Name: canine intestinal organoids in a dual-chamber permeable support system
Uploaded: 2022-03-02T13:00:00
Duration: 11 min 11 s
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हम नमूनों के समय पर प्रसंस्करण के लिए आयोवा स्टेट यूनिवर्सिटी के कर्मचारियों, अर्थात् हेली लैम्बर्ट, एमिली राहे, रोजलिन ब्रैनमैन, विक्टोरिया ग्रीन और जेनिफर ग्रोएल्ट्ज-थ्रश की पशु चिकित्सा नैदानिक प्रयोगशाला के प्रति आभार व्यक्त करना चाहते हैं। हम पारगम्यता प्रयोगों के लिए सामग्री प्रदान करने के लिए जोड़ी स्मिथ और बेथन वेलेंटाइन को भी धन्यवाद देना चाहते हैं। हम चित्रा 9 के साथ उनकी मदद के लिए डेविड डियाज़-रेगनन को भी धन्यवाद देना चाहते हैं। चित्रा 6 को छोड़कर, सभी आंकड़े BioRender.com में बनाए गए थे। लेखक संकाय स्टार्टअप, आईएसयू वीपीआर मिलर पुरस्कार, आईएसयू वीपीआर मिलर पुरस्कार और एनएसएफ एसबीआईआर उपवार्ड से आईएसयू # 1912948 के समर्थन को स्वीकार करना चाहते हैं।

के एलेनस्पैच लिफइंजिन एनिमल हेल्थ और 3 डी हेल्थ सॉल्यूशंस के सह-संस्थापक हैं। वह सेवा एनिमल हेल्थ, बायोइबेरिका, लाइफडायग्नोस्टिक्स, एंटेक डायग्नोस्टिक्स, डियरलैंड प्रोबायोटिक्स और मंगल ग्रह के लिए सलाहकार के रूप में कार्य करती है। जेपी मोचेल लिफइंजिन एनिमल हेल्थ और 3 डी हेल्थ सॉल्यूशंस के सह-संस्थापक हैं और सेवा पशु स्वास्थ्य और लोकाचार पशु स्वास्थ्य के लिए सलाहकार के रूप में कार्य करते हैं। यह लेख लेखकों के विचारों को दर्शाता है और इसे खाद्य एवं औषधि प्रशासन के समर्थन, दृष्टिकोण या नीतियों का प्रतिनिधित्व करने के लिए नहीं समझा जाना चाहिए। अन्य लेखकों के पास घोषित करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Organoid media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;ROCK inhibitor (Y-27632)</td>
			<td>EMD Millipore Corp.</td>
			<td>SCM 075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[Leu15]-Gastrin I human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9145-.5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-83-01</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>9094360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>glutamine substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>J848-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human R-Spondin-1</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>120-38-500UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine EGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-09-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Noggin</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>250-38-250UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Wnt-3a</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-20-10UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetyl-L-cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9165-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0636-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190 (P38 inhibitor)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7067-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemolecule CHIR99021 (GSK3&#946;)</td>
			<td>Reprocell</td>
			<td>04-0004-base</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMS (trimethoprim sulfate)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7883-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid, Glacial</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A38-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alpha-D(+)-Glucose, 99+%, anhydrous</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>170080010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, Rat Tail 3 mg/mL</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A10483-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-CM-Dextran</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>68059-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde (37%)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>F79P-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (1x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Matrix For Organoid Culture</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356255</td>
			<td>Extracellular Membrane Matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 97%</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 1x (Phosphate-Buffered Saline)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604-021</td>
			<td>Trypsin-like Protease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials and Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9&#34; Pasteur Pipets</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-678-6B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Transwell 6.5 mm Polyester Membrane Inserts Preloaded in 24-Well Culture Plates, Pore Size: 0.4 &#181;m, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3470</td>
			<td>Permeable Support</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell ERS (Probes)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MERSSTX01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell ERS-2 Voltohmmeter</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MERS00002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panasonic incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-170ML-PA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M Wrapping Film</td>
			<td>Bemis Company Inc</td>
			<td>PM996/EMD</td>
			<td>Flexible Laboratory Film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Plate 24 wells</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB012929</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

canine intestinal organoids in a dual-chamber permeable support system

पारगम्य समर्थन प्रणाली का उपयोग आमतौर पर पारंपरिक दो-आयामी (2 डी) सेल लाइनों के साथ संयोजन के रूप में किया जाता है कृत्रिम परिवेशीय उपकरण नए चिकित्सीय दवा उम्मीदवारों की मौखिक पारगम्यता का मूल्यांकन करने के लिए। हालांकि, इन पारंपरिक सेल लाइनों के उपयोग की सीमाएं हैं, जैसे तंग जंक्शनों की परिवर्तित अभिव्यक्ति, आंशिक सेल भेदभाव और प्रमुख परमाणु रिसेप्टर्स की अनुपस्थिति। इन कमियों के बावजूद, विवो मौखिक पारगम्यता में मानव की भविष्यवाणी के लिए कैको -2 और एमडीसीके मॉडल को व्यापक रूप से स्वीकार और मान्य किया जाता है।
कुत्ते मनुष्यों के साथ गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल शरीर रचना विज्ञान और आंतों के माइक्रोफ्लोरा में उनकी समानता के कारण जैव चिकित्सा अनुसंधान के लिए एक प्रासंगिक अनुवादक मॉडल हैं। तदनुसार, और समानांतर दवा विकास के समर्थन में, कुत्तों और मनुष्यों दोनों में विवो दवा पारगम्यता विशेषताओं में भविष्यवाणी करने के लिए एक कुशल और सटीक इन विट्रो टूल का विस्तार अत्यधिक वांछनीय है। इस तरह का एक उपकरण कैनाइन आंतों ऑर्गेनॉइड सिस्टम हो सकता है, जो तीन आयामी (3 डी), वयस्क स्टेम कोशिकाओं से प्राप्त स्व-इकट्ठे उपकला संरचनाओं की विशेषता है।
(1) पारगम्य समर्थन सीडिंग प्रोटोकॉल आवेषण में कैनाइन ऑर्गेनोइड को अलग करने और बोने के लिए प्रयोगात्मक तरीकों का वर्णन करता है। कैनाइन ऑर्गेनोइड अलगाव, संस्कृति और फसल को पहले इस विशेष अंक में प्रोटोकॉल के एक अलग सेट में वर्णित किया गया है। कैनाइन आंतों के ऑर्गेनॉइड मोनोलेयर के सामान्य रखरखाव के तरीकों पर (2) मोनोलेयर रखरखाव प्रोटोकॉल में अच्छी तरह से चर्चा की जाती है। इसके अतिरिक्त, यह प्रोटोकॉल ट्रांसएपिथेलियल इलेक्ट्रिकल रेजिस्टेंस (टीईईआर) माप और प्रकाश माइक्रोस्कोपी के माध्यम से मोनोलेयर की संरचनात्मक अखंडता का आकलन करने के तरीकों का वर्णन करता है। अंत में, (3) पारगम्यता प्रायोगिक प्रोटोकॉल प्रयोगात्मक परिणामों के कृत्रिम परिवेशीय सत्यापन सहित एक प्रयोग से सीधे पहले के कार्यों का वर्णन करता है।
कुल मिलाकर, कैनाइन ऑर्गेनॉइड मॉडल, एक दोहरे कक्ष सेल संस्कृति प्रौद्योगिकी के साथ संयुक्त, 2 डी प्रयोगात्मक मॉडल से जुड़ी सीमाओं को दूर करता है, जिससे कुत्ते और मानव रोगी दोनों में चिकित्सीय दवा उम्मीदवारों की स्पष्ट मौखिक पारगम्यता की भविष्यवाणियों की विश्वसनीयता में सुधार होता है।

कैनाइन ऑर्गेनोइड की संस्कृति के लिए मानक संचालन प्रक्रियाओं को पहले33 वर्णित किया गया था, और इस विशेष अंक38 में कैनाइन ऑर्गेनोइड प्रोटोकॉल पर भी विस्तार से चर्चा की गई है। पारगम्य समर्थन पर सुसंस्कृत कैनाइन आंतों के ऑर्गेनोइड को मोनोलेयर और सेल आबादी के माइक्रोएनाटॉमी की जांच करने के लिए तय और पैराफिन-एम्बेडेड किया गया था। पैराफिन-एम्बेडिंग प्रक्रिया पर पहले गेब्रियल एट अल 38 द्वारा चर्चा की गई थी। नियमित धुंधला (हेमटॉक्सिलिन और ईओसिन) का प्रदर्शन किया गया है, और कैनाइन ऑर्गेनॉइड मोनोलेयर ( चित्रा 7 देखें) में गोब्लेट कोशिकाओं का पता लगाने के लिए एल्सियन ब्लू धुंधला तकनीक का उपयोग किया गया था।
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63612/63612fig07.jpg"> चित्रा 7: कैनाइन आंतों के ऑर्गेनॉइड मोनोलेयर धुंधला हो जाना। पारगम्य समर्थन में कॉलोनिक मूल के कैनाइन आंतों के ऑर्गेनोइड पैराफिन-एम्बेडेड और एच एंड ई और एबी के साथ दाग दिए गए हैं प्रतिनिधि छवियों को 40x (ए) और 60x (बी) आवर्धन पर प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके लिया गया था। एच एंड ई धुंधला एक स्तंभ उपकला मोनोलेयर का पता चलता है, और कोशिकाओं के एपिकल भाग में माइक्रोविली को 60x आवर्धन पर देखा जा सकता है। एबी धुंधला आगे कुत्ते आंतों के ऑर्गेनोइड मोनोलेयर में गोबलेट कोशिकाओं (गहरे नीले) की उपस्थिति का खुलासा करता है। स्केल सलाखों = 20 μm (A), 50 μm (B)। संक्षिप्त नाम: एच एंड ई = हेमटॉक्सिलिन और ईओसिन; एबी = एल्सियन ब्लू। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/63612fig07large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a>
पारगम्यता प्रयोग के लिए तैयार होने के लिए पारगम्य समर्थन पर ऑर्गेनोइड संस्कृति को 10 से 14 दिनों के लिए उगाया जाना चाहिए। दवा उम्मीदवारों की पारगम्यता परीक्षण के लिए ऑर्गेनोइड संस्कृति की तत्परता की पुष्टि करने के लिए टीईईआर मूल्य माप के साथ संयोजन के रूप में प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग किया जाता है। स्वस्थ और रोगग्रस्त जानवरों से विभिन्न कुत्ते आंतों के ऑर्गेनॉइड मोनोलेयर की प्रतिनिधि प्रकाश सूक्ष्म छवियां चित्रा 8 में प्रस्तुत की गई हैं।
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63612/63612fig08.jpg"> चित्रा 8: कैनाइन आंतों के ऑर्गेनॉइड मोनोलेयर माइक्रोस्कोपी। प्रकाश माइक्रोस्कोपी के तहत देखे गए बढ़ते मोनोलेयर की छवियां। स्वस्थ दाताओं से प्राप्त ऑर्गेनोइड मोनोलेयर को जेजुनल एंटरॉइड (10x; 40x) और कॉलोनॉइड (20x; 40x) संस्कृतियों द्वारा दर्शाया जाता है। रोगग्रस्त दाताओं के ऑर्गेनोइड मोनोलेयर को ग्रहणी (5x; 10x) और इलियल (5x; 10x) एंटरॉइड्स द्वारा दर्शाया जाता है जो पीएलई के निदान वाले कुत्ते के रोगी से प्राप्त होते हैं। दोनों पीएलई ऑर्गेनोइड संस्कृतियां ऑर्गेनोइड के बोने के दौरान अनुचित सेल अलगाव के उदाहरण हैं, और इन संस्कृतियों का उपयोग 3 डी ऑर्गेनोइड की उपस्थिति के कारण दवा पारगम्यता परख के लिए नहीं किया जा सकता है। उचित मोनोलेयर गठन से विचलन के उदाहरण, जैसे मोनोलेयर आँसू (5x), जैविक नमूनों के लापरवाह हेरफेर के कारण होते हैं। ऑर्गेनोइड्स (10x; 20x) की लंबी संस्कृति डालने पर ऑर्गेनोइड के लंबे रखरखाव के कारण होती है जब ऑर्गेनोइड अपनी मूल 3 डी संरचना से मिलते जुलते होने लगते हैं। तुलना के लिए, दवा पारगम्यता अध्ययन के लिए आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले पारगम्य समर्थन पर पारंपरिक 2 डी सेल लाइनों की छवियां प्रस्तुत की जाती हैं (एमडीसीके -10 एक्स; 40 एक्स, और कैको -2-10 एक्स; 20 एक्स)। संक्षिप्त नाम: पीएलई = प्रोटीन खोने वाली एंटरोपैथी; एमडीसीके = मैडिन-डार्बी कैनाइन किडनी। स्केल बार = 500 μm (5x), 200 μm (10x), 100 μm (20x), 50 μm (40x)। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/63612fig08large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a>
फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) में 3% पैराफॉर्मलडिहाइड -3% ग्लूटाराल्डिहाइड में ऑर्गेनोइड मोनोलेयर भी तय किए गए थे। पारगम्य समर्थन पर ऑर्गेनोइड संस्कृति के अल्ट्रास्ट्रक्चर को चिह्नित करने के लिए ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम) का उपयोग किया गया था। माइक्रोविली और तंग जंक्शनों की माइक्रोएनाटोमिकल संरचनाओं को चित्र 9 में देखा जा सकता है।
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63612/63612fig09.jpg"> चित्रा 9: स्वस्थ कुत्ते आंतों के ऑर्गेनॉइड मोनोलेयर की टीईएम छवियां। टीईएम का उपयोग जेजुनल (ए), इलियल (बी), और कॉलोनिक (सी) ऑर्गेनोइड मोनोलेयर के सेलुलर माइक्रोआर्किटेक्चर को प्रकट करने के लिए किया गया था। पारगम्य समर्थन डालने की माइक्रोपोरस झिल्ली को पीले तीर के साथ चिह्नित किया जाता है। माइक्रोविली (नीला तीर) और तंग जंक्शनों (लाल तीर) की उपस्थिति छवियों में चित्रित की गई है। संक्षिप्त नाम: टीईएम = ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी। स्केल सलाखों = 5 μm (ए), 2 μm (बी, सी)। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/63612fig09large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a>
टीईईआर माप और प्रकाश माइक्रोस्कोपी दोनों को यह सुनिश्चित करने के लिए किया जाना चाहिए कि सिस्टम पारगम्यता परीक्षण के लिए तैयार है। टीईईआर एक स्थिर अवस्था में पहुंचने पर परख उपयोग के लिए तैयार है, जबकि प्रकाश माइक्रोस्कोपी ऑर्गेनोइड के नुकसान या अतिवृद्धि को बाहर करने में मदद करेगी। कैनाइन जेजुनल एंटरॉइड्स और कॉलोनोइड्स से युक्त पांच समूहों के विशिष्ट टीईईआर माप का सारांश चित्रा 6 में प्रस्तुत किया गया है।
तालिका 1: ऑर्गेनोइड मीडिया और एफएए की संरचना। सीएमजीएफ +, सीएमजीएफ + आर /जी, और एफएए की पूरी संरचना को इस तालिका में संक्षेप में प्रस्तुत किया गया है। संक्षिप्त नाम: रॉक = आरएचओ से जुड़े किनेज; जीएससीआईβ = ग्लाइकोजन सिंथेज़ किनेज बीटा; सीएमजीएफ + आर/जी = रॉक अवरोधक और जीएसकेआईβ के साथ बढ़ाए गए विकास कारकों के साथ पूर्ण माध्यम; सीएमजीएफ + = विकास कारकों के साथ पूर्ण माध्यम लेकिन रॉक अवरोधक या जीएसकेआईβ के बिना; एफएए = फॉर्मलिन-एसिटिक एसिड-अल्कोहल; ईजीएफ = एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर। यह तालिका 38 से अनुकूलित है। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/Table%201%20(8).xlsx" target="_blank">कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।</a>
पूरक तालिका 1: पारगम्य समर्थन प्रणाली के कुत्ते ऑर्गेनोइड पर नोट लेने के लिए तालिका। संक्षिप्त नाम: टीईईआर = ट्रांसएपिथेलियल विद्युत प्रतिरोध; रॉक = रो-जुड़े किनेज; जीएससीआईβ = ग्लाइकोजन सिंथेज़ किनेज बीटा; सीएमजीएफ + आर/जी = रॉक अवरोधक और जीएसकेआईβ के साथ बढ़ाए गए विकास कारकों के साथ पूर्ण माध्यम; सीएमजीएफ + = विकास कारकों के साथ पूर्ण माध्यम लेकिन रॉक अवरोधक या जीएसकेआईβ के बिना। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/Supplementary%20Table%201%20(1).xlsx" target="_blank">कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।</a>

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Canine Intestinal Organoids in a Dual-Chamber Permeable Support System

यहां, हम एक दोहरे कक्ष, पारगम्य समर्थन प्रणाली में कुत्ते आंतों के ऑर्गेनोइड की संस्कृति का वर्णन करने वाला एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। पारगम्य समर्थन, मोनोलेयर रखरखाव और बाद में दवा पारगम्यता प्रयोगों में ऑर्गेनोइड सीडिंग का वर्णन किया गया है।

एक दोहरी चैंबर पारगम्य समर्थन प्रणाली में कैनाइन आंतों के ऑर्गेनोइड

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