Name: canine intestinal organoids in a dual-chamber permeable support system
Uploaded: 2022-03-02T13:00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Canine Intestinal Organoids in a Dual-Chamber Permeable Support System at JoVE.com

Хотим выразить благодарность сотрудникам Ветеринарно-диагностической лаборатории Университета штата Айова, а именно Хейли Ламберт, Эмили Рахе, Розалин Бранаман, Виктории Грин и Дженнифер Грольц-Дрозд, за своевременную обработку образцов. Мы также хотели бы поблагодарить Джоди Смит и Бетанн Валентайн за предоставление материала для экспериментов по проницаемости. Мы также хотим поблагодарить Дэвида Диас-Реганона за его помощь с рисунком 9. За исключением рисунка 6, все фигуры были созданы в BioRender.com. Авторы хотели бы отметить поддержку со стороны Faculty Startup, ISU VPR Miller Award, ISU VPR Miller Award и NSF SBIR subaward to ISU # 1912948.

К. Алленспах является соучредителем LifEngine Animal Health и 3D Health Solutions. Она является консультантом Ceva Animal Health, Bioiberica, LifeDiagnostics, Antech Diagnostics, Deerland Probiotics и Mars. J.P. Mochel является соучредителем LifEngine Animal Health и 3D Health Solutions и выступает в качестве консультанта Ceva Animal Health и Ethos Animal Health. Эта статья отражает взгляды авторов и не должна толковаться как представляющая одобрение, точку зрения или политику Управления по контролю за продуктами и лекарствами. Другие авторы не имеют никакого конфликта интересов, чтобы заявить.

Кишечные органоидные культуры собак в проницаемом опорном аппарате представляют собой уникальную концепцию, связывающую традиционные анализы проницаемости лекарственного средства40 с новой моделью41 собак in vitro. Различные типы органоидов кишечника собак могут быть использованы и оценены на основе цели эксперимента с минимальными корректировками. Рекомендуется тестирование многократных концентраций интересующего препарата в 3-4 лунках на группу. Концентрации могут основываться на ожидаемой кишечной концентрации препарата. Кроме того, использование предыдущих исследований может помочь определить подходящие временные точки для дизайна исследования. Для повышения воспроизводимости и помощи в устранении неполадок должна быть подготовлена соответствующая документация по дизайну исследования.
Эта технология имеет несколько ограничений из-за новизны метода42, в основном из-за отсутствия стандартизации в экспериментальном проектировании и выполнении протокола в лабораториях. Это отсутствие стандартизации было признано другими группами43, и протоколы 3D-органоидных монослоев для собак приведут к межлабораторной воспроизводимости и введут стандартизацию в эту систему. Стандартизированные подходы к анализу данных улучшают воспроизводимость и могут усилить результаты предварительного тестирования лекарств с использованием собачьих органоидов в системе проницаемых опор в различных лабораториях. В собачьей 3D-органоидной модели также отсутствуют наборы данных, сравнивающие значения in vitro Papp модельных препаратов с их известной кишечной абсорбцией человека или собаки in vivo, подобно клеткам Caco-2 44,45,46. После того, как такие данные были сгенерированы, эта собачья органоидная модель может быть использована для оценки кишечной проницаемости во время разработки препарата.
Крайне важно соблюдать осторожность при посеве органоидов на проницаемую опорную систему, чтобы засеять достаточно высокую плотность соответствующим образом диссоциированных клеток. Значения TEER системы более надежны и воспроизводимы при выращивании в строгих монослоях. Длительное культивирование монослоев может привести к экспоненциальному увеличению значений TEER, достигающих дальнейших физиологических значений кишечника. H&E участки таких 3D-структур затем показывают несколько слоев клеток друг над другом с измененными структурами энтероцитов ближе к мембране.
После успешного расширения монослоя органоидов кишечного кишечника для собак результаты могут быть проанализированы таким же образом, как и традиционные 2D-клеточные анализы, путем расчета коэффициента кажущейся проницаемости лекарственного средства (P app) формулы44. Значениеприложения P (см. Eq (2)) описывает скорость транспорта через сотовый монослой47.
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63612/63612eq02.jpg" style="margin: auto;"> (2)
Начальный <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63612/63612eq03.jpg" style="margin: auto;"> наклон концентрации по отношению к кривой времени (например, нмоль/с). A - площадь вкладыша (см2), а C0 - начальная концентрация лекарственного средства или соединения в донорской камере37. Надежное распознавание целостности монослоя является важной частью анализа проницаемости, требующего стандартизации. Световая микроскопия и измерения TEER рекомендуются для оценки органоидов собак в проницаемой системе поддержки и помогают определить правильное время эксперимента. Кроме того, маркеры нулевой молекулярной проницаемости (например, FITC-декстран, Люцифер желтый, PEG-400) могут быть использованы для функциональной оценки целостности монослоя органоида. Следует обратить внимание, если испытываемое соединение подвергается воздействию транспортера. P-гликопротеин (P-gp) используется в качестве общего примера эффлюксного насоса. Коэффициент эффлюкса должен быть сгенерирован (приложение P, приложение BL-AP / P, ap-BL) со сравнением с хорошо известной подложкой зонда P-gp.
Световая микроскопия (простая или усиленная фазовым контрастом) является бесценным методом проверки целостности 2D или 3D монослоя и фильтрующей вставки при оценке возможного клеточного разрастания. Рисунок 7 может служить руководством по распознаванию здоровых культур органоидных клеток кишечного кишечника. Значения TEER являются важной мерой образования межклеточных соединений и дифференцировки органоидных культур в интактный эпителий кишечника. Органоиды кишечного кишечника собак дифференцируются в энтероциты и бокаловидные клетки (рисунок 6). Эти клетки, продуцирующие слизь, позволяют изучать взаимодействие лекарств и слизи, чего было трудно достичь с использованием традиционных 2D-клеточных культур48. Наличие энтероэндокринных клеток было ранее подтверждено в органоидах кишечника собак Chandra et al.33.
Дана дальнейшая характеристика собачьих органоидных монослоев, полученных из тощей кишки, подвздошной и толстой кишки с использованием ТЭМ. Изображения TEM показывают клеточную микроархитектуру, включая плотные соединения и образование микроворсинок, дополнительно иллюстрируя сложность и полезность этих органоидных моделей в трансляционной медицине. Основываясь на экспериментальных результатах, органоидные культуры на проницаемой опоре были готовы к экспериментам между 11 и 13 днями после посева (рисунок 9). Значения TEER на данный момент времени варьировались от 1 500 до 2 500Ω,см2. Фаза плато значений TEER длится в течение очень ограниченного периода времени, когда эксперимент должен быть начат до того, как значения TEER начнут медленно снижаться. Значения TEER также могут быть важной частью отображения важных экспериментальных результатов, поскольку некоторые лекарственные средства или вспомогательные вещества лекарственного средства могут взаимодействовать с монослоем (например, плотными соединениями), что может значительно влиять на показания значений TEER. Это само по себе может служить данными для эксперимента.
Органоиды кишечного кишечника собак в двухкамерном клеточном культуральном аппарате могут применяться в областях, отличных от пероральной проницаемости лекарственного средства, из-за уникальной архитектуры результирующего клеточного монослоя. Например, они могут быть использованы в микробиологических исследованиях (например, влияние изменения микробной флоры ЖКТ), исследованиях поглощения вирусов, лекарственно-лекарственных взаимодействий и механизмов переноса лекарств49. Донорская камера обычно заполняется испытуемым лекарственным средством или соединением по выбору, и аликвоты из камеры приемника берутся в различные моменты времени. Эти аликвоты могут быть проанализированы с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии, масс-спектрометрии, иммуноферментного анализа или других методов для определения количества и скорости, с которой растворенное вещество проникает через монослой.
Эти исследования требуют интактного монослоя для точной оценки проницаемости препарата. Это, как правило, требует выращивания монослоев сверх тех, которые необходимы для учета непригодных для использования скважин. Монослои органоидных клеток также могут быть использованы для измерения поглощения вируса либо с апикальной, либо с базальной стороны монослоя, с показаниями, включая иммунофлуоресцентные антитела, использующие антитела для обнаружения клеточного поглощения вируса. Наконец, несколько лекарств (т.е. субстрат и ингибитор) могут быть применены к донорской камере для идентификации лекарственно-лекарственных взаимодействий на основе транспортера.
Основываясь на текущих наблюдениях, эти методы будут не только применимы к собачьим органоидам в культуральных вставках, но также будут пригодны для других ветеринарных видов и систем органов с незначительными изменениями, необходимыми для наилучшего соответствия выбранному виду или модели органа. Протоколы роста органоидов кишечного кишечника собак должны были быть скорректированы на основе уникальных свойств культуры. Таким образом, протокол может быть адаптирован к другому виду, но потребует тонких изменений в протоколе. Модификации могут начинаться с изменения плотности посева клеток и расширяться до изменений в составе среды, чтобы правильно дифференцировать органоиды, представляющие интерес.
Стандартизация, подробная документация экспериментальных процедур и последовательный мониторинг клеточных монослоев являются важнейшими практиками, необходимыми для проницаемых опорных анализов, и не ограничиваются собачьей системой. Эти возможные виды или модификации органов имеют решающее значение для документирования и отчетности о дальнейших достижениях в этой области. Эта модель имеет несколько ограничений, например, ее требования к стоимости, межлабораторную изменчивость и ограниченные данные о способности прогнозировать кишечную абсорбцию in vivo. Собаки, в некоторых случаях, обладают другими транспортерами лекарств и метаболизирующими ферментами, чем люди50.
Кроме того, собачья органоидная система должна быть испытана на множестве других двухкамерных аппаратов других производителей для определения пригодности такой модели (например, должна быть определена пригодность различных составов фильтрующих мембран). Другим недостатком является то, что экспериментальная часть рукописи, посвященная лекарственной проницаемости, является менее описательной, чем предыдущие части. Это вызвано избытком информации в этой области. Цель этой части рукописи состояла в том, чтобы описать эти методы модифицируемым образом, не разрезая края краеугольных камней этих экспериментов. Более подробная информация об экспериментах с проницаемостью была собрана Hubatsch et al.37. Кроме того, проницаемые вставки могут быть использованы в экспериментах по кокультуре, миграции клеток и анализу инвазии4.
В заключение, органоиды кишечника собак в двухкамерных культуральных аппаратах имеют потенциал для использования в широком спектре применений, включая биомедицинские области и трансляционную медицину, чтобы назвать несколько. Протоколы создают несколько стратегий для планирования эксперимента и способствуют надежности межлабораторных данных для органоидных моделей в области биологии.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Organoid media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;ROCK inhibitor (Y-27632)</td>
			<td>EMD Millipore Corp.</td>
			<td>SCM 075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[Leu15]-Gastrin I human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9145-.5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-83-01</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>9094360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>glutamine substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>J848-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human R-Spondin-1</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>120-38-500UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine EGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-09-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Noggin</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>250-38-250UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Wnt-3a</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-20-10UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetyl-L-cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9165-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0636-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190 (P38 inhibitor)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7067-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemolecule CHIR99021 (GSK3&#946;)</td>
			<td>Reprocell</td>
			<td>04-0004-base</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMS (trimethoprim sulfate)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7883-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid, Glacial</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A38-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alpha-D(+)-Glucose, 99+%, anhydrous</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>170080010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, Rat Tail 3 mg/mL</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A10483-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-CM-Dextran</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>68059-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde (37%)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>F79P-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (1x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Matrix For Organoid Culture</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356255</td>
			<td>Extracellular Membrane Matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 97%</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 1x (Phosphate-Buffered Saline)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604-021</td>
			<td>Trypsin-like Protease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials and Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9&#34; Pasteur Pipets</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-678-6B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Transwell 6.5 mm Polyester Membrane Inserts Preloaded in 24-Well Culture Plates, Pore Size: 0.4 &#181;m, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3470</td>
			<td>Permeable Support</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell ERS (Probes)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MERSSTX01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell ERS-2 Voltohmmeter</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MERS00002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panasonic incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-170ML-PA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M Wrapping Film</td>
			<td>Bemis Company Inc</td>
			<td>PM996/EMD</td>
			<td>Flexible Laboratory Film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Plate 24 wells</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB012929</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

canine intestinal organoids in a dual-chamber permeable support system

Проницаемая опорная система обычно используется в сочетании с традиционными двумерными (2D) клеточными линиями в качестве инструмента in vitro для оценки пероральной проницаемости новых терапевтических препаратов-кандидатов. Однако использование этих обычных клеточных линий имеет ограничения, такие как измененная экспрессия плотных соединений, частичная дифференцировка клеток и отсутствие ключевых ядерных рецепторов. Несмотря на эти недостатки, модели Caco-2 и MDCK широко приняты и подтверждены для прогнозирования пероральной проницаемости человека in vivo .
Собаки являются актуальной трансляционной моделью для биомедицинских исследований из-за их сходства в анатомии желудочно-кишечного тракта и микрофлоры кишечника с человеком. Соответственно, и в поддержку параллельной разработки лекарств, разработка эффективного и точного инструмента in vitro для прогнозирования характеристик проницаемости препарата in vivo как у собак, так и у людей очень желательна. Таким инструментом может быть собачья кишечная органоидная система, характеризующаяся трехмерными (3D), самосборными эпителиальными структурами, полученными из взрослых стволовых клеток.
(1) Протокол проницаемого вспомогательного посева описывает экспериментальные методы диссоциации и посева органоидов собак во вставках. Выделение органоидов собак, культивирование и извлечение урожая были ранее описаны в отдельном наборе протоколов в этом специальном выпуске. Методы общего содержания органоидного монослоя кишечного кишечника собак подробно обсуждаются в (2) Протоколе поддержания монослоя. Кроме того, этот протокол описывает методы оценки структурной целостности монослоя с помощью измерений трансэпителиального электрического сопротивления (TEER) и световой микроскопии. Наконец, (3) Экспериментальный протокол проницаемости описывает задачи, непосредственно предшествующие эксперименту, включая проверку экспериментальных результатов in vitro .
В целом, собачья органоидная модель в сочетании с технологией двухкамерной клеточной культуры преодолевает ограничения, связанные с 2D-экспериментальными моделями, тем самым повышая надежность прогнозов кажущейся пероральной проницаемости терапевтических препаратов-кандидатов как у собаки, так и у человека.

Стандартные операционные процедуры для культивирования собачьих органоидов были ранее описаны33, и Протокол органоидов собак также подробно обсуждался в этом специальном выпуске38. Кишечные органоиды собак, культивируемые на проницаемых опорах, были зафиксированы и парафин-внедрены для изучения микроанатомии монослоя и клеточных популяций. Процесс встраивания парафина ранее обсуждался Gabriel et al.38. Было выполнено рутинное окрашивание (гематоксилин и эозин), а метод окрашивания Alcian Blue был использован для обнаружения бокаловидных клеток в монослое органоидов собак (см. Рисунок 7).
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63612/63612fig07.jpg"> Рисунок 7: Однослойное окрашивание органоидов кишечника собак. Кишечные органоиды кишечника собак желудочного происхождения в проницаемой опоре были внедрены парафином и окрашены H&E и AB. Репрезентативные изображения были сделаны с использованием световой микроскопии при увеличении 40x (A) и 60x (B). Окрашивание H &E обнаруживает столбчатый эпителиальный монослой, а микроворсинки в апикальной части клеток можно наблюдать при 60-кратном увеличении. Окрашивание AB дополнительно раскрывает присутствие бокаловидных клеток (темно-синего цвета) в монослое органоидов кишечника собак. Шкала стержней = 20 мкм (A), 50 мкм (B). Сокращения: H&E = гематоксилин и эозин; AB = Алциан Синий. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/63612fig07large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
Органоидную культуру на проницаемой опоре следует выращивать в течение 10-14 дней, чтобы быть готовой к эксперименту по проницаемости. Световая микроскопия используется в сочетании с измерениями значений TEER для подтверждения готовности органоидной культуры к тестированию проницаемости лекарств-кандидатов. Репрезентативные световые микроскопические изображения различных органоидных монослоев кишечного кишечника у здоровых и больных животных представлены на рисунке 8.
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63612/63612fig08.jpg"> Рисунок 8: Органоидная монослойная микроскопия органоидов кишечных собак. Изображения растущих монослоев, видимые под световой микроскопией. Органоидные монослои, полученные от здоровых доноров, представлены тощей кишечной энтероидной (10x; 40x) и колоноидной (20x; 40x) культурами. Органоидные монослои больных доноров представлены дуоденальными (5x; 10x) и подвздошными (5x; 10x) энтероидами, полученными от собачьего пациента с диагнозом PLE. Обе органоидные культуры PLE являются примерами неправильной изоляции клеток во время посева органоидов, и эти культуры не могут быть использованы для анализа проницаемости лекарств из-за наличия 3D-органоидов. Примеры отклонений от правильного образования монослоя, такие как монослойные разрывы (5x), вызваны неосторожными манипуляциями с биологическими образцами. Длительная культивирование органоидов (10x; 20x) вызвана длительным содержанием органоидов на вкладыше, когда органоиды начинают напоминать свою первоначальную 3D-структуру. Для сравнения представлены изображения традиционных 2D клеточных линий на проницаемых носителях, обычно используемых для исследований проницаемости лекарственных средств (MDCK-10x; 40x и Caco-2-10x; 20x). Сокращения: PLE = белково-теряющая энтеропатия; MDCK = собачья почка Мадина-Дарби. Шкала стержней = 500 мкм (5x), 200 мкм (10x), 100 мкм (20x), 50 мкм (40x). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/63612fig08large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
Органоидные монослои также были зафиксированы в 3% параформальдегида-3% глутаральдегида в фосфат-буферном физиологическом растворе (PBS). Просвечивающая электронная микроскопия (ТЭМ) использовалась для характеристики ультраструктуры органоидной культуры на проницаемых опорах. Микроанатомические структуры микроворсинок и плотных соединений можно увидеть на рисунке 9.
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63612/63612fig09.jpg"> Рисунок 9: Теам изображения здоровых органоидных монослоев кишечного кишечника. ТЭМ был использован для выявления клеточной микроархитектуры точевидных (A), подвздошных (B) и толстоковидных (C) органоидных монослоев. Микропористая мембрана проницаемой опорной вставки отмечена желтой стрелкой. Наличие микроворсинок (синяя стрелка) и плотных соединений (красная стрелка) очерчено на изображениях. Аббревиатура: TEM = Просвечивающая электронная микроскопия. Шкала стержней = 5 мкм (А), 2 мкм (В, С). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/63612fig09large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
Как измерения TEER, так и световая микроскопия должны быть выполнены для обеспечения готовности системы к испытаниям на проницаемость. Анализ готов к использованию, когда TEER достигает устойчивого состояния, в то время как световая микроскопия поможет исключить повреждение или чрезмерный рост органоидов. Резюме типичных измерений TEER пяти групп, состоящих из собачьих энтероидов и колоноидов, представлено на рисунке 6.
Таблица 1: Состав органоидных сред и FAA. Полный состав CMGF+, CMGF+ R/G и FAA обобщен в этой таблице. Сокращения: ROCK = ро-ассоциированная киназа; GSKiβ = гликогенсинтаза киназа бета; CMGF + R/G = Полная среда с факторами роста, усиленными ингибитором ROCK и GSKiβ; CMGF+ = Полная среда с факторами роста, но без ингибитора ROCK или GSKiβ; FAA = формалин-уксусная кислота-спирт; EGF = эпидермальный фактор роста. Эта таблица адаптирована из 38. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/Table%201%20(8).xlsx" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.</a>
Дополнительная таблица 1: Таблица для учета собачьего органоида проницаемой опорной системы. Сокращения: TEER = трансэпителиальное электрическое сопротивление; ROCK = ро-ассоциированная киназа; GSKiβ = гликогенсинтаза киназа бета; CMGF + R/G = Полная среда с факторами роста, усиленными ингибитором ROCK и GSKiβ; CMGF+ = Полная среда с факторами роста, но без ингибитора ROCK или GSKiβ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/Supplementary%20Table%201%20(1).xlsx" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Canine Intestinal Organoids in a Dual-Chamber Permeable Support System at JoVE.com

Canine Intestinal Organoids in a Dual-Chamber Permeable Support System

Здесь мы представляем протокол, описывающий культуру кишечных органоидов собак в двухкамерной, проницаемой опорной системе. Описано посев органоидов в проницаемых опорах, поддержание монослоя и последующие эксперименты с лекарственной проницаемостью.

Кишечные органоиды собак в двухкамерной проницаемой вспомогательной системе

The permeable support system is typically used in conjunction with traditional two-dimensional (2D) cell lines as an in vitro tool for evaluating the oral ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

Развитие Отрицательные Маркер для выбора Entamoeba histolytica</em

Entamoeba histolytica is the causative agent of amebiasis and infects up to 10% of the world's population. The molecular techniques that have enabled the ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Культивирование Микроглии от новорожденных и взрослых центральной нервной системы

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Культура и Pattern Recognition Рецептор Стимуляция мыши Кишечные органоидами

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the ...

Implementation of a Permeable Membrane Insert-based Infection System to Study the Effects of Secreted Bacterial Toxins on Mammalian Host Cells

Внедрение системы инфекционного проницаемой мембраны Вставка на основе для изучения влияния секретируемых бактериальными токсинами на млекопитающих клеток-хозяев

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate ...

A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release

Простой флуоресценция Анализ на Количественное Собачий Нейтрофильная внеклеточной Trap Release

Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although ...

Induction of Paralysis and Visual System Injury in Mice by T Cells Specific for Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4

Индукция паралич и зрительной системы травмы в мышей, специфические клетки T нейромиелит Optica Аквапорин аутоантиген-4

While it is recognized that aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells and antibodies participate in the pathogenesis of neuromyelitis optica (NMO), a human ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

Изоляция лимфоциты от мыши небольшой кишечной иммунной системы

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

В пробирке Формирование собак нейтрофилов внеклеточного ловушка: Динамические и количественный анализ по микроскопии флуоресцирования

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

Человеческого Colonoid монослои для изучения взаимодействия между патогенов, Комменсалами и принимающих кишечного эпителия

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens

Использование человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток-производные кишечные органоиды для изучения и изменения эпителиальной защиты клеток против сальмонеллы и других патогенов

The intestinal &#8216;organoid&#8217; (iHO) system, wherein 3-D structures representative of the epithelial lining of the human gut can be produced from ...