Name: canine intestinal organoids in a dual-chamber permeable support system
Uploaded: 2022-03-02T13:00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Canine Intestinal Organoids in a Dual-Chamber Permeable Support System at JoVE.com

Vogliamo esprimere gratitudine ai dipendenti del Veterinary Diagnostic Laboratory della Iowa State University, vale a dire Haley Lambert, Emily Rahe, Rosalyn Branaman, Victoria Green e Jennifer Groeltz-Thrush, per la tempestiva elaborazione dei campioni. Vorremmo anche ringraziare Jodi Smith e Bethann Valentine per aver fornito materiale per gli esperimenti di permeabilità. Vogliamo anche ringraziare David Diaz-Reganon per il suo aiuto con la Figura 9. Ad eccezione della Figura 6, tutte le figure sono state create in BioRender.com. Gli autori desiderano riconoscere il supporto di Faculty Startup, ISU VPR Miller Award, ISU VPR Miller Award e NSF SBIR subaward a ISU # 1912948.

K. Allenspach è co-fondatore di LifEngine Animal Health e 3D Health Solutions. È consulente per Ceva Animal Health, Bioiberica, LifeDiagnostics, Antech Diagnostics, Deerland Probiotics e Mars. J.P. Mochel è co-fondatore di LifEngine Animal Health e 3D Health Solutions e funge da consulente per Ceva Animal Health ed Ethos Animal Health. Questo articolo riflette le opinioni degli autori e non deve essere interpretato in modo da rappresentare l'approvazione, il punto di vista o le politiche della Food and Drug Administration. Altri autori non hanno alcun conflitto di interessi da dichiarare.

Le colture organoidi intestinali canine nell'apparato di supporto permeabile sono un concetto unico che collega i tradizionali saggi di permeabilità ai farmaci40 con un nuovo modello canino in vitro 41. Diversi tipi di organoidi intestinali canini possono essere utilizzati e valutati in base all'obiettivo dell'esperimento con aggiustamenti minimi. Si raccomanda di testare più concentrazioni del farmaco di interesse in 3-4 pozzetti per gruppo. Le concentrazioni possono essere basate sulla concentrazione intestinale prevista del farmaco. Inoltre, l'utilizzo di ricerche precedenti può aiutare a determinare i punti temporali appropriati per il disegno dello studio. Dovrebbe essere fatta un'adeguata documentazione del progetto di studio per aumentare la replicabilità e assistere nella risoluzione dei problemi.
Questa tecnologia ha diverse limitazioni a causa della novità del metodo42, principalmente a causa della mancanza di standardizzazione nella progettazione sperimentale e nell'esecuzione del protocollo tra i laboratori. Questa mancanza di standardizzazione è stata riconosciuta da altri gruppi43 e i protocolli monostrato organoide 3D canino porteranno alla riproducibilità interlaboratorio e introdurranno la standardizzazione in questo sistema. Gli approcci standardizzati all'analisi dei dati migliorano la replicabilità e possono rafforzare i risultati dei test preliminari sui farmaci utilizzando gli organoidi canini nel sistema di supporti permeabili in diversi laboratori. Il modello organoide 3D canino manca anche di set di dati che confrontano i valoridell'app P in vitro dei farmaci modello con il loro noto assorbimento intestinale umano o canino in vivo, proprio come le cellule Caco-2 44,45,46. Una volta che tali dati sono stati generati, questo modello di organoide canino può essere utilizzato per valutare la permeabilità intestinale durante lo sviluppo del farmaco.
È fondamentale prestare attenzione quando si seminano gli organoidi sul sistema di supporto permeabile per seminare una densità sufficientemente elevata di cellule opportunamente dissociate. I valori TEER del sistema sono più affidabili e riproducibili se coltivati in monostrati rigorosi. La coltura prolungata dei monostrati può portare ad un aumento esponenziale dei valori TEER che vanno oltre i valori fisiologici dell'intestino. Le sezioni H & E di tali strutture 3D mostrano quindi diversi strati di cellule l'una sopra l'altra con strutture alterate di enterociti più vicini alla membrana.
Dopo l'espansione riuscita del monostrato organoide intestinale canino, i risultati possono essere analizzati allo stesso modo dei tradizionali saggi cellulari 2D calcolando il coefficiente di permeabilità apparente di un farmaco (Papp) formula44. Il valoredell'app P (vedere Eq (2)) descrive la velocità di trasporto attraverso il monostrato cellulare47.
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63612/63612eq02.jpg" style="margin: auto;"> (2)
È <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63612/63612eq03.jpg" style="margin: auto;"> la pendenza iniziale della concentrazione rispetto alla curva temporale (ad esempio, nmol/s). A è l'area dell'inserto (cm2) e C0 è la concentrazione iniziale del farmaco o del composto nella camera del donatore37. Il riconoscimento affidabile dell'integrità del monostrato è una parte cruciale del test di permeabilità che richiede la standardizzazione. La microscopia ottica e le misurazioni TEER sono raccomandate per valutare gli organoidi canini in un sistema di supporto permeabile e aiutare a determinare i tempi corretti dell'esperimento. Inoltre, i marcatori di permeabilità molecolare zero (ad esempio, FITC-destrano, giallo Lucifero, PEG-400) possono essere utilizzati per valutare funzionalmente l'integrità del monostrato organoide. Bisogna prestare attenzione se il composto testato è interessato da un trasportatore. La glicoproteina P (P-gp) viene utilizzata come esempio comune di pompa di efflusso. Deve essere generato un rapporto di efflusso (app P, bl-AP / Papp, AP-BL) rispetto a un noto substrato della sonda P-gp.
La microscopia ottica (semplice o potenziata con contrasto di fase) è un metodo inestimabile per verificare l'integrità del monostrato 2D o 3D e dell'inserto del filtro, valutando al contempo la possibile crescita eccessiva cellulare. La Figura 7 può servire come guida per riconoscere le colture di cellule organoidi intestinali canine sane. I valori teer sono una misura importante della formazione delle giunzioni intercellulari e della differenziazione delle colture organoidi in un epitelio intestinale intatto. Gli organoidi intestinali canini si differenziano in enterociti e cellule caliciformi (Figura 6). Queste cellule produttrici di muco consentono lo studio delle interazioni farmaco-muco, che è stato difficile da ottenere utilizzando le tradizionali colture cellulari 2D48. La presenza di cellule enteroendocrine è stata precedentemente confermata negli organoidi intestinali canini da Chandra et al.33.
Viene fornita un'ulteriore caratterizzazione dei monostrati organoidi canini derivati da organoidi digiunali, ileali e del colon utilizzando TEM. Le immagini TEM mostrano la microarchitettura cellulare, comprese le giunzioni strette e la formazione di microvilli, illustrando ulteriormente la complessità e l'utilità di questi modelli organoidi nella medicina traslazionale. Sulla base dei risultati sperimentali, le colture organoidi sul supporto permeabile erano pronte per la sperimentazione tra i giorni 11 e il giorno 13 dopo la semina (Figura 9). I valori TEER in questo momento variavano tra 1.500 e 2.500 Ω,cm2. La fase di plateau dei valori TEER dura per un periodo di tempo molto limitato in cui l'esperimento deve essere avviato prima che i valori TEER inizino a diminuire lentamente. I valori TEER possono anche essere una parte cruciale della visualizzazione di importanti risultati sperimentali in quanto alcuni farmaci o eccipienti di prodotti farmaceutici possono interagire con il monostrato (ad esempio, giunzioni strette), il che può influire notevolmente sulle letture del valore TEER. Questo da solo può servire come dati per un esperimento.
Gli organoidi intestinali canini in un apparato di coltura cellulare a doppia camera possono essere applicati in campi diversi dalla permeabilità orale ai farmaci a causa dell'architettura unica del monostrato cellulare risultante. Ad esempio, possono essere utilizzati nella ricerca microbiologica (ad esempio, l'impatto dell'alterazione della flora microbica gastrointestinale), studi di assorbimento virale, interazioni farmaco-farmaco e meccanismi di trasporto dei farmaci49. La camera del donatore è in genere riempita con il farmaco o il composto di scelta e le aliquote dalla camera ricevente vengono prese in vari punti temporali. Queste aliquote possono essere analizzate utilizzando cromatografia liquida ad alte prestazioni, spettrometria di massa, saggio immunoassorbente enzimatico o altre tecniche per determinare la quantità e la velocità con cui il soluto permea attraverso il monostrato.
Questi studi richiedono un monostrato intatto per valutare accuratamente la permeabilità al farmaco. Ciò richiede in genere la crescita di monostrati in eccesso rispetto a quelli necessari per tenere conto dei pozzi inutilizzabili. I monostrati di cellule organoidi possono anche essere utilizzati per misurare l'assorbimento virale dal lato apicale o basale di un monostrato, con letture che includono saggi di immunofluorescenza che utilizzano anticorpi per rilevare l'assorbimento cellulare del virus. Infine, più farmaci (cioè substrato e inibitore) possono essere applicati alla camera del donatore per identificare le interazioni farmaco-farmaco basate sul trasportatore.
Sulla base delle osservazioni attuali, questi metodi non saranno solo applicabili agli organoidi canini negli inserti di coltura, ma saranno adatti anche ad altre specie veterinarie e sistemi di organi, con piccole modifiche necessarie per adattarsi al meglio alla specie o al modello di organo scelto. I protocolli per la crescita degli organoidi intestinali canini dovevano essere regolati in base alle proprietà uniche della coltura. Pertanto, il protocollo può essere adattato a un'altra specie, ma richiederà sottili modifiche al protocollo. Le modifiche possono iniziare con cambiamenti nella densità di semina cellulare e espandersi in cambiamenti nella composizione dei media per differenziare correttamente gli organoidi di interesse.
La standardizzazione, la documentazione dettagliata delle procedure sperimentali e il monitoraggio coerente dei monostrati cellulari sono pratiche cruciali necessarie attraverso i saggi di supporto permeabili e non sono limitate al sistema canino. Queste possibili modifiche di specie o organi sono fondamentali per documentare e riferire per ulteriori progressi nel campo. Questo modello ha diverse limitazioni, ad esempio i suoi requisiti di costo, la variabilità interlaboratorio e i dati limitati sulla capacità di prevedere l'assorbimento intestinale in vivo. I cani, in alcuni casi, possiedono diversi trasportatori di droga ed enzimi metabolizzanti rispetto agli esseri umani50.
Inoltre, il sistema organoide canino deve essere testato su una varietà di altri apparecchi a doppia camera di altri produttori per determinare l'idoneità di tale modello (ad esempio, deve essere determinata l'idoneità di diverse composizioni di membrane filtranti). Un altro svantaggio è che la parte dell'esperimento di permeabilità al farmaco del manoscritto è meno descrittiva rispetto alle parti precedenti. Ciò è causato da un eccesso di informazioni in questo campo. L'obiettivo di questa parte del manoscritto era quello di descrivere questi metodi in modo modificabile senza tagliare i bordi dei capisaldi di questi esperimenti. Informazioni più dettagliate sugli esperimenti di permeabilità sono state raccolte da Hubatsch et al.37. Inoltre, gli inserti permeabili possono essere utilizzati negli esperimenti di cocoltura, migrazione cellulare e analisi di invasione4.
In conclusione, gli organoidi intestinali canini negli apparati di coltura a doppia camera hanno il potenziale per essere utilizzati in una vasta gamma di applicazioni, tra cui campi biomedici e medicina traslazionale, per citarne alcuni. I protocolli creano diverse strategie per pianificare un esperimento e promuovere l'affidabilità dei dati interlaboratorio per i modelli organoidi in tutto il campo della biologia.

I sistemi di supporto permeabili sono tipicamente utilizzati per determinare l'apparente permeabilità dei farmaci terapeutici candidati attraverso la barriera epiteliale intestinale 1,2. Possono anche essere impiegati per valutare la secrezione cellulare3, la migrazione cellulare4 e la tossicità del farmaco5. I saggi di permeabilità orale in vitro dei farmaci sono un passo chiave nel processo di scoperta e sviluppo dei farmaci2, con singoli farmaci candidati testati nella fase iniziale del ciclo di vita di ricerca e sviluppo dei farmaci6. Il sistema di supporto permeabile è un apparato di coltura cellulare a doppia camera costituito da un inserto con una membrana semiporosa posta in una piastra multiwell. Questo sistema consente l'accesso diretto ai lati apicale e basolaterale di una cellula-monostrato cresciuta nell'inserto7. Il monostrato utilizzato in questi sistemi è tipicamente derivato da cellule epiteliali gastrointestinali (ad esempio, linea cellulare Caco-2 dell'adenocarcinoma del colon-retto umano)8. Le colture cellulari crescono in uno stato polarizzato imitando la microarchitettura naturale delle cellule epiteliali intestinali, consentendo un'ulteriore differenziazione cellulare, microanatomia simile e funzione7. I dettagli dell'inserto di supporto permeabile sono disponibili nella Figura 1. La semina degli inserti con colture cellulari 2D, tradizionalmente utilizzata per valutare la permeabilità intestinale ai farmaci, è relativamente conveniente e facile dacoltivare 9. Questi sistemi presentano diverse limitazioni importanti, tra cui la loro limitata capacità di prevedere il metabolismo intestinale dei farmaci terapeutici candidati10,11. Questo è vero per tutti i meccanismi di assorbimento dei farmaci, sia che si tratti di assorbimento passivo attraverso le giunzioni strette tra le cellule epiteliali, assorbimento transepiteliale attivo attraverso l'efflusso o trasportatori di assorbimento (ad esempio, P-glicoproteina, trasportatore monocarbossilato 1) e farmaci che vengono metabolizzati dagli enterociti.
I cani condividono un ambiente e una dieta comuni con gli esseri umani12. L'anatomia intestinale canina e la composizione del microbioma assomigliano molto a quella degli esseri umani13, che è stata attribuita all'addomesticamento e alle diete condivise negli ultimi 36.000 anni14. Sfortunatamente, queste somiglianze possono anche essere cause / fattori scatenanti comuni per lo sviluppo della malattia. I cani sviluppano morbilità croniche simili all'uomo, come l'obesità15, la malattia infiammatoria intestinale16, l'adenocarcinomacolorettale 17, il tumore stromale gastrointestinale (GIST)18 e varie altre patologie associate alla loro relativa longevità19. Di conseguenza, gli organoidi canini possono essere utilizzati con successo per la ricerca traslazionale inversa di queste malattie croniche multifattoriali nello spirito della One Health Initiative20.
Le cellule Caco-2 sono le linee cellulari più utilizzate per i saggi di assorbimento orale dei farmaci21. Queste cellule sono attualmente considerate il modello "gold standard" per i saggi di permeabilità intestinale in vitro 2,22,23. La linea cellulare Caco-2 esprime trasportatori di efflusso e assorbimento presenti nel tratto intestinale umano, sebbene a diversi livelli di espressione 24,25,26. Le cellule caco-2 sono anche ampiamente utilizzate come modelli per determinare se un farmaco è un substrato o un inibitore dei trasportatori di efflusso intestinale22,27. Sebbene le cellule Caco-2 siano di origine colonica, imitano una cellula enterocitaria. Sfortunatamente, le cellule Caco-2 rappresentano solo un tipo di cellula dallo strato epiteliale dell'intestino tenue9, che non riesce a ricapitolare accuratamente la complessa composizione del tipo di cellula epiteliale intestinale. Ad esempio, le cellule calici dedicate alla produzione di muco sono assenti dalle colture Caco-2 in modo tale che le interazioni muco-farmaco non possono essere valutate senza cocoltura con altre linee cellulari28. Inoltre, le colture di Caco-2 non esprimono molti degli importanti recettori nucleari tipicamente presenti nell'intestino, come il recettore X della gravidanza (PXR), il recettore X steroideo (SXR) e il recettore costitutivo dell'androstano (CAR)29. Di conseguenza, le colture di Caco-2 non riescono a modellare l'induzione di trasportatori di farmaci ed enzimi da parte di alcuni farmaci che sono induttori di questi recettori (ad esempio, rifampicina)30.
La tecnologia organoide intestinale 3D affronta alcune di queste limitazioni19. Gli organoidi sono costrutti autoassemblati derivati da cellule staminali adulte che possono essere stabiliti da campioni di tessuto raccolti utilizzando tecniche microinvasive20. Le cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo vengono impiegate per i modelli di permeabilità intestinale31,32. Gli organoidi canini forniscono un'alternativa rilevante agli organoidi umani perché la ricerca sulle cellule staminali umane è limitata da questioni etiche33. Inoltre, gli organoidi canini forniscono un sistema in vitro per esplorare la permeabilità dei farmaci canini, il metabolismo, il trasporto attivo e le interazioni farmaco-farmaco. Per colmare questa lacuna tecnologica, è stata descritta la crescita costante e affidabile di organoidi intestinali canini in un sistema di supporto permeabile34. Un test di permeabilità con organoidi intestinali canini può potenzialmente predire la permeabilità intestinale canina e il metabolismo di piccole molecole di farmaci rispetto ai saggi attualmente utilizzati (Caco-2). La conferma di queste caratteristiche cardine presta questo nuovo sistema in vitro al lavoro futuro che esplora il potenziale impatto degli induttori sul metabolismo intracellulare e sul trasporto attivo.
Gli organoidi canini sono composti da tutti i tipi di cellule tipicamente presenti nello strato epiteliale dell'intestino. Da un punto di vista funzionale e microanatomico, replicano in modo affidabile l'ambiente dello strato epiteliale dell'intestino canino19,35. Inoltre, la presenza di muco, trasportatori di farmaci ed enzimi specifici per cani e la differenziazione cellulare complessiva negli organoidi intestinali canini è paragonabile a quanto osservato in vivo nei cani34. Pertanto, gli organoidi possono essere isolati da pazienti veterinari malati e utilizzati per modellare l'effetto di vari processi patologici (ad esempio, infiammazione intestinale cronica) sulla permeabilità ai farmaci orali canini19,36. Il sistema organoide intestinale canino può essere utilizzato anche in contesti diversi dagli esperimenti di permeabilità ai farmaci. Queste strutture 3D possono anche essere isolate da pazienti malati come precedentemente descritto da Chandra et al. per la malattia infiammatoria intestinale, l'adenocarcinoma del colon-retto e il tumore stromale gastrointestinale19.
Il Permeable Support Seeding Protocol descrive i metodi per stabilire colture organoidi intestinali canine negli inserti. Questo primo protocollo delinea i metodi per dissociare le colture organoidi canine stabilite placcate nella matrice della membrana extracellulare. Inoltre, la precoating degli inserti con collagene I e la matrice di membrana extracellulare è discussa in questo protocollo. Anche l'incorporamento di organoidi canini negli inserti di supporto permeabili è descritto in dettaglio.
Il secondo protocollo è il Monolayer Maintenance Protocol, che include la manutenzione generale degli organoidi 3D canini placcati in un inserto. La frequenza e i volumi dei mezzi organoidi utilizzati per rinfrescare la coltura e i modi per prevenire il danno da coltura cellulare sono presentati in questo secondo protocollo, insieme a metodi sperimentali per valutare la confluenza del monostrato epiteliale.
Infine, il protocollo sperimentale di permeabilità si concentra sui modi per determinare se gli organoidi 3D intestinali canini in un test di permeabilità sono pronti per l'uso sperimentale e le fasi di verifica necessarie prima di condurre qualsiasi esperimento. Questa sezione descrive anche l'impostazione e l'esecuzione di successo di un esperimento di permeabilità, insieme all'incubazione e al campionamento di farmaci candidati terapeutici nelle camere della coltura monostrato. Viene anche discusso l'uso dell'isotiocianato di fluoresceina a bassa permeabilità (FITC-destrano) per monitorare l'integrità del monostrato. Infine, viene descritto un metodo di valutazione in vitro per convalidare i risultati dopo la conclusione di un esperimento. Gli esperimenti di permeabilità sono un argomento estremamente vasto e sono molto ben riassunti da Hubatsch et al.37. Il flusso di lavoro dei protocolli è riepilogato nella Figura 2.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63612/63612fig01.jpg"> Figura 1: Organoidi intestinali canini su un sistema di supporto permeabile. L'inserto di supporto permeabile è posizionato in un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti. La membrana microporosa consente la semina di organoidi intestinali canini dissociati e queste cellule alla fine formeranno un monostrato organoide 2D. Questa tecnologia consente l'accesso a entrambi i lati AP e BL del monostrato. Il mezzo organoide viene introdotto in entrambe le camere AP e BL del supporto permeabile. Vengono illustrati l'assorbimento (AP→BL) e la secrezione (BL→AP) del farmaco candidato, nonché due possibili modalità di trasporto del farmaco. Abbreviazioni: AP = apicale; BL = basolaterale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/63612fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63612/63612fig02.jpg"> Figura 2: Flusso di lavoro dei protocolli di supporto permeabili agli organoidi canini. L'inserto di supporto permeabile viene precoato con una miscela della matrice di membrana extracellulare e collagene I e incubato per 1 ora. Durante il processo di incubazione, la coltura organoide viene dissociata. Le singole cellule organoidi vengono seminate nell'inserto, il mezzo nella camera basolaterale viene aggiunto immediatamente dopo la semina, mentre il mezzo alla camera apicale viene aggiunto 24 ore dopo la conclusione del processo di semina. La manutenzione e il monitoraggio degli organoidi includono cambi regolari del mezzo, misurazioni del valore TEER e microscopia ottica per valutare l'integrità del monostrato. Prima dell'esperimento, gli organoidi devono essere differenziati rimuovendo l'inibitore ROCK e GSKiβ dal mezzo. I valori TEER vengono misurati il giorno dell'esperimento e il monostrato organoide viene ispezionato tramite microscopia ottica per danni alle cellule. Il mezzo viene quindi scambiato con un buffer appropriato e incubato prima dell'esperimento. Il test FITC-destrano viene utilizzato durante gli esperimenti di permeabilità intestinale39 come marcatore di integrità monostrato. Le misurazioni TEER vengono effettuate dopo l'esperimento e la microscopia ottica convaliderà i risultati dopo 24 ore. Abbreviazioni: TEER = resistenza elettrica transepiteliale; ROCK = chinasi rho-associata; GSKiβ = glicogeno sintasi chinasi beta; F = fluorescenza. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/63612fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Organoid media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;ROCK inhibitor (Y-27632)</td>
			<td>EMD Millipore Corp.</td>
			<td>SCM 075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[Leu15]-Gastrin I human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9145-.5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-83-01</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>9094360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>glutamine substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>J848-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human R-Spondin-1</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>120-38-500UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine EGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-09-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Noggin</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>250-38-250UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Wnt-3a</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-20-10UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetyl-L-cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9165-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0636-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190 (P38 inhibitor)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7067-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemolecule CHIR99021 (GSK3&#946;)</td>
			<td>Reprocell</td>
			<td>04-0004-base</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMS (trimethoprim sulfate)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7883-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid, Glacial</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A38-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alpha-D(+)-Glucose, 99+%, anhydrous</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>170080010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, Rat Tail 3 mg/mL</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A10483-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-CM-Dextran</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>68059-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde (37%)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>F79P-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (1x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Matrix For Organoid Culture</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356255</td>
			<td>Extracellular Membrane Matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 97%</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 1x (Phosphate-Buffered Saline)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604-021</td>
			<td>Trypsin-like Protease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials and Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9&#34; Pasteur Pipets</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-678-6B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Transwell 6.5 mm Polyester Membrane Inserts Preloaded in 24-Well Culture Plates, Pore Size: 0.4 &#181;m, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3470</td>
			<td>Permeable Support</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell ERS (Probes)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MERSSTX01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell ERS-2 Voltohmmeter</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MERS00002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panasonic incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-170ML-PA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M Wrapping Film</td>
			<td>Bemis Company Inc</td>
			<td>PM996/EMD</td>
			<td>Flexible Laboratory Film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Plate 24 wells</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB012929</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

canine intestinal organoids in a dual-chamber permeable support system

Il sistema di supporto permeabile viene tipicamente utilizzato in combinazione con le tradizionali linee cellulari bidimensionali (2D) come strumento in vitro per valutare la permeabilità orale di nuovi farmaci terapeutici candidati. Tuttavia, l'uso di queste linee cellulari convenzionali ha limitazioni, come l'espressione alterata di giunzioni strette, la differenziazione parziale delle cellule e l'assenza di recettori nucleari chiave. Nonostante queste carenze, i modelli Caco-2 e MDCK sono ampiamente accettati e convalidati per la previsione della permeabilità orale umana in vivo .
I cani sono un modello traslazionale rilevante per la ricerca biomedica a causa delle loro somiglianze nell'anatomia gastrointestinale e nella microflora intestinale con gli esseri umani. Di conseguenza, e a sostegno dello sviluppo parallelo di farmaci, è altamente auspicabile l'elaborazione di uno strumento in vitro efficiente e accurato per prevedere le caratteristiche di permeabilità dei farmaci in vivo sia nei cani che nell'uomo. Tale strumento potrebbe essere il sistema organoide intestinale canino, caratterizzato da strutture epiteliali tridimensionali (3D), autoassemblate derivate da cellule staminali adulte.
Il (1) Permeable Support Seeding Protocol descrive i metodi sperimentali per la dissociazione e la semina di organoidi canini negli inserti. L'isolamento, la coltura e la raccolta degli organoidi canini sono stati precedentemente descritti in una serie separata di protocolli in questo numero speciale. I metodi per il mantenimento generale del monostrato organoide intestinale canino sono discussi a fondo nel (2) Protocollo di mantenimento del monostrato. Inoltre, questo protocollo descrive i metodi per valutare l'integrità strutturale del monostrato tramite misurazioni della resistenza elettrica transepiteliale (TEER) e microscopia ottica. Infine, il (3) Protocollo sperimentale di permeabilità descrive i compiti che precedono direttamente un esperimento, compresa la convalida in vitro dei risultati sperimentali.
Nel complesso, il modello organoide canino, combinato con una tecnologia di coltura cellulare a doppia camera, supera i limiti associati ai modelli sperimentali 2D, migliorando così l'affidabilità delle previsioni dell'apparente permeabilità orale dei farmaci candidati terapeutici sia nel paziente canino che in quello umano.

Le procedure operative standard per la coltura di organoidi canini sono state precedentemente descritte33 e anche il protocollo organoide canino è stato discusso in dettaglio in questo numero speciale38. Gli organoidi intestinali canini coltivati su supporti permeabili sono stati fissati e incorporati in paraffina per esaminare la microanatomia del monostrato e le popolazioni cellulari. Il processo di incorporamento della paraffina è stato precedentemente discusso da Gabriel et al.38. È stata eseguita la colorazione di routine (ematossilina ed eosina) e la tecnica di colorazione Alcian Blue è stata utilizzata per rilevare le cellule del calice nel monostrato organoide canino (vedere Figura 7).
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63612/63612fig07.jpg"> Figura 7: Colorazione monostrato organoide intestinale canino. Gli organoidi intestinali canini di origine colonica nel supporto permeabile sono stati incorporati in paraffina e colorati con H & E e AB. Le immagini rappresentative sono state scattate utilizzando la microscopia ottica con ingrandimento 40x (A) e 60x (B). La colorazione H& E rivela un monostrato epiteliale colonnare e i microvilli nella parte apicale delle cellule possono essere osservati con un ingrandimento di 60x. La colorazione AB svela ulteriormente la presenza di cellule caliciformi (blu scuro) nel monostrato organoide intestinale canino. Barre di scala = 20 μm (A), 50 μm (B). Abbreviazioni: H&E = ematossilina ed eosina; AB = Blu Alciano. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/63612fig07large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
La coltura organoide sul supporto permeabile deve essere coltivata per 10-14 giorni per essere pronta per un esperimento di permeabilità. La microscopia ottica viene utilizzata in combinazione con le misurazioni del valore TEER per confermare la prontezza della coltura organoide per i test di permeabilità dei farmaci candidati. Immagini microscopiche leggere rappresentative di diversi monostrati organoidi intestinali canini di animali sani e malati sono presentate nella Figura 8.
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63612/63612fig08.jpg"> Figura 8: Microscopia monostrato organoide intestinale canina. Immagini di monostrati in crescita viste al microscopio ottico. I monostrati organoidi derivati da donatori sani sono rappresentati da colture enteroidi digiunali (10x; 40x) e colonoidi (20x; 40x). I monostrati organoidi di donatori malati sono rappresentati da enteroidi duodenali (5x; 10x) e ileali (5x; 10x) derivati da un paziente canino con diagnosi di PLE. Entrambe le colture organoidi PLE sono esempi di isolamento cellulare improprio durante la semina di organoidi e queste colture non possono essere utilizzate per saggi di permeabilità ai farmaci a causa della presenza di organoidi 3D. Esempi di deviazioni dalla corretta formazione di monostrato, come le lacrime monostrato (5x), sono causati da una manipolazione non curante dei campioni biologici. La coltura prolungata di organoidi (10x; 20x) è causata dalla lunga manutenzione degli organoidi sull'inserto quando gli organoidi iniziano ad assomigliare alla loro struttura 3D originale. Per confronto, vengono presentate immagini di linee cellulari 2D tradizionali sui supporti permeabili usati comunemente per gli studi di permeabilità ai farmaci (MDCK-10x; 40x e Caco-2-10x; 20x). Abbreviazioni: PLE = enteropatia che perde proteine; MDCK = Rene canino Madin-Darby. Barre di scala = 500 μm (5x), 200 μm (10x), 100 μm (20x), 50 μm (40x). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/63612fig08large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
I monostrati organoidi sono stati fissati anche nel 3% di paraformaldeide-3% di glutaraldeide in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). La microscopia elettronica a trasmissione (TEM) è stata utilizzata per caratterizzare l'ultrastruttura della coltura organoide sui supporti permeabili. Le strutture microanatomiche dei microvilli e le giunzioni strette possono essere viste nella Figura 9.
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63612/63612fig09.jpg"> Figura 9: Immagini TEM di monostrati organoidi intestinali canini sani. TEM è stato utilizzato per rivelare la microarchitettura cellulare di monostrati organoidi digiunale (A), ileale (B) e colonico (C). La membrana microporosa dell'inserto di supporto permeabile è contrassegnata da una freccia gialla. La presenza di microvilli (freccia blu) e giunzioni strette (freccia rossa) è delineata nelle immagini. Abbreviazione: TEM = Microscopia elettronica a trasmissione. Barre di scala = 5 μm (A), 2 μm (B, C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/63612fig09large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Sia le misurazioni TEER che la microscopia ottica devono essere eseguite per garantire che il sistema sia pronto per i test di permeabilità. Il test è pronto per l'uso quando TEER raggiunge uno stato stazionario, mentre la microscopia ottica aiuterà ad escludere danni o crescita eccessiva degli organoidi. Un riassunto delle misurazioni tipiche di TEER di cinque gruppi costituiti da enteroidi e colonidi digiunali canini è presentato nella Figura 6.
Tabella 1: Composizione dei mezzi organoidi e FAA. La composizione completa di CMGF+, CMGF+ R/G e FAA è riassunta in questa tabella. Abbreviazioni: ROCK = rho-associated kinase; GSKiβ = glicogeno sintasi chinasi beta; CMGF + R/G = Mezzo completo con fattori di crescita potenziati con inibitore ROCK e GSKiβ; CMGF+ = Mezzo completo con fattori di crescita ma senza inibitore ROCK o GSKiβ; FAA = formalina-acido acetico-alcol; EGF = fattore di crescita epidermico. Questa tabella è adattata da 38. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/Table%201%20(8).xlsx" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questa tabella.</a>
Tabella supplementare 1: Tabella per prendere appunti sull'organoide canino il sistema di supporto permeabile. Abbreviazioni: TEER = resistenza elettrica transepiteliale; ROCK = chinasi rho-associata; GSKiβ = glicogeno sintasi chinasi beta; CMGF + R/G = Mezzo completo con fattori di crescita potenziati con inibitore ROCK e GSKiβ; CMGF+ = Mezzo completo con fattori di crescita ma senza inibitore ROCK o GSKiβ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/Supplementary%20Table%201%20(1).xlsx" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questa tabella.</a>

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Canine Intestinal Organoids in a Dual-Chamber Permeable Support System

Qui, presentiamo un protocollo che descrive la coltura di organoidi intestinali canini in un sistema di supporto permeabile a doppia camera. Vengono descritti la semina organoide nei supporti permeabili, il mantenimento del monostrato e i successivi esperimenti di permeabilità ai farmaci.

Organoidi intestinali canini in un sistema di supporto permeabile a doppia camera

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