Name: isolation, expansion, and differentiation of mesenchymal stem cells from the infrapatellar fat pad of the goat stifle joint
Uploaded: 2022-08-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Expansion, and Differentiation of Mesenchymal Stem Cells from the Infrapatellar Fat Pad of the Goat Stifle Joint at JoVE.com

SH anerkender støtte fra Institute Post-Doctoral Fellowship of IIT Kanpur og SYST grant fra DST (SEED Division) (SP/YO/618/2018). AM anerkender Indian Institute of Technology-Kanpur (IIT-Kanpur) for et institutstipendium. DSK anerkender Gireesh Jankinath Chair Professorship og Institut for Bioteknologi, Indien, for finansiering (BT/PR22445/MED/32/571/2016). AM, SH og DSK takker The Mehta Family Center for Engineering in Medicine ved IIT-Kanpur for deres generøse støtte.

Protokollen er baseret på isolering af IFP-MSC'er fra geder. Geder IFP og blod blev indsamlet fra et lokalt slagteri. Da sådanne vævssamlinger ligger uden for en institutionel dyreetisk komités ansvarsområde, var etisk godkendelse ikke påkrævet.
1. Isolering af IFP-MSC'er fra lårbensleddet i gedeknæet
<ol><li>Saml gedens femorotibiale led (prøve), der omfatter ~ 15 cm hver af lårbens- og tibialområderne i bagbenene. Prøven anbringes straks i en steriliseret prø...

I denne protokol er der tilvejebragt en enkel, pålidelig og reproducerbar metode til isolering af MSC'er fra ged IFP. Celler isoleret ved hjælp af denne metode er blevet anvendt med succes i vores tidligere undersøgelser til in vitro vævsregenerering. Det blev observeret, at de isolerede celler var proliferative, reagerede på forskellige vækstfaktorer og bevarede deres biologiske aktivitet, når de blev podet på elektrospundne fibre og stilladser25,26</...

Mesenkymale stamceller (MSC'er) er en attraktiv kandidat til cellebaserede terapier inden for regenerativ medicin 1,2. De kan høstes fra en række vævskilder såsom knoglemarv, navlestreng, placenta, tandmasse og subkutant fedtvæv3. Da tilgængeligheden af stamceller hos voksne imidlertid er begrænset, og deres isolationsprocedure ofte er invasiv (hvilket resulterer i sygelighed på donorstedet), er det ønskeligt at have en alternativ stamcellekilde, der kan omgå disse udfordringer.
Knæleddet er et depot af forskellige celletyper, såsom infrapatellar fedtpudeafledte MSC'er, synoviale membranafledte MSC'er, synovialvæskeafledte MSC'er, ligamentfibroblaster, artikulære chondrocytter osv. 4,5,6. Disse celler har potentiale til at blive bredt udforsket i muskuloskeletale vævsteknologibaserede undersøgelser. Derfor kan knæleddet være en mulig og pålidelig kilde til flere typer MSC'er. Fedtdepot placeret i knæleddet, kendt som den infrapatellar fedtpude (IFP) eller Hoffas fedtpude, er et lovende og alternativt valg af MSC-depot. IFP er en relativt let tilgængelig og klinisk tilgængelig kilde til MSC'er, da den rutinemæssigt resekteres og kasseres som kirurgisk affald under knæartroskopi eller åben knæoperation. Fjernelse af IFP er forbundet med minimal morbiditet på donorstedet, hvilket også gør det til en attraktiv vævskilde. MSC'er fra IFP (IFP-MSC'er) har en lignende fænotypisk profil, men har forbedret klonogent potentiale sammenlignet med knoglemarvsafledte mesenkymale stamceller (BM-MSC'er)6 og bedre proliferativ kapacitet sammenlignet med subkutane fedtafledte stamceller (ADSC'er)7. Interessant nok mister IFP-MSC'er sammenlignet med synovialvæskeafledte MSC'er (SF-MSC'er) ikke deres proliferative kapacitet ved sene passager, og fordoblingstiden øges heller ikke ved sene passager. Dette tyder på, at IFP-MSC'er under celleekspansion kan opnå et tilstrækkeligt stort antal celler til in vitro-vævstekniske applikationer uden at gå på kompromis med deres spredningshastighed8. Nylige undersøgelser har også antydet, at IFP-MSC'er har overlegen kondrogen differentieringspotentiale sammenlignet med knoglemarvsafledte MSC'er (BMSC'er) og fedtafledte MSC'er (ADSC'er), sandsynligvis på grund af deres anatomiske nærhed til ledbrusk, hvilket indikerer deres egnethed til bruskvævsteknik 6,7,9,10. Desuden har de også aldersuafhængigt osteogent differentieringspotentiale11. Intraartikulær injektion af IFP-MSC'er har vist sig at reducere smerter og forbedre knæledsfunktioner hos patienter med slidgigt (OA)12,13. Endvidere er der også rapporteret stærke immunsuppressive reaktioner og forbedrede immunmodulerende egenskaber af IFP-MSC'er i nærvær af inflammatoriske cytokiner under patologiske tilstande6.
IFP-MSC'er er en lovende og alternativ kilde til MSC'er; Imidlertid er deres terapeutiske fordel inden for vævsteknik og regenerativ medicin relativt mindre udforsket. De eksisterende undersøgelser af IFP-MSC'er har hovedsageligt udnyttet celler fra menneskelige donorer. Blandt disse har nogle få nylige undersøgelser undersøgt IFP-MSC'er fra raske humane donorer (ikke-gigtpatienter, i alderen 17-60 år)6,14, mens de fleste af undersøgelserne har brugt IFP-MSC'er fra ældre patienter, der gennemgår total knæalloplastik (syge patienter, alder 70-80 år). Da både alder og sygdom vides at ændre stamcellernes normale funktion (reduceret antal og tab af funktionelt potentiale), kan dette potentielt føre til uoverensstemmelser i resultatet af de MSC-baserede studier 7,15,16,17. Derudover giver brugen af IFP-MSC'er fra patienter med patofysiologiske tilstande (f.eks. arthritis og fedme) også svært ved at forstå de grundlæggende egenskaber ved sunde celler in vitro og fungerer dermed som en begrænsende faktor i udviklingen af MSC-baserede terapier. For at overvinde disse problemer er brugen af IFP-MSC'er fra raske donorer afgørende. Da adgang til en sund menneskelig donor er udfordrende, kan dyremodeller være et bedre alternativ. I denne henseende er der et par undersøgelser, hvor IFP er blevet isoleret fra mus18. På grund af fedtpudens lille størrelse i normale mus er fedtvæv fra flere dyr imidlertid blevet kombineret for at få nok væv til at udføre detaljerede eksperimentelle procedurer19. Derfor er der behov for en stor dyremodel, der kan opfylde kravet om det højere antal celler og samtidig overholde 3R-principperne (forfine, erstatte og reducere) i dyreforsøg20. Brugen af store dyr har betydelige konsekvenser i translationel forskning. Specifikt inden for muskuloskeletal vævsteknik er en række store dyr som hunde, svin, får, geder og heste blevet undersøgt21. Geder (Capra aegagrus hircus) er et glimrende valg af store dyr, da dets kvæleled har den nærmeste anatomi til det menneskelige knæled22,23,24. Den subchondral knogletrabekulære struktur og subchondral knogletykkelse hos geder ligner mennesker, og andelen af brusk til knogle rapporteres også at være tæt på mennesker21. Derudover er geder blevet bredt tæmmet over hele verden, hvilket gør dem let tilgængelige, når de er skeletmodne. Desuden har lave vedligeholdelsesomkostninger og nem håndtering gjort dem til en attraktiv dyremodel til forskning22.
I denne undersøgelse demonstreres en simpel protokol til isolering af IFP-MSC'er fra kvæleleddet af Capra aegagrus hircus (ged) og in vitro-dyrkningsbetingelser for deres ekspansion og differentiering. De isolerede celler er klæbende, har MSC-lignende morfologi, danner CFU-F (kolonidannende enhedsfibroblast) kolonier og besidder adipogen, kondrogene og osteogene differentieringspotentialer. Derfor viser IFP-MSC'er potentiale som en alternativ kilde til MSC'er til biomedicinske applikationer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#946;-glycerophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9422-10G</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin- 0.02% EDTA</td>
			<td>Hi-Media</td>
			<td>TCL049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15-mL centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>49752-10G</td>
			<td>50 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TCL021-50ml</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50-mL centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian Blue</td>
			<td>Hi-Media</td>
			<td>RM471</td>
			<td>For sufated gycosaminoglycans staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alizarin Red S</td>
			<td>S D Fine-Chem Limited</td>
			<td>26048-25G</td>
			<td>For calcium deposition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>A011</td>
			<td>2.5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic fibroblast growth factor (bFGF)</td>
			<td>Sino Biologicals</td>
			<td>10014-HNAE</td>
			<td>5 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCIP/NBT ALP Substrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B5655-5TAB</td>
			<td>For ALP staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>MB-083</td>
			<td>Long name: Bovine Serum Albumin (1.25 mg/mL )</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TCP-182</td>
			<td>70 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>REMI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin</td>
			<td>RANBAXY LAB. Limited</td>
			<td>B17407T1</td>
			<td>2.5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Violet</td>
			<td>S D Fine-Chem Limited</td>
			<td>42555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.94925.0521</td>
			<td>25 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2915</td>
			<td>1 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM LG</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D5523</td>
			<td>Long name: Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Media Low Glucose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270</td>
			<td>Long name: Fetal Bovine Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution 37%-41%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>61780805001730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indomethacin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7378</td>
			<td>100 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I9278</td>
			<td>10 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon Eclipse TS 100</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS + 1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2521-5mL</td>
			<td>Long name: insulin, transferrin, sodium selenite + linoleic-BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Proline</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TO-109-25G</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>61751605001730</td>
			<td>For lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Meck</td>
			<td>1.07018.2521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes and sterile tips (20 &#181;L, 200 &#181;L, 1000 &#181;L)</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MUSE Cell analyser</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td></td>
			<td>For cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT compound</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>4583</td>
			<td>Long name: Optimal Cutting Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red O dye</td>
			<td>S D Fine-Chem Limited</td>
			<td>54304</td>
			<td>For lipid vacuole staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>A007</td>
			<td>100 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (150 mm and 90 mm)</td>
			<td>NEST</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safranin O</td>
			<td>S D Fine-Chem Limited</td>
			<td>50240</td>
			<td>For sufated gycosaminoglycans staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3434</td>
			<td>3.4 % (w/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile scissors, forceps and scalpels</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For isolation of IFP-MSC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.94953.0521</td>
			<td>35 % (w/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF-&#946;1</td>
			<td>Sino Biologicals</td>
			<td></td>
			<td>Long name: Transforming growth factor- &#946;1 (10 ng/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture incubator 37 &#176;C, 5% CO2</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris buffer</td>
			<td>Merck</td>
			<td>61771405001730</td>
			<td>For lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>S D Fine-Chem Limited</td>
			<td>40632</td>
			<td>For lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type II collagenase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17101015</td>
			<td>1.5 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin D3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9756-1G</td>
			<td>10 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Well plates (6 -WP and 24-WP)</td>
			<td>NEST</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, expansion, and differentiation of mesenchymal stem cells from the infrapatellar fat pad of the goat stifle joint

IFP, der findes i knæleddet, fungerer som en lovende kilde til MSC'er. IFP er et let tilgængeligt væv, da det rutinemæssigt resekteres og kasseres under artroskopiske procedurer og knæudskiftningsoperationer. Derudover er dens fjernelse forbundet med minimal morbiditet på donorstedet. Nylige undersøgelser har vist, at IFP-MSC'er ikke mister deres spredningskapacitet under in vitro-ekspansion og har aldersuafhængigt osteogent differentieringspotentiale. IFP-MSC'er har overlegen kondrogen differentieringspotentiale sammenlignet med knoglemarvsafledte MSC'er (BMSC'er) og fedtafledte stamceller (ADSC'er). Selvom disse celler let kan fås fra ældre og syge patienter, er deres effektivitet begrænset. Derfor er det vigtigt at bruge IFP-MSC'er fra raske donorer for at bestemme deres effektivitet i biomedicinske applikationer. Da adgang til en sund menneskelig donor er udfordrende, kan dyremodeller være et bedre alternativ til at muliggøre grundlæggende forståelse. Store dyr som hunde, heste, får og geder spiller en afgørende rolle i translationel forskning. Blandt disse kunne geden være en foretrukken model, da gedens kvæleled har den nærmeste anatomi til det menneskelige knæled. Desuden kan gede-IFP opfylde de højere MSC-numre, der er nødvendige for vævsregenereringsapplikationer. Desuden gør lave omkostninger, tilgængelighed og overholdelse af 3R-principperne for dyreforsøg dem til en attraktiv model. Denne undersøgelse demonstrerer en simpel protokol til isolering af IFP-MSC'er fra gedens kvæleled og in vitro-kulturbetingelser for deres ekspansion og differentiering. Den aseptisk isolerede IFP fra geden blev vasket, hakket og fordøjet enzymatisk. Efter filtrering og centrifugering blev de opsamlede celler dyrket. Disse celler var klæbende, havde MSC'er-lignende morfologi og viste bemærkelsesværdig klonogen evne. Endvidere differentierede de sig i adipogene, kondrogene og osteogene slægter, hvilket demonstrerede deres multipotens. Afslutningsvis viser undersøgelsen isolering og udvidelse af MSC'er, som viser potentiale inden for vævsteknik og regenerativ medicin.

Isolering af IFP-MSC'er fra gedens femorotibiale led De trin, der er involveret i isolering af IFP-MSC'er fra en geds kvæleled, er afbildet i figur 1. Fedtpuden til stede i den indre ikke-artikulerende overflade af patella blev fjernet, hakket og enzymatisk fordøjet. IFP-MSC'erne blev med succes isoleret og dyrket in vitro (figur 2A).
Udvidelse og klonogen evne af IFP-MSC'er De isoler...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Expansion, and Differentiation of Mesenchymal Stem Cells from the Infrapatellar Fat Pad of the Goat Stifle Joint at JoVE.com

Isolation, Expansion, and Differentiation of Mesenchymal Stem Cells from the Infrapatellar Fat Pad of the Goat Stifle Joint

Infrapatellar fedtpude mesenkymale stamceller (IFP-MSC'er) kan let isoleres fra knæleddets infrapatellære fedtpude. De formerer sig godt in vitro, danner CFU-F-kolonier og differentierer sig til adipogene, kondrogene og osteogene slægter. Heri gives metoden til isolering, udvidelse og differentiering af IFP-MSC'er fra gedekvælningsled.

Isolering, ekspansion og differentiering af mesenkymale stamceller fra den infrapatellære fedtpude i gedekvæleleddet

The IFP, present in the knee joint, serves as a promising source of MSCs. The IFP is an easily accessible tissue as it is routinely resected and discarded ...

Infrapatellar Fat Pad-afledte mesenkymale stamceller, eller kort sagt IFP-MSC'er, er en relativt mindre undersøgt stamcelletype. Denne protokol er en enkel, pålidelig og reproducerbar metode, der demonstrerer isolering af IFP-MSC'er fra gedekvælningsled. Den største fordel ved teknikken er, at der kan opnås et stort antal IFP-MSC'er af høj kvalitet.Isolerede IFP-MSC'er kan differentiere sig i flere slægter og have omfattende regenerativt potentiale. På grund af deres anatomiske placering har IFP-MSC'er fået interesse i at reparere bruskdefekter og lindre brusknedbrydning ved slidgigt. Metoden har implikationer for cellebaseret terapi inden for vævsteknologi og regenerativ medicin.Proceduren for isolering, udvidelse og differentiering af IFP-MSC'er vil blive demonstreret af Dr. Sugata Hazra og Mr. Aman Mahajan. For at begynde isoleringen af Infrapatellar Fat Pad Mesenchymale stamceller eller IFP-MSC'er skal du indsamle gedelbensled, der omfatter omkring 15 centimeter af lårbens- og tibialområderne i bagbenene i en steriliseret opsamlingsprøveboks. Opbevar prøven ved fire grader Celsius til transport til laboratoriet til videre behandling.Placer prøven på en 150 millimeter petriskål og sørg for at behandle prøven aseptisk og et biosikkerhedsskab under hele proceduren. Skyl det grundigt med autoklaveret PBS suppleret med antibiotika. Hold prøven hydreret ved hjælp af PBS.Undersøg omhyggeligt prøvens anatomiske områder. For nem adgang skal du fjerne de ekstra væv fra begge de lange knogler helt ved at holde lårbenets endeflade med den ene hånd og skære den i længderetningen mod leddet ved hjælp af en skarp saks. Derefter, uden at forstyrre vævet omkring ledkapslen, fjern musklerne og fedtvævet fra knoglen.På samme måde skal du lave et andet snit i tibialenden af prøven og fjerne muskler og fedtvæv fra tibialbenet. Sørg for, at begge de lange knogler er helt eksponerede, og at ledkapslen er synlig. Lav derefter et snit fra hver side af synovialmembranen for at skære ledleddet op.Skær knæskallen fri fra synovialmembranen og patellar ledbånd ved hjælp af frisk steriliseret saks og tang. Anbring straks den adskilte patella i en petriskål, der indeholder PBS. Fra den adskilte patella fjernes hele fedtpuden på den indre overflade ved hjælp af saks og tang.Saml det i en anden frisk petriskål, og hak det ved hjælp af en skalpel. Medtag andre kirurgiske værktøjer til at opnå de små fedtsegmenter på omkring to til tre millimeter. Brug en spatel til at overføre hakket væv til et 50 ml centrifugerør og vask det tre gange med PBS suppleret med antibiotika i 15 minutter ved stuetemperatur ved hjælp af en reagensglasblander.Til enzymatisk fordøjelse inkuberes omkring fem gram hakket væv i Dulbeccos modificerede ørnemedier eller DMEM, lavglukosemedier indeholdende 1,5 milligram pr. milliliter type II collagenase og 2% FBS ved 37 grader Celsius i 12 til 16 timer. Aspirer forsigtigt det fordøjede væv og filtrer det gennem en 70 mikron cellesil for at fjerne enhver ufordøjet del. Filtratet centrifugeres i et 15 ml centrifugerør ved 150 gange g i fem minutter.Supernatanten fjernes, før cellepillen vaskes med DMEM med lavt glucoseindhold to gange. Ophæng pillen igen i komplet DMEM, også kendt som ekspansionsmedier. Frø cellerne på en 150 millimeter petriskål og dyrk dem i ekspansionsmediet suppleret med fem nanogram pr. milliliter basisk fibroblastvækstfaktor eller BFGF og 50 mikrogram pr. milliliter 2-phospho-L-ascorbinsyre trinatriumsalt.Inkuber cellerne ved 37 grader Celsius i en 5% kuldioxidinkubator for at tillade cellerne at klæbe og proliferere. Overvåg vedhæftning og vækst af cellerne dagligt. For korrekt vedligeholdelse og udvidelse af IFP-MSC'erne skal du skifte medie hver tredje dag.Mens du skifter medie, tilsættes friske fem nanogram pr. milliliter BFGF og 50 mikrogram pr. millimeter 2-phospho-L-ascorbinsyretrinatriumsalt direkte til petriskålen. Når cellerne bliver 80% til 90% sammenflydende, subkultur dem ved at fjerne ekspansionsmediet fra petriskålen og vaske cellerne med 1X PBS. Derefter tilsættes fire milliliter 0,25% Trypsin-EDTA til skålen og inkuberer cellerne ved 37 grader Celsius i en 5% kuldioxidinkubator.Efter fire minutter skal du trykke på pladen på siden for at løsne cellerne. Bekræft den fuldstændige frigørelse af alle cellerne under et mikroskop. Når det er bekræftet, tilsæt en lige stor mængde ekspansionsmedier for at neutralisere trypsinet.Brug en pipette til at opsamle disse dissocierede celler i et frisk 15 ml polypropylenrør og centrifuger dem ved 150 gange g i fem minutter ved stuetemperatur. Supernatanten kasseres, og pelletpen opslæmmes igen i det ønskede rumfang ekspansionsmedie. Tæl cellerne ved hjælp af standardcelletællingsmetoden og subkultur dem til yderligere ekspansion ved en såtæthed på 10.000 celler pr. Kvadratcentimeter i en 150 ml petriskål.For alle analyserne skal du bruge et sammenflydende monolag af celler med passagenummer P2 til P5. Når de ekspanderede celler når 80% til 90% sammenløb, dissociere cellerne ved hjælp af Trypsin-EDTA-opløsning, før pelletering dem ned i et 15-milliliter centrifugerør ved 150 gange g i fem minutter. Derefter resuspenderes pelleten i gedeplasma med en densitet på 2 millioner celler pr. 50 mikroliter. Tilsæt 50 mikroliter plasma indeholdende cellerne på en steriliseret 90 millimeter petriskål, efterfulgt af tilsætning af calciumchlorid i en slutkoncentration på 0,3%Bland godt for at fremstille tværbundet plasmahydrogel.Efter inkubation af den fremstillede hydrogel ved 37 grader Celsius i 40 minutter overføres hydrogelerne til 24-brønds vævskulturplader indeholdende kondrogene medier. Skift medie hver tredje dag i 14 dage. De hydrogeler, der dyrkes i komplette DMEM-medier uden TGF-beta 1, betragtes som ikke-inducerede kontroller.Efter 14 dages kondrogen differentiering af celler i plasmahydrogel, vask hydrogelerne tre gange med PBS i fem minutter hver, og fastgør prøverne i neutralt bufret formalin i tre timer. Isolerede IFP-MSC'er var homogent klæbende og opnåede langstrakt morfologi inden for 24 timer efter in vitro-dyrkning. Cellerne spredte sig effektivt 80% til 90% sammenløb inden for seks dage efter ekspansion og viste klonogen kapacitet, hvilket indikerer effektive proliferative og selvfornyelsesevner.Når de blev behandlet for at differentiere sig til adipogen afstamning, producerede de isolerede celler lipiddråber, hvilket blev bekræftet ved Oil Red O-farvning på dag 14 og 21. Sådanne oliedråber var ikke synlige i cellerne uden adipogene inducerende faktorer. De isolerede celler indkapslet i plasmahydrogel viste dannelsen af hvidt og blankt neovæv efter 14 dage i den inducerede gruppe viste det kondrogene potentiale.Den ikke-inducerede gruppe havde bleg hvidt væv med reduceret glans. Derudover indikerede positiv histologisk farvning for Alcian Blue og Safranin O i den inducerede gruppe, at cellerne kunne udskille sulfaterede glycosaminoglycaner, en af hovedkomponenterne i bruskmatrixen. I modsætning hertil var hydrogelsektionerne fra de ikke-inducerede grupper negative for Safranin O- og Alcian Blue-farvning, hvilket kun bekræftede de mesenkymale stamcellers kondrogene differentieringspotentiale i nærvær af kondrogene stimuli.De isolerede celler induceret med osteogene medier viste positiv farvning for alkalisk phosphatase, hvilket bekræftede mineralisering i slutningen af 14 dage. Efter 28 dages osteogen induktion blev de forkalkede aflejringer observeret med Alizarin Red S-farvning. Resultaterne understregede differentieringspotentialet for inducerede celler i adipogene, kondrogene og osteogene slægter.Det er vigtigt at behandle prøven under aseptiske forhold for at undgå kontaminering. Det er også vigtigt at identificere patellaens korrekte placering. Denne procedure åbner vejen for at isolere forskellige celletyper, såsom artikulære chondrocytter, ligamentfibroblaster og stamceller fra synovium og synovialvæske, der har brede anvendelser inden for regenerativ medicin.Efter isolering af IFP-MSC'er ved hjælp af denne teknik blev dens effektivitet især undersøgt til regenerering af muskuloskeletale væv, såsom brusk, knogler og ledbånd ved hjælp af stillads- og stilladsfrie tilgange.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

Alginat mikrokapselsammensætning som en 3D-platform for Formering og differentiering af humane embryonale stamceller (embryonale) til forskellige linier

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

Udvikling, Expansion, og<em&gt; In vivo</em&gt; Overvågning af menneskerettigheder NK-celler fra humane embryonale stamceller (hESCs), og og induceret pluripotente stamceller (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on Poly(&#949;-caprolactone) Electrospun Yarns

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on PolyÃƒÅ½Ã‚Âµ-caprolactone Electrospun Yarns

Optimering Binding af humane mesenchymstamceller på Poly (ε-caprolacton) elektrospundne Garn

Research into biomaterials and tissue engineering often includes cell-based in vitro investigations, which require initial knowledge of the starting cell ...

Scaffold-supported Transplantation of Islets in the Epididymal Fat Pad of Diabetic Mice

Stillads-understøttet transplantation af islænder i epididymisk fedtpude af diabetiske mus

Islet transplantation has been clinically proven to be effective at treating type 1 diabetes. However, the current intrahepatic transplantation strategy ...

Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells

Isolering af mesenkymale stamceller fra menneskelige alveolær Periosteum og effekter af D-Vitamin på Osteogenic aktivitet af Periosteum-afledte celler

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the ...

Exploring the Potential of Mesenchymal Stem Cell Sheet on The Development of Hepatocellular Carcinoma In Vivo

Exploring the Potential of Mesenchymal Stem Cell Sheet on The Development of Hepatocellular Carcinoma In Vivo

Udforskning af muligheden for mesenkymale stamceller ark på udvikling af hepatocellulært karcinom In Vivo

An in vivo animal model that mimics human cancer could have various applications that deliver significant clinical information. The currently used ...

Construction and Use of an Electrical Stimulation Chamber for Enhancing Osteogenic Differentiation in Mesenchymal Stem/Stromal Cells In Vitro

Konstruktion og brug af en elektrisk Stimulation kammer for at øge Osteogenic differentiering i mesenkymale stamceller/stromale celler In Vitro

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) have been used extensively to promote bone healing in tissue engineering approaches. Electrical stimulation (EStim) ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Single-Cell Optisk Action Potentiel måling i human induceret pluripotente stamcelle-afledte kardiomyocytter

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Generation of Human Blood Vessel Organoids from Pluripotent Stem Cells

Generering af humane blodkarorganoider fra pluripotente stamceller

An organoid is defined as an engineered multicellular in vitro tissue that mimics its corresponding in vivo organ such that it can be used to study ...

Creation of a Knee Joint-on-a-Chip for Modeling Joint Diseases and Testing Drugs

Oprettelse af et knæled-på-en-chip til modellering af ledsygdomme og test af lægemidler

The high prevalence of debilitating joint diseases like osteoarthritis (OA) poses a high socioeconomic burden. Currently, the available drugs that target ...