G ו-FAA מסוכמים בטבלה זו. קיצורים: ROCK = קינאז הקשור ל-rho; GSKiβ = גליקוגן סינתאז קינאז בטא; CMGF + R/G = מדיום שלם עם גורמי גדילה משופרים עם מעכב ROCK ו- GSKiβ; CMGF+ = מדיום שלם עם גורמי גדילה אך ללא מעכב ROCK או GSKiβ; FAA = פורמלין-חומצה אצטית-אלכוהול; EGF =גורם גדילה אפידרמלי. טבלה זו מותאמת מ-38. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/Table%201%20(8).xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>
טבלה משלימה 1: טבלה לרישום הערות על אורגנואיד כלבים מערכת התמיכה החדירה. קיצורים: TEER = התנגדות חשמלית טרנס-פיתלית; ROCK = קינאז הקשור ל-rho; GSKiβ = גליקוגן סינתאז קינאז בטא; CMGF + R/G = מדיום שלם עם גורמי גדילה משופרים עם מעכב ROCK ו- GSKiβ; CMGF+ = מדיום שלם עם גורמי גדילה אך ללא מעכב ROCK או GSKiβ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/Supplementary%20Table%201%20(1).xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Canine Intestinal Organoids in a Dual-Chamber Permeable Support System at JoVE.com

Canine Intestinal Organoids in a Dual-Chamber Permeable Support System

כאן אנו מציגים פרוטוקול המתאר את תרבית האורגנואידים של המעי הכלבי במערכת תמיכה חדירה בעלת תא כפול. מתוארים זריעת אורגנואידים בתמיכות החדירות, תחזוקת המונולאייר וניסויי חדירות התרופות הבאים.

אורגנואידים של מעיים כלביים במערכת תמיכה חדירה בעלת שני תאים

The permeable support system is typically used in conjunction with traditional two-dimensional (2D) cell lines as an in vitro tool for evaluating the oral ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

פיתוח מרקר לבחירה שלילי Entamoeba histolytica</em

Entamoeba histolytica is the causative agent of amebiasis and infects up to 10% of the world's population. The molecular techniques that have enabled the ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Microglia culturing ממערכת העצבים המרכזי וילודים למבוגרים

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

ה<em&gt; Ex Vivo</em&gt; גירוי קולטן הכרת תרבות תבנית של עכבר המעיים Organoids

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the ...

Implementation of a Permeable Membrane Insert-based Infection System to Study the Effects of Secreted Bacterial Toxins on Mammalian Host Cells

יישום של קרום חדיר מערכת זיהום כנס מבוססת כדי לחקור את ההשפעות של מופרש בקטריאלי רעלים בתא פונדקאי יונק

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate ...

A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release

ואלקטרופורזיס פשוט עבור כימות של שחרור מלכודת לכלבים נויטרופילים תאיים

Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although ...

Induction of Paralysis and Visual System Injury in Mice by T Cells Specific for Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4

אינדוקציה של שיתוק ופציעה מערכת הראייה אצל עכברים מאת T תאים ספציפיים עבור אופטיקה Neuromyelitis Autoantigen Aquaporin-4

While it is recognized that aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells and antibodies participate in the pathogenesis of neuromyelitis optica (NMO), a human ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

לימפוציטים בידוד מן העכבר קטן המעי המערכת החיסונית

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

במבחנה מבנה הכלבי נויטרופילים מלכודת חוץ-תאית: דינמי וניתוח כמותי על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

Monolayers Colonoid האדם ללמוד אינטראקציות בין גורמי מחלה, Commensals אפיתל המעי מארח

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens

באמצעות תא גזע המושרה האדם Pluriפוטנטי-המעי הנגזר אורגנואידים ללמוד ולשנות את התא אפיתל הגנה מפני סלמונלה ופתוגנים אחרים

The intestinal &#8216;organoid&#8217; (iHO) system, wherein 3-D structures representative of the epithelial lining of the human gut can be produced from ...