Name: isolation, expansion, and differentiation of mesenchymal stem cells from the infrapatellar fat pad of the goat stifle joint
Uploaded: 2022-08-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Expansion, and Differentiation of Mesenchymal Stem Cells from the Infrapatellar Fat Pad of the Goat Stifle Joint at JoVE.com

تقر SH بالدعم المقدم من زمالة معهد ما بعد الدكتوراه في IIT Kanpur ومنحة SYST من DST (قسم SEED) (SP / YO / 618/2018). تعترف AM بالمعهد الهندي للتكنولوجيا - كانبور (IIT-Kanpur) للحصول على زمالة المعهد. تعترف DSK بأستاذ كرسي Gireesh Jankinath وقسم التكنولوجيا الحيوية ، الهند ، للتمويل (BT / PR22445 / MED / 32/571/2016). تشكر AM و SH و DSK مركز عائلة ميهتا للهندسة في الطب في IIT-Kanpur على دعمهم السخي.

يعتمد البروتوكول على عزل IFP-MSCs عن الماعز. تم جمع الماعز IFP والدم من مسلخ محلي. نظرا لأن مجموعات الأنسجة هذه تقع خارج نطاق اختصاص لجنة أخلاقيات الحيوان المؤسسية ، لم تكن الموافقة الأخلاقية مطلوبة.
1. عزل IFP-MSCs من المفصل الفخذي الظنبوبي لركبة الماعز
<ol><li>جمع الماعز الفخ...

في البروتوكول الحالي ، تم توفير طريقة بسيطة وموثوقة وقابلة للتكرار لعزل MSCs من IFP الماعز. تم استخدام الخلايا المعزولة باستخدام هذه الطريقة بنجاح في دراساتنا السابقة لتجديد الأنسجة في المختبر. لوحظ أن الخلايا المعزولة كانت تكاثرية ، وكانت تستجيب لعوامل النمو المختلفة ، واحتفظت بنشاطه?...

الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) هي مرشح جذاب للعلاجات القائمة على الخلايا في الطب التجديدي 1,2. يمكن حصادها من مجموعة متنوعة من مصادر الأنسجة مثل نخاع العظام والحبل السري والمشيمة ولب الأسنان والأنسجة الدهنية تحت الجلد3. ومع ذلك ، نظرا لأن توافر الخلايا الجذعية لدى البالغين محدود وغالبا ما يكون إجراء عزلها غازيا (مما يؤدي إلى الإصابة بأمراض موقع المانحين) ، فمن المستحسن أن يكون لديك مصدر بديل للخلايا الجذعية يمكنه التحايل على هذه التحديات.
مفصل الركبة عبارة عن مستودع لأنواع مختلفة من الخلايا ، مثل MSCs المشتقة من وسادة الدهون تحت الرضفة ، و MSCs المشتقة من الغشاء الزليلي ، و MSCs المشتقة من السائل الزليلي ، والخلايا الليفية في الرباط ، والخلايا الغضروفية المفصلية ، إلخ4،5،6. هذه الخلايا لديها القدرة على استكشافها على نطاق واسع في البحوث القائمة على هندسة الأنسجة العضلية الهيكلية. لذلك ، يمكن أن يكون مفصل الركبة مصدرا ممكنا وموثوقا لأنواع متعددة من MSCs. يعد مستودع الدهون الموجود في مفصل الركبة ، والمعروف باسم وسادة الدهون تحت الرضفة (IFP) أو وسادة الدهون في Hoffa ، خيارا واعدا وبديلا لمستودع MSC. يعد IFP مصدرا يسهل الوصول إليه نسبيا ويمكن الحصول عليه سريريا من MSCs ، حيث يتم استئصاله بشكل روتيني والتخلص منه كنفايات جراحية أثناء تنظير الركبة أو جراحة الركبة المفتوحة. ترتبط إزالة IFP بالحد الأدنى من المراضة في موقع المتبرع ، مما يجعله أيضا مصدرا جذابا للأنسجة. على الرغم من وجود نمط ظاهري مماثل، فإن MSCs من IFP-MSCs قد عززت إمكانات استنساخ عند مقارنتها بالخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من نخاع العظم (BM-MSCs)6 وقدرة تكاثرية أفضل مقارنة بالخلايا الجذعية المشتقة من الدهون تحت الجلد (ADSCs)7. ومن المثير للاهتمام ، بالمقارنة مع MSCs المشتقة من السائل الزليلي (SF-MSCs) ، لا تفقد IFP-MSCs قدرتها على التكاثر في الممرات المتأخرة ، ولا تزيد مضاعفة الوقت في الممرات المتأخرة. يشير هذا إلى أنه أثناء توسع الخلايا ، يمكن ل IFP-MSCs تحقيق عدد كبير بما فيه الكفاية من الخلايا لتطبيقات هندسة الأنسجة في المختبر دون المساس بمعدل انتشارها8. أشارت الدراسات الحديثة أيضا إلى أن IFP-MSCs تمتلك إمكانات تمايز غضروفي فائقة مقارنة ب MSCs المشتقة من نخاع العظم (BMSCs) و MSCs المشتقة من الدهون (ADSCs) ، ربما بسبب قربها التشريحي من الغضروف المفصلي ، مما يشير إلى ملاءمتها لهندسة أنسجة الغضاريف6،7،9،10. علاوة على ذلك ، لديهم أيضا إمكانية التمايز العظمي المستقل عن العمر11. ثبت أن الحقن داخل المفصل ل IFP-MSCs يقلل الألم ويحسن وظائف مفصل الركبة لدى مرضى هشاشة العظام (OA) 12,13. علاوة على ذلك ، تم الإبلاغ أيضا عن استجابات قوية مثبطة للمناعة وخصائص مناعية محسنة ل IFP-MSCs في وجود السيتوكينات الالتهابية أثناء الحالات المرضية6.
وتشكل هذه الأفرقة مصدرا واعدا وبديلا للأفرقة المتنقلة؛ ومع ذلك ، فإن فائدتها العلاجية في هندسة الأنسجة والطب التجديدي أقل استكشافا نسبيا. استخدمت الدراسات الحالية على IFP-MSCs بشكل رئيسي خلايا من متبرعين بشريين. من بين هذه الدراسات ، قامت بعض الدراسات الحديثة بالتحقيق في IFP-MSCs من متبرعين بشريين أصحاء (مرضى غير مصابين بالتهاب المفاصل ، تتراوح أعمارهم بين 17-60 عاما) 6,14 ، في حين استخدمت معظم الدراسات IFP-MSCs من المرضى المسنين الذين يخضعون لجراحة استبدال الركبة بالكامل (المرضى المرضى ، الذين تتراوح أعمارهم بين 70-80 عاما). نظرا لأنه من المعروف أن كلا من العمر والمرض يغيران الأداء الطبيعي للخلايا الجذعية (انخفاض العدد وفقدان الإمكانات الوظيفية) ، فقد يؤدي ذلك إلى تناقضات في نتائج الدراسات المستندة إلى MSC7،15،16،17. بالإضافة إلى ذلك ، فإن استخدام IFP-MSCs من المرضى الذين يعانون من حالات فسيولوجية مرضية (مثل التهاب المفاصل والسمنة) يشكل أيضا صعوبة في فهم الخصائص الأساسية للخلايا السليمة في المختبر ، وبالتالي يعمل كعامل مقيد في تطوير العلاجات القائمة على MSCs. للتغلب على هذه المشكلات ، يعد استخدام IFP-MSCs من الجهات المانحة الصحية أمرا حيويا. نظرا لأن الوصول إلى متبرع بشري سليم يمثل تحديا ، يمكن أن تكون النماذج الحيوانية بديلا أفضل. في هذا الصدد ، هناك عدد قليل من الدراسات حيث تم عزل IFP من الفئران18. ومع ذلك ، نظرا لصغر حجم وسادة الدهون في الفئران العادية ، فقد تم دمج الأنسجة الدهنية من متعددة للحصول على أنسجة كافية لتنفيذ إجراءات تجريبية معقدة19. وبالتالي ، هناك حاجة إلى نموذج حيواني كبير ، والذي يمكن أن يفي بمتطلبات العدد الأكبر من الخلايا ويتوافق في نفس الوقت مع مبادئ 3R (التحسين والاستبدال والتقليل) في الأبحاث الحيوانية20. استخدام الحيوانات الكبيرة له آثار كبيرة في البحوث الانتقالية. على وجه التحديد ، في هندسة الأنسجة العضلية الهيكلية ، تم التحقيق في مجموعة من الحيوانات الكبيرة مثل الكلاب والخنازير والأغنام والماعز والخيول21. الماعز (Capra aegagrus hircus) هو اختيار ممتاز للحيوان الكبير لأن مفصله الخانق لديه أقرب تشريح لمفصل الركبة البشري22،23،24. يتشابه الهيكل التربيقي العظمي تحت الغضروفي وسمك عظم الماعز تحت الغضروف مع البشر ، كما تم الإبلاغ عن نسبة الغضروف إلى العظام لتكون قريبة من البشر21. بالإضافة إلى ذلك ، تم تدجين الماعز على نطاق واسع في جميع أنحاء العالم ، مما يجعلها متاحة بسهولة عندما تنضج هيكليا. علاوة على ذلك ، فإن تكاليف الصيانة المنخفضة وسهولة التعامل معها جعلتها نموذجا حيوانيا جذابا للبحث22.
في هذه الدراسة ، تم توضيح بروتوكول بسيط لعزل IFP-MSCs من المفصل الخانق ل Capra aegagrus hircus (الماعز) وظروف الاستزراع في المختبر لتمددها وتمايزها. الخلايا المعزولة ملتصقة ، ولها مورفولوجيا تشبه MSC ، وتشكل مستعمرات CFU-F (الخلايا الليفية المكونة للمستعمرة) ، وتمتلك إمكانات تمايز دهنية ، غضروفية ، وعظمية. لذلك ، تظهر IFP-MSCs إمكانات كمصدر بديل ل MSCs للتطبيقات الطبية الحيوية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#946;-glycerophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9422-10G</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin- 0.02% EDTA</td>
			<td>Hi-Media</td>
			<td>TCL049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15-mL centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>49752-10G</td>
			<td>50 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TCL021-50ml</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50-mL centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian Blue</td>
			<td>Hi-Media</td>
			<td>RM471</td>
			<td>For sufated gycosaminoglycans staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alizarin Red S</td>
			<td>S D Fine-Chem Limited</td>
			<td>26048-25G</td>
			<td>For calcium deposition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>A011</td>
			<td>2.5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic fibroblast growth factor (bFGF)</td>
			<td>Sino Biologicals</td>
			<td>10014-HNAE</td>
			<td>5 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCIP/NBT ALP Substrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B5655-5TAB</td>
			<td>For ALP staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>MB-083</td>
			<td>Long name: Bovine Serum Albumin (1.25 mg/mL )</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TCP-182</td>
			<td>70 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>REMI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin</td>
			<td>RANBAXY LAB. Limited</td>
			<td>B17407T1</td>
			<td>2.5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Violet</td>
			<td>S D Fine-Chem Limited</td>
			<td>42555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.94925.0521</td>
			<td>25 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2915</td>
			<td>1 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM LG</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D5523</td>
			<td>Long name: Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Media Low Glucose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270</td>
			<td>Long name: Fetal Bovine Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution 37%-41%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>61780805001730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indomethacin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7378</td>
			<td>100 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I9278</td>
			<td>10 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon Eclipse TS 100</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS + 1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2521-5mL</td>
			<td>Long name: insulin, transferrin, sodium selenite + linoleic-BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Proline</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TO-109-25G</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>61751605001730</td>
			<td>For lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Meck</td>
			<td>1.07018.2521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes and sterile tips (20 &#181;L, 200 &#181;L, 1000 &#181;L)</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MUSE Cell analyser</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td></td>
			<td>For cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT compound</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>4583</td>
			<td>Long name: Optimal Cutting Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red O dye</td>
			<td>S D Fine-Chem Limited</td>
			<td>54304</td>
			<td>For lipid vacuole staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>A007</td>
			<td>100 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (150 mm and 90 mm)</td>
			<td>NEST</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safranin O</td>
			<td>S D Fine-Chem Limited</td>
			<td>50240</td>
			<td>For sufated gycosaminoglycans staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3434</td>
			<td>3.4 % (w/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile scissors, forceps and scalpels</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For isolation of IFP-MSC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.94953.0521</td>
			<td>35 % (w/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF-&#946;1</td>
			<td>Sino Biologicals</td>
			<td></td>
			<td>Long name: Transforming growth factor- &#946;1 (10 ng/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture incubator 37 &#176;C, 5% CO2</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris buffer</td>
			<td>Merck</td>
			<td>61771405001730</td>
			<td>For lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>S D Fine-Chem Limited</td>
			<td>40632</td>
			<td>For lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type II collagenase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17101015</td>
			<td>1.5 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin D3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9756-1G</td>
			<td>10 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Well plates (6 -WP and 24-WP)</td>
			<td>NEST</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, expansion, and differentiation of mesenchymal stem cells from the infrapatellar fat pad of the goat stifle joint

يعمل IFP ، الموجود في مفصل الركبة ، كمصدر واعد ل MSCs. IFP هو نسيج يسهل الوصول إليه حيث يتم استئصاله والتخلص منه بشكل روتيني أثناء إجراءات تنظير المفاصل وجراحات استبدال الركبة. بالإضافة إلى ذلك ، ترتبط إزالته بالحد الأدنى من المراضة في موقع المانحين. وقد أظهرت الدراسات الحديثة أن IFP-MSCs لا تفقد قدرتها على الانتشار أثناء التوسع في المختبر ولديها إمكانية تمايز عظمي مستقل عن العمر. تمتلك IFP-MSCs إمكانات تمايز غضروفي فائقة مقارنة ب MSCs المشتقة من نخاع العظم (BMSCs) والخلايا الجذعية المشتقة من الدهون (ADSCs). على الرغم من أن هذه الخلايا يمكن الحصول عليها بسهولة من المرضى المسنين والمرضى ، إلا أن فعاليتها محدودة. ومن ثم ، فإن استخدام IFP-MSCs من متبرعين أصحاء أمر مهم لتحديد فعاليتها في التطبيقات الطبية الحيوية. نظرا لأن الوصول إلى متبرع بشري سليم يمثل تحديا ، يمكن أن تكون النماذج الحيوانية بديلا أفضل لتمكين الفهم الأساسي. تلعب الحيوانات الكبيرة مثل الكلاب والخيول والأغنام والماعز دورا مهما في البحث الانتقالي. من بين هؤلاء ، يمكن أن يكون الماعز نموذجا مفضلا لأن المفصل الخانق للماعز لديه أقرب تشريح لمفصل الركبة البشري. علاوة على ذلك ، يمكن ل goat-IFP تلبية أرقام MSC الأعلى اللازمة لتطبيقات تجديد الأنسجة. علاوة على ذلك ، فإن التكلفة المنخفضة والتوافر والامتثال لمبادئ 3R للبحوث الحيوانية تجعلها نموذجا جذابا. توضح هذه الدراسة بروتوكولا بسيطا لعزل IFP-MSCs عن المفصل الخانق للماعز وظروف الاستزراع في المختبر لتمددها وتمايزها. تم غسل IFP المعزول بشكل معقم من الماعز وفرمه وهضمه إنزيميا. بعد الترشيح والطرد المركزي ، تم استزراع الخلايا التي تم جمعها. كانت هذه الخلايا ملتصقة ، وكان لها مورفولوجيا تشبه MSCs ، وأظهرت قدرة استنساخ ملحوظة. علاوة على ذلك ، فقد تمايزوا إلى سلالات دهنية ، غضروفية ، وعظمية ، مما يدل على تعدد قدراتهم. في الختام ، توضح الدراسة عزل وتوسع MSCs ، والتي تظهر إمكانات في هندسة الأنسجة وتطبيقات الطب التجديدي.

عزل IFP-MSCs من المفصل الفخذي الظنبوبي للماعز يوضح الشكل 1 الخطوات التي ينطوي عليها عزل IFP-MSCs عن المفصل الخانق للماعز. تمت إزالة وسادة الدهون الموجودة في السطح الداخلي غير المفصلي للرضفة وفرمها وهضمها إنزيميا. تم عزل IFP-MSCs بنجاح واستزراعها في المختبر (<strong class="xfig"...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Expansion, and Differentiation of Mesenchymal Stem Cells from the Infrapatellar Fat Pad of the Goat Stifle Joint at JoVE.com

Isolation, Expansion, and Differentiation of Mesenchymal Stem Cells from the Infrapatellar Fat Pad of the Goat Stifle Joint

يمكن عزل الخلايا الجذعية الوسيطة تحت الرضفة (IFP-MSCs) بسهولة من وسادة الدهون تحت الرضفة في مفصل الركبة. تتكاثر بشكل جيد في المختبر ، وتشكل مستعمرات CFU-F ، وتتمايز إلى سلالات دهنية ، غضروفية ، وعظمية المنشأ. هنا ، يتم توفير منهجية عزل وتوسيع وتمييز IFP-MSCs عن مفصل خنق الماعز.

عزل وتوسيع وتمايز الخلايا الجذعية الوسيطة من وسادة الدهون تحت الرضفة لمفصل خنق الماعز

The IFP, present in the knee joint, serves as a promising source of MSCs. The IFP is an easily accessible tissue as it is routinely resected and discarded ...

الخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من الدهون تحت الرضفة ، أو باختصار ، IFP-MSCs ، هي نوع من الخلايا الجذعية الأقل دراسة نسبيا. هذا البروتوكول هو طريقة بسيطة وموثوقة وقابلة للتكرار توضح عزل IFP-MSCs عن مفصل خنق الماعز. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن الحصول على عدد كبير من IFP-MSCs عالية الجودة.يمكن أن تتمايز IFP-MSCs المعزولة إلى سلالات متعددة وتمتلك إمكانات تجديد واسعة النطاق. نظرا لموقعها التشريحي ، اكتسبت IFP-MSCs اهتماما بإصلاح عيوب الغضروف والتخفيف من تدهور الغضروف في هشاشة العظام. هذه الطريقة لها آثار على العلاج القائم على الخلايا في مجال هندسة الأنسجة والطب التجديدي.سيتم توضيح إجراءات عزل وتوسيع وتمايز IFP-MSCs من قبل الدكتور سوغاتا هازرا والسيد أمان ماهاجان. لبدء عزل الخلايا الجذعية الوسيطة تحت الرضفة الدهنية ، أو IFP-MSCs ، اجمع المفاصل الفخذية الظنبوبية الماعز التي تضم حوالي 15 سم من مناطق الفخذ والظنبوب للأطراف الخلفية في صندوق عينة تجميع معقمة. قم بتخزين العينة عند أربع درجات مئوية لنقلها إلى المختبر لمزيد من المعالجة.ضع العينة على طبق بتري 150 ملم وتأكد من معالجة العينة بشكل معقم وخزانة السلامة الحيوية طوال الإجراء. شطفه جيدا مع PBS المعقم تستكمل بالمضادات الحيوية. حافظ على رطوبة العينة باستخدام برنامج تلفزيوني.فحص بعناية المناطق التشريحية للعينة. لسهولة الوصول ، قم بإزالة الأنسجة الزائدة من كل من العظام الطويلة تماما عن طريق إمساك السطح النهائي لعظم الفخذ بيد واحدة وقطعه طوليا نحو المفصل باستخدام مقص حاد. ثم ، دون إزعاج الأنسجة المحيطة بكبسولة المفصل ، قم بإزالة العضلات والأنسجة الدهنية من العظام.وبالمثل ، قم بعمل شق آخر في نهاية الظنبوب للعينة وإزالة العضلات والأنسجة الدهنية من عظم الظنبوب. تأكد من أن كلا العظمين الطويلين مكشوفان تماما وأن كبسولة المفصل مرئية. بعد ذلك ، قم بعمل شق من جانبي الغشاء الزليلي لفتح المفصل المفصلي.قطع الرضفة الحرة من الغشاء الزليلي والأربطة الرضفية باستخدام مقص وملقط معقم جديد. ضع الرضفة المنفصلة على الفور في طبق بتري يحتوي على برنامج تلفزيوني. من الرضفة المنفصلة ، قم بإزالة وسادة الدهون بالكامل الموجودة على السطح الداخلي باستخدام المقص والملقط.اجمعها في طبق بتري طازج آخر ، وفرمها باستخدام مشرط. قم بتضمين أدوات جراحية أخرى للحصول على شرائح الدهون الصغيرة التي تبلغ حوالي 2 إلى 3 ملليمترات. استخدم ملعقة لنقل المنديل المفروم إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 ملليلتر واغسله ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني مكمل بالمضادات الحيوية لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة باستخدام خلاط أنبوب اختبار.للهضم الأنزيمي ، احتضن حوالي خمسة جرامات من الأنسجة المفرومة في وسائط النسر المعدلة من Dulbecco ، أو DMEM ، وهي وسائط منخفضة الجلوكوز تحتوي على 1.5 ملليغرام لكل ملليلتر من النوع الثاني كولاجيناز و 2٪ FBS عند 37 درجة مئوية لمدة 12 إلى 16 ساعة. قم بشفط الأنسجة المهضومة بعناية وقم بترشيحها من خلال مصفاة خلايا 70 ميكرون لإزالة أي جزء غير مهضوم. جهاز طرد مركزي للمرشح في أنبوب طرد مركزي سعة 15 ملليلتر بمعدل 150 مرة جم لمدة خمس دقائق.قم بإزالة المادة الطافية قبل غسل حبيبات الخلية بجلوكوز منخفض DMEM مرتين. أعد تعليق الحبيبات بالكامل DMEM ، والمعروفة أيضا باسم وسائط التوسع. بذر الخلايا على طبق بتري 150 ملم واستزرعها في وسائط التمدد المكملة بخمسة نانوجرام لكل ملليلتر من عامل نمو الخلايا الليفية الأساسي ، أو BFGF ، و 50 ميكروغرام لكل ملليلتر 2-فوسفو-L-حمض الأسكوربيك ملح ثلاثي الصوديوم.احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة 5٪ من ثاني أكسيد الكربون للسماح للخلايا بالالتصاق والتكاثر. مراقبة ارتباط ونمو الخلايا يوميا. للصيانة المناسبة وتوسيع IFP-MSCs ، قم بتغيير الوسائط كل ثلاثة أيام.أثناء تغيير الوسائط ، أضف خمسة نانوجرام جديدة لكل ملليلتر BFGF و 50 ميكروغرام لكل ملليمتر من ملح الصوديوم ثلاثي الصوديوم 2-Phospho-L-ascorbic مباشرة إلى طبق بتري. بمجرد أن تصبح الخلايا متقاربة بنسبة 80٪ إلى 90٪ ، قم بزراعتها الفرعية عن طريق إزالة وسائط التمدد من طبق بتري وغسل الخلايا باستخدام 1X PBS. ثم أضف أربعة ملليلتر من 0.25٪ Trypsin-EDTA إلى الطبق واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة 5٪ ثاني أكسيد الكربون.بعد أربع دقائق ، اضغط على اللوحة الموجودة على جانبها لإزاحة الخلايا. تأكيد الانفصال الكامل لجميع الخلايا تحت المجهر. بمجرد التأكيد ، أضف حجما متساويا من وسائط التمدد لتحييد التربسين.استخدم ماصة لجمع هذه الخلايا المنفصلة في أنبوب بولي بروبيلين جديد سعة 15 ملليلتر وقم بطردها بالطرد المركزي بمعدل 150 مرة جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في الحجم المطلوب من وسائط التمدد. عد الخلايا باستخدام طريقة عد الخلايا القياسية واستزرعها لمزيد من التوسع بكثافة بذر تبلغ 10،000 خلية لكل سنتيمتر مربع في طبق بتري سعة 150 ملليلتر.لجميع المقايسات ، استخدم طبقة أحادية متقاربة من الخلايا من رقم المرور P2 إلى P5. عندما تصل الخلايا الموسعة إلى 80٪ إلى 90٪ ، قم بفصل الخلايا باستخدام محلول Trypsin-EDTA قبل تكويرها في أنبوب طرد مركزي سعة 15 ملليلتر بمعدل 150 مرة جم لمدة خمس دقائق. ثم أعد تعليق الحبيبات في بلازما الماعز بكثافة 2 مليون خلية لكل 50 ميكرولتر. أضف 50 ميكرولتر من البلازما التي تحتوي على الخلايا على طبق بتري معقم 90 ملم ، متبوعا بإضافة كلوريد الكالسيوم بتركيز نهائي قدره 0.3٪ امزج جيدا لتصنيع هيدروجيل البلازما المتصالب.بعد احتضان الهيدروجيل المصنع عند 37 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة ، انقل الهلاميات المائية إلى ألواح زراعة الأنسجة المكونة من 24 بئرا والتي تحتوي على وسائط غضروفية. قم بتغيير الوسائط كل ثلاثة أيام لمدة 14 يوما. تعتبر الهلاميات المائية المستزرعة في وسائط DMEM كاملة بدون TGF-beta 1 عناصر تحكم غير مستحثة.بعد 14 يوما من التمايز الغضروفي للخلايا في هيدروجيل البلازما ، اغسل الهلاميات المائية ثلاث مرات باستخدام PBS لمدة خمس دقائق لكل منها ، وقم بإصلاح العينات في فورمالين محايد لمدة ثلاث ساعات. كانت IFP-MSCs المعزولة ملتصقة بشكل متجانس وحققت مورفولوجيا ممدودة في غضون 24 ساعة من الزراعة في المختبر. تكاثرت الخلايا بكفاءة 80٪ إلى 90٪ التقاء في غضون ستة أيام من التوسع وأظهرت قدرة استنساخ ، مما يشير إلى قدرات تكاثرية وتجديد ذاتي فعالة.عند معالجتها للتمايز إلى سلالة أديبوجينية ، أنتجت الخلايا المعزولة قطرات دهنية ، وهو ما أكده تلطيخ الزيت الأحمر O في اليومين 14 و 21. لم تكن قطرات الزيت هذه مرئية في الخلايا بدون عوامل محفزة للأديبوجين. أظهرت الخلايا المعزولة المغلفة في هيدروجيل البلازما تكوين أنسجة جديدة بيضاء ولامعة بعد 14 يوما في المجموعة المستحثة أظهرت إمكانات الغضروف.كان لدى المجموعة غير المستحثة أنسجة بيضاء شاحبة مع انخفاض اللمعان. بالإضافة إلى ذلك ، أشار التلوين النسيجي الإيجابي ل Alcian Blue و Safranin O في المجموعة المستحثة إلى أن الخلايا يمكن أن تفرز الجليكوزامينوجليكان الكبريتي ، وهو أحد المكونات الرئيسية لمصفوفة الغضروف. في المقابل ، كانت مقاطع الهيدروجيل من المجموعات غير المستحثة سلبية لتلطيخ Safranin O و Alcian Blue ، مما يؤكد إمكانية التمايز الغضروفي للخلايا الجذعية الوسيطة فقط في وجود محفزات غضروفية.أظهرت الخلايا المعزولة المستحثة بوسائط عظمية تلطيخ إيجابي للفوسفاتيز القلوي ، مما يؤكد التمعدن في نهاية 14 يوما. بعد 28 يوما من الحث العظمي ، لوحظت الترسبات المتكلسة مع تلطيخ Alizarin Red S. أكدت النتائج على إمكانات التمايز للخلايا المستحثة إلى سلالات دهنية وغضروفية وعظمية.من الضروري معالجة العينة في ظل ظروف معقمة لتجنب التلوث. من المهم أيضا تحديد الموقع الصحيح للرضفة. يفتح هذا الإجراء الطريق لعزل أنواع مختلفة من الخلايا ، مثل الخلايا الغضروفية المفصلية ، والخلايا الليفية الأربطة ، والخلايا الجذعية من الغشاء الزليلي والسائل الزليلي ، والتي لها تطبيقات واسعة في الطب التجديدي.بعد عزل IFP-MSCs باستخدام هذه التقنية ، تم التحقيق في فعاليتها بشكل خاص لتجديد الأنسجة العضلية الهيكلية ، مثل الغضاريف والعظام والأربطة باستخدام أساليب خالية من السقالات والسقالات.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

Microcapsule الجينات كمنصة 3D لإكثار وتمايز الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESC) إلى أنساب مختلفة

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

التنمية، والتوسع، و<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; رصد خلايا NK الإنسان من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) وافرة القوة والتي يسببها الخلايا الجذعية (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on Poly(&#949;-caprolactone) Electrospun Yarns

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on PolyÃƒÅ½Ã‚Âµ-caprolactone Electrospun Yarns

تحسين مرفق من الوسيطة الإنسان الخلايا الجذعية على بولي (ε-caprolactone) خيوط Electrospun

Research into biomaterials and tissue engineering often includes cell-based in vitro investigations, which require initial knowledge of the starting cell ...

Scaffold-supported Transplantation of Islets in the Epididymal Fat Pad of Diabetic Mice

تدعمه سقالة زرع الجزر في سادة الدهون البربخ من الفئران السكري

Islet transplantation has been clinically proven to be effective at treating type 1 diabetes. However, the current intrahepatic transplantation strategy ...

Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells

عزل الخلايا الجذعية الوسيطة من السمحاق السنخية البشرية وآثار فيتامين د على نشاط الخلايا المستمدة من السمحاق أوستيوجينيك

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the ...

Exploring the Potential of Mesenchymal Stem Cell Sheet on The Development of Hepatocellular Carcinoma In Vivo

Exploring the Potential of Mesenchymal Stem Cell Sheet on The Development of Hepatocellular Carcinoma In Vivo

استكشاف إمكانات ورقة الخلايا الجذعية الوسيطة على تطوير سرطانه الخلية الكبدية في فيفو

An in vivo animal model that mimics human cancer could have various applications that deliver significant clinical information. The currently used ...

Construction and Use of an Electrical Stimulation Chamber for Enhancing Osteogenic Differentiation in Mesenchymal Stem/Stromal Cells In Vitro

بناء واستخدام دائرة التحفيز الكهربائي لتعزيز Osteogenic التمايز في الخلايا الجذعية الوسيطة/اللحمية في المختبر

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) have been used extensively to promote bone healing in tissue engineering approaches. Electrical stimulation (EStim) ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

قياس إمكانات العمل البصري أحادي الخلية في خلايا القلب المشتقة من الخلايا الجذعية المتعددة القدرات

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Generation of Human Blood Vessel Organoids from Pluripotent Stem Cells

توليد عضويات الأوعية الدموية البشرية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات

An organoid is defined as an engineered multicellular in vitro tissue that mimics its corresponding in vivo organ such that it can be used to study ...

Creation of a Knee Joint-on-a-Chip for Modeling Joint Diseases and Testing Drugs

إنشاء مفصل الركبة على رقاقة لنمذجة أمراض المفاصل واختبار الأدوية

The high prevalence of debilitating joint diseases like osteoarthritis (OA) poses a high socioeconomic burden. Currently, the available drugs that target ...