Name: isolation, expansion, and differentiation of mesenchymal stem cells from the infrapatellar fat pad of the goat stifle joint
Uploaded: 2022-08-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Expansion, and Differentiation of Mesenchymal Stem Cells from the Infrapatellar Fat Pad of the Goat Stifle Joint at JoVE.com

SH erkent de steun van de Institute Post-Doctoral Fellowship van IIT Kanpur en SYST-subsidie van DST (SEED Division) (SP / YO / 618/ 2018). AM erkent het Indian Institute of Technology-Kanpur (IIT-Kanpur) voor een Instituut fellowship. DSK erkent Gireesh Jankinath Chair Professorship en Department of Biotechnology, India, voor financiering (BT / PR22445 / MED / 32/571/2016). AM, SH en DSK bedanken het Mehta Family Centre for Engineering in Medicine bij IIT-Kanpur voor hun genereuze steun.

Het protocol is gebaseerd op de isolatie van IFP-MSC's van geiten. Geiten-IFP en bloed werden verzameld in een lokaal slachthuis. Aangezien dergelijke weefselcollecties buiten het bereik van een institutionele commissie voor dierethiek vallen, was ethische goedkeuring niet vereist.
1. Isolatie van IFP-MSC's uit het femorotibiale gewricht van geitenknie
<ol><li>Verzamel het femorotibiale gewricht (monster) van de geit dat ~ 15 cm elk van de femur- en tibiale gebieden van de a...

In dit protocol is een eenvoudige, betrouwbare en reproduceerbare methode voor de isolatie van MSC's van geiten-IFP opgenomen. Cellen geïsoleerd met behulp van deze methode zijn met succes gebruikt in onze eerdere studies voor in vitro weefselregeneratie. Er werd waargenomen dat de geïsoleerde cellen proliferatief waren, reageerden op verschillende groeifactoren en hun biologische activiteit behielden wanneer ze werden gezaaid op elektrospunvezels en steigers25,26<sup class="...

Mesenchymale stamcellen (MSC's) zijn een aantrekkelijke kandidaat voor celgebaseerde therapieën in de regeneratieve geneeskunde 1,2. Ze kunnen worden geoogst uit verschillende weefselbronnen zoals beenmerg, navelstreng, placenta, tandpulp en onderhuids vetweefsel3. Aangezien de beschikbaarheid van stamcellen bij volwassenen echter beperkt is en hun isolatieprocedure vaak invasief is (wat resulteert in morbiditeit op de donorplaats), is het wenselijk om een alternatieve stamcelbron te hebben die deze uitdagingen kan omzeilen.
Het kniegewricht is een depot van verschillende celtypen, zoals infrapatellaire vetkussen-afgeleide MSC's, synoviale membraan-afgeleide MSC's, synoviale vloeistof-afgeleide MSC's, ligament fibroblasten, gewrichts chondrocyten, enz. 4,5,6. Deze cellen hebben het potentieel om op grote schaal te worden onderzocht in musculoskeletale weefseltechnologie-gebaseerd onderzoek. Daarom zou het kniegewricht een mogelijke en betrouwbare bron kunnen zijn van meerdere soorten MSC's. Vetdepot in het kniegewricht, bekend als de infrapatellar fat pad (IFP) of Hoffa's fat pad, is een veelbelovende en alternatieve keuze van MSC depot. De IFP is een relatief gemakkelijk toegankelijke en klinisch haalbare bron van MSC's, omdat het routinematig wordt gereseceerd en weggegooid als chirurgisch afval tijdens knieartroscopie of open kniechirurgie. Verwijdering van de IFP wordt geassocieerd met minimale morbiditeit op de donorplaats, waardoor het ook een aantrekkelijke weefselbron is. Hoewel ze een vergelijkbaar fenotypisch profiel hebben, hebben MSC's van IFP (IFP-MSC's) een verbeterd clonogene potentieel in vergelijking met van beenmerg afgeleide mesenchymale stamcellen (BM-MSC's)6 en een betere proliferatieve capaciteit in vergelijking met subcutane adipose-afgeleide stamcellen (ADSC's)7. Interessant is dat in vergelijking met synoviale vloeistof-afgeleide MSC's (SF-MSC's), IFP-MSC's hun proliferatieve capaciteit niet verliezen bij late passages, noch neemt de verdubbelingstijd toe bij late passages. Dit suggereert dat IFP-MSC's tijdens celexpansie een voldoende groot aantal cellen kunnen bereiken voor in vitro weefselmanipulatietoepassingen zonder hun proliferatiesnelheid in gevaar te brengen8. Recente studies hebben ook gesuggereerd dat IFP-MSC's een superieur chondrogene differentiatiepotentieel bezitten in vergelijking met van beenmerg afgeleide MSC's (BMSCs) en van vetweefsel afgeleide MSC's (ADSC's), waarschijnlijk vanwege hun anatomische nabijheid tot gewrichtskraakbeen, wat wijst op hun geschiktheid voor kraakbeenweefseltechnologie 6,7,9,10. Bovendien bezitten ze ook leeftijdsonafhankelijk osteogene differentiatiepotentiaal11. Intra-articulaire injectie van IFP-MSC's heeft aangetoond dat het pijn vermindert en de functies van het kniegewricht verbetert bij patiënten met artrose (OA)12,13. Verder zijn sterke immunosuppressieve reacties en verbeterde immunomodulerende eigenschappen van IFP-MSC's in aanwezigheid van inflammatoire cytokines tijdens pathologische aandoeningen ook gemeld6.
IFP-MSC's zijn een veelbelovende en alternatieve bron van MSC's; hun therapeutische voordeel in tissue engineering en regeneratieve geneeskunde wordt echter relatief minder onderzocht. De bestaande studies over IFP-MSC's hebben voornamelijk gebruik gemaakt van cellen van menselijke donoren. Onder deze, een paar recente studies hebben IFP-MSC's van gezonde menselijke donoren (niet-artritis patiënten, leeftijd 17-60 jaar)6,14 onderzocht, terwijl de meeste studies IFP-MSC's hebben gebruikt van oudere patiënten die een totale knievervangende operatie ondergaan (zieke patiënten, leeftijd 70-80 jaar). Aangezien bekend is dat zowel leeftijd als ziekte de normale werking van stamcellen veranderen (verminderd aantal en verlies van functioneel potentieel), kan dit mogelijk leiden tot inconsistenties in de uitkomst van de op MSC gebaseerde studies 7,15,16,17. Daarnaast vormt het gebruik van IFP-MSC's van patiënten met pathofysiologische aandoeningen (bijv. artritis en obesitas) ook problemen om de basiskenmerken van gezonde cellen in vitro te begrijpen, waardoor het een beperkende factor is bij de ontwikkeling van op MSC's gebaseerde therapieën. Om deze problemen op te lossen, is het gebruik van IFP-MSC's van gezonde donoren van vitaal belang. Omdat de toegang tot een gezonde menselijke donor een uitdaging is, kunnen diermodellen een beter alternatief zijn. In dit opzicht zijn er een paar studies waarbij IFP is geïsoleerd uit muizen18. Vanwege de kleine omvang van het vetkussen bij normale muizen, zijn vetweefsels van meerdere dieren echter gecombineerd om voldoende weefsel te krijgen om uitgebreide experimentele procedures uit te voeren19. Daarom is er behoefte aan een groot diermodel, dat zou kunnen voldoen aan de eis voor het hogere aantal cellen en tegelijkertijd zou kunnen voldoen aan de 3R-principes (verfijnen, vervangen en verminderen) in dieronderzoek20. Het gebruik van grote dieren heeft belangrijke implicaties in translationeel onderzoek. Specifiek, in musculoskeletale weefseltechnologie, is een reeks grote dieren zoals honden, varkens, schapen, geiten en paarden onderzocht21. Geit (Capra aegagrus hircus) is een uitstekende keuze van grote dieren omdat het verstikkingsgewricht de dichtstbijzijnde anatomie heeft bij het menselijke kniegewricht 22,23,24. De subchondrale bottrabeculaire structuur en subchondrale botdikte van geiten zijn vergelijkbaar met mensen, en het aandeel van het kraakbeen tot bot is ook gemeld dat het dicht bij de mensligt 21. Bovendien zijn geiten over de hele wereld op grote schaal gedomesticeerd, waardoor ze gemakkelijk beschikbaar zijn als ze skeletachtig volwassen zijn. Verder hebben lage onderhoudskosten en eenvoudige bediening ze tot een aantrekkelijk diermodel voor onderzoek gemaakt22.
In deze studie wordt een eenvoudig protocol voor de isolatie van IFP-MSC's uit het verstikkingsgewricht van Capra aegagrus hircus (geit) en in vitro kweekomstandigheden voor hun expansie en differentiatie aangetoond. De geïsoleerde cellen zijn adherent, hebben MSC-achtige morfologie, vormen CFU-F (kolonievormende eenheid-fibroblast) kolonies en bezitten adipogene, chondrogene en osteogene differentiatiepotentialen. Daarom tonen IFP-MSC's potentieel als een alternatieve bron van MSC's voor biomedische toepassingen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#946;-glycerophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9422-10G</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin- 0.02% EDTA</td>
			<td>Hi-Media</td>
			<td>TCL049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15-mL centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>49752-10G</td>
			<td>50 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TCL021-50ml</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50-mL centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian Blue</td>
			<td>Hi-Media</td>
			<td>RM471</td>
			<td>For sufated gycosaminoglycans staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alizarin Red S</td>
			<td>S D Fine-Chem Limited</td>
			<td>26048-25G</td>
			<td>For calcium deposition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>A011</td>
			<td>2.5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic fibroblast growth factor (bFGF)</td>
			<td>Sino Biologicals</td>
			<td>10014-HNAE</td>
			<td>5 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCIP/NBT ALP Substrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B5655-5TAB</td>
			<td>For ALP staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>MB-083</td>
			<td>Long name: Bovine Serum Albumin (1.25 mg/mL )</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TCP-182</td>
			<td>70 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>REMI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin</td>
			<td>RANBAXY LAB. Limited</td>
			<td>B17407T1</td>
			<td>2.5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Violet</td>
			<td>S D Fine-Chem Limited</td>
			<td>42555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.94925.0521</td>
			<td>25 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2915</td>
			<td>1 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM LG</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D5523</td>
			<td>Long name: Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Media Low Glucose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270</td>
			<td>Long name: Fetal Bovine Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution 37%-41%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>61780805001730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indomethacin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7378</td>
			<td>100 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I9278</td>
			<td>10 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon Eclipse TS 100</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS + 1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2521-5mL</td>
			<td>Long name: insulin, transferrin, sodium selenite + linoleic-BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Proline</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TO-109-25G</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>61751605001730</td>
			<td>For lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Meck</td>
			<td>1.07018.2521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes and sterile tips (20 &#181;L, 200 &#181;L, 1000 &#181;L)</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MUSE Cell analyser</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td></td>
			<td>For cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT compound</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>4583</td>
			<td>Long name: Optimal Cutting Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red O dye</td>
			<td>S D Fine-Chem Limited</td>
			<td>54304</td>
			<td>For lipid vacuole staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>A007</td>
			<td>100 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (150 mm and 90 mm)</td>
			<td>NEST</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safranin O</td>
			<td>S D Fine-Chem Limited</td>
			<td>50240</td>
			<td>For sufated gycosaminoglycans staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3434</td>
			<td>3.4 % (w/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile scissors, forceps and scalpels</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For isolation of IFP-MSC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.94953.0521</td>
			<td>35 % (w/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF-&#946;1</td>
			<td>Sino Biologicals</td>
			<td></td>
			<td>Long name: Transforming growth factor- &#946;1 (10 ng/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture incubator 37 &#176;C, 5% CO2</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris buffer</td>
			<td>Merck</td>
			<td>61771405001730</td>
			<td>For lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>S D Fine-Chem Limited</td>
			<td>40632</td>
			<td>For lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type II collagenase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17101015</td>
			<td>1.5 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin D3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9756-1G</td>
			<td>10 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Well plates (6 -WP and 24-WP)</td>
			<td>NEST</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, expansion, and differentiation of mesenchymal stem cells from the infrapatellar fat pad of the goat stifle joint

De IFP, aanwezig in het kniegewricht, dient als een veelbelovende bron van MSC's. De IFP is een gemakkelijk toegankelijk weefsel omdat het routinematig wordt gereseceerd en weggegooid tijdens artroscopische procedures en knievervangende operaties. Bovendien wordt de verwijdering ervan geassocieerd met minimale morbiditeit op de donorplaats. Recente studies hebben aangetoond dat IFP-MSC's hun proliferatiecapaciteit niet verliezen tijdens in vitro expansie en een leeftijdsonafhankelijk osteogene differentiatiepotentieel hebben. IFP-MSC's bezitten een superieur chondrogene differentiatiepotentieel in vergelijking met van beenmerg afgeleide MSC's (BMSCs) en van vetweefsel afgeleide stamcellen (ADSC's). Hoewel deze cellen gemakkelijk te verkrijgen zijn bij oudere en zieke patiënten, is hun effectiviteit beperkt. Daarom is het gebruik van IFP-MSC's van gezonde donoren belangrijk om hun werkzaamheid in biomedische toepassingen te bepalen. Omdat de toegang tot een gezonde menselijke donor een uitdaging is, kunnen diermodellen een beter alternatief zijn om fundamenteel begrip mogelijk te maken. Grote dieren zoals honden, paarden, schapen en geiten spelen een cruciale rol in translationeel onderzoek. Onder deze zou de geit een voorkeursmodel kunnen zijn, omdat het verstikkingsgewricht van de geit de dichtstbijzijnde anatomie heeft bij het menselijke kniegewricht. Bovendien kan goat-IFP voldoen aan de hogere MSC-aantallen die nodig zijn voor weefselregeneratietoepassingen. Bovendien maken lage kosten, beschikbaarheid en naleving van de 3R-principes voor dieronderzoek ze een aantrekkelijk model. Deze studie toont een eenvoudig protocol voor het isoleren van IFP-MSC's van het verstikkingsgewricht van geiten en in vitro kweekomstandigheden voor hun expansie en differentiatie. De aseptisch geïsoleerde IFP van de geit werd gewassen, gehakt en enzymatisch verteerd. Na filtratie en centrifugatie werden de verzamelde cellen gekweekt. Deze cellen waren adherent, hadden MSC-achtige morfologie en vertoonden een opmerkelijk clonogene capaciteit. Verder onderscheidden ze in adipogene, chondrogene en osteogene afstammingslijnen, wat hun multipotentie aantoonde. Concluderend toont de studie de isolatie en uitbreiding van MSC's, die potentieel tonen in weefseltechnologie en regeneratieve geneeskundetoepassingen.

Isolatie van IFP-MSC's uit het femorotibiale gewricht van de geit De stappen die betrokken zijn bij de isolatie van IFP-MSC's van het verstikkingsgewricht van een geit zijn weergegeven in figuur 1. Het vetkussen dat aanwezig was in het binnenste niet-articulerende oppervlak van de patella werd verwijderd, gehakt en enzymatisch verteerd. De IFP-MSC's werden met succes geïsoleerd en in vitro gekweekt (figuur 2A).
<p class="jove_co...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Expansion, and Differentiation of Mesenchymal Stem Cells from the Infrapatellar Fat Pad of the Goat Stifle Joint at JoVE.com

Isolation, Expansion, and Differentiation of Mesenchymal Stem Cells from the Infrapatellar Fat Pad of the Goat Stifle Joint

Infrapatellaire vetkussen mesenchymale stamcellen (IFP-MSC's) kunnen gemakkelijk worden geïsoleerd uit de infrapatellaire vetschijf van het kniegewricht. Ze vermenigvuldigen zich goed in vitro, vormen CFU-F-kolonies en differentiëren in adipogene, chondrogene en osteogene afstammingslijnen. Hierin wordt de methodologie gegeven voor de isolatie, uitbreiding en differentiatie van IFP-MSC's van geitenstikselgewricht.

Isolatie, uitbreiding en differentiatie van mesenchymale stamcellen uit de infrapatellaire vetpad van de geitenstikkingsverbinding

The IFP, present in the knee joint, serves as a promising source of MSCs. The IFP is an easily accessible tissue as it is routinely resected and discarded ...

Infrapatellar Fat Pad-afgeleide Mesenchymale Stamcellen, of kortweg IFP-MSC's, is een relatief minder bestudeerd stamceltype. Dit protocol is een eenvoudige, betrouwbare en reproduceerbare methode die de isolatie van IFP-MSC's van geitenstikselassets aantoont. Het grote voordeel van de techniek is dat een groot aantal hoogwaardige IFP-MSC's kan worden verkregen.Geïsoleerde IFP-MSC's kunnen zich onderscheiden in meerdere afstammingslijnen en beschikken over een uitgebreid regeneratief potentieel. Vanwege hun anatomische locatie hebben IFP-MSC's interesse gekregen in het repareren van kraakbeendefecten en het verlichten van kraakbeendegradatie bij artrose. De methode heeft implicaties voor celgebaseerde therapie op het gebied van tissue engineering en regeneratieve geneeskunde.De procedure voor isolatie, uitbreiding en differentiatie van IFP-MSC's zal worden gedemonstreerd door Dr. Sugata Hazra en Mr.Aman Mahajan. Om te beginnen met de isolatie van Infrapatellar Fat Pad Mesenchymale Stamcellen, of IFP-MSC's, verzamelt u geiten femorotibiale gewrichten die ongeveer 15 centimeter van de femorale en tibiale gebieden van de achterpoten omvatten in een gesteriliseerde verzamelmonsterdoos. Bewaar het monster bij vier graden Celsius voor transport naar het laboratorium voor verdere verwerking.Plaats het monster op een petrischaaltje van 150 millimeter en zorg ervoor dat het monster tijdens de hele procedure aseptisch en een bioveiligheidskast wordt verwerkt. Spoel het grondig af met geautoclaveerde PBS aangevuld met antibiotica. Houd het monster gehydrateerd met PBS.Onderzoek zorgvuldig de anatomische gebieden van het monster. Voor gemakkelijke toegang verwijdert u de extra weefsels van beide lange botten volledig door het eindoppervlak van het dijbeen met één hand vast te houden en het in de lengterichting naar het gewricht te snijden met een scherpe schaar. Verwijder vervolgens, zonder het weefsel rond het gewrichtskapsel te verstoren, de spieren en het vetweefsel uit het bot.Maak op dezelfde manier nog een incisie aan het tibiale uiteinde van het monster en verwijder de spieren en het vetweefsel uit het tibiale bot. Zorg ervoor dat beide lange botten volledig bloot zijn en dat het gewrichtskapsel zichtbaar is. Maak vervolgens een incisie aan weerszijden van het synoviale membraan om het knikgewricht open te snijden.Knip de patella los van het synoviale membraan en de patellabanden met behulp van verse gesteriliseerde scharen en tangen. Plaats de afgescheiden patella onmiddellijk in een petrischaal met PBS. Verwijder van de gescheiden patella het volledige vetkussen dat op het binnenoppervlak aanwezig is met een schaar en een tang.Verzamel het in een andere verse petrischaal en hak het fijn met een scalpel. Neem andere chirurgische hulpmiddelen op om de kleine vetsegmenten van ongeveer twee tot drie millimeter te verkrijgen. Gebruik een spatel om het gehakte weefsel over te brengen naar een centrifugebuis van 50 milliliter en was het driemaal met PBS aangevuld met antibiotica gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur met behulp van een reageerbuismixer.Voor enzymatische spijsvertering incubeer je ongeveer vijf gram van het gehakte weefsel in Dulbecco's Modified Eagle Media, of DMEM, laag-glucose media met 1,5 milligram per milliliter type II collagenase en 2% FBS bij 37 graden Celsius gedurende 12 tot 16 uur. Zuig het verteerde weefsel zorgvuldig op en filter het door een celzeef van 70 micron om onverteerde delen te verwijderen. Centrifugeer het filtraat in een centrifugebuis van 15 milliliter bij 150 maal g gedurende vijf minuten.Verwijder het supernatant voordat u de celpellet tweemaal met DMEM-laag glucose wast. Suspensie de pellet opnieuw in volledige DMEM, ook wel expansiemedia genoemd. Zaai de cellen op een petrischaaltje van 150 millimeter en kweek ze in de expansiemedia aangevuld met vijf nanogram per milliliter Basic Fibroblast Growth Factor, of BFGF, en 50 microgram per milliliter 2-Phospho-L-ascorbinezuur trinatriumzout.Incubeer de cellen bij 37 graden Celsius in een 5% koolstofdioxide-incubator om de cellen te laten hechten en prolifereren. Controleer dagelijks de aanhechting en groei van de cellen. Voor goed onderhoud en uitbreiding van de IFP-MSC's, verwissel de media om de drie dagen.Voeg tijdens het veranderen van de media verse vijf nanogram per milliliter BFGF en 50 microgram per millimeter 2-fosfo-L-ascorbinezuur trinatriumzout rechtstreeks toe aan de petrischaal. Zodra de cellen 80% tot 90% confluent worden, subcultureer ze door de expansiemedia uit de petrischaal te verwijderen en de cellen te wassen met 1X PBS. Voeg vervolgens vier milliliter van 0,25% Trypsine-EDTA toe aan het gerecht en incubeer de cellen bij 37 graden Celsius in een 5% koolstofdioxide-incubator.Tik na vier minuten op de plaat op zijn kant om de cellen los te maken. Bevestig het volledige loslaten van alle cellen onder een microscoop. Eenmaal bevestigd, voeg een gelijk volume expansiemedia toe om het trypsine te neutraliseren.Gebruik een pipet om deze gedissocieerde cellen te verzamelen in een verse polypropyleenbuis van 15 milliliter en centrifugeer ze bij 150 keer g gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Gooi het supernatant weg en resuspenseer de pellet in het gewenste volume expansiemedia. Tel de cellen met behulp van de standaard celtelmethode en subcultureer ze voor verdere expansie met een zaaidichtheid van 10.000 cellen per vierkante centimeter in een petrischaaltje van 150 milliliter.Gebruik voor alle testen een confluente monolaag van cellen met passagenummer P2 tot P5. Wanneer de geëxpandeerde cellen 80% tot 90% confluency bereiken, dissocieert u de cellen met behulp van trypsine-EDTA-oplossing voordat u ze gedurende vijf minuten in een centrifugebuis van 15 milliliter op 150 keer g pelleteert. Resuspendeer de pellet vervolgens in geitenplasma met een dichtheid van 2 miljoen cellen per 50 microliter. Voeg 50 microliter plasma met de cellen toe aan een gesteriliseerde petrischaal van 90 millimeter, gevolgd door de toevoeging van calciumchloride in een eindconcentratie van 0,3% Meng goed om verknoopte plasmahydrogel te fabriceren.Breng na het incuberen van de gefabriceerde hydrogel op 37 graden Celsius gedurende 40 minuten de hydrogels over op 24-well weefselkweekplaten met chondrogene media. Verander de media elke drie dagen gedurende 14 dagen. De hydrogels gekweekt in complete DMEM-media zonder TGF-beta 1 worden beschouwd als niet-geïnduceerde controles.Na 14 dagen chondrogene differentiatie van cellen in plasmahydrogel, wast u de hydrogels driemaal met PBS gedurende elk vijf minuten en fixeert u de monsters gedurende drie uur in neutraal gebufferd formaline. Geïsoleerde IFP-MSC's waren homogeen aanhangend en bereikten langwerpige morfologie binnen 24 uur na in vitro kweek. De cellen vermenigvuldigden efficiënt 80% tot 90% confluency binnen zes dagen na expansie en vertoonden clonogene capaciteit, wat wijst op efficiënte proliferatieve en zelfvernieuwingscapaciteiten.Wanneer behandeld om te differentiëren in adipogene afstamming, produceerden de geïsoleerde cellen lipidedruppels, wat werd bevestigd door Oil Red O-kleuring op dag 14 en 21. Dergelijke oliedruppels waren niet zichtbaar in de cellen zonder adipogene inducerende factoren. De geïsoleerde cellen ingekapseld in plasmahydrogel toonden de vorming van wit en glanzend neoweefsel na 14 dagen in de geïnduceerde groep vertoonde het chondrogene potentieel.De niet-geïnduceerde groep had bleek wit weefsel met verminderde glans. Bovendien gaf positieve histologische kleuring voor Alcian Blue en Safranin O in de geïnduceerde groep aan dat de cellen gesulfateerde glycosaminoglycanen konden afscheiden, een van de belangrijkste componenten van de kraakbeenmatrix. Daarentegen waren de hydrogelsecties van de niet-geïnduceerde groepen negatief voor Safranin O- en Alcian Blue-kleuring, wat het chondrogene differentiatiepotentieel van de mesenchymale stamcellen alleen in de aanwezigheid van chondrogene stimuli bevestigt.De geïsoleerde cellen geïnduceerd met osteogene media vertoonden positieve kleuring voor alkalische fosfatase, wat mineralisatie aan het einde van 14 dagen bevestigde. Na 28 dagen osteogene inductie werden de verkalkte afzettingen waargenomen met Alizarine Red S-kleuring. De resultaten onderstreepten het differentiatiepotentieel van geïnduceerde cellen in adipogene, chondrogene en osteogene afstammingslijnen.Het is essentieel om het monster onder aseptische omstandigheden te verwerken om besmetting te voorkomen. Het is ook belangrijk om de juiste locatie van de patella te identificeren. Deze procedure opent de weg om verschillende celtypen te isoleren, zoals gewrichtschorndrocyten, ligamentfibroblasten en stamcellen uit synovium en synoviale vloeistof, met brede toepassingen in de regeneratieve geneeskunde.Na isolatie van IFP-MSC's met behulp van deze techniek, werd de effectiviteit ervan met name onderzocht voor regeneratie van musculoskeletale weefsels, zoals kraakbeen, bot en ligament met behulp van steiger- en steigervrije benaderingen.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

Alginaat microcapsule als een 3D-platform voor de vermeerdering en differentiatie van humane embryonale stamcellen (hESC) tot verschillende geslachten

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

Ontwikkeling, uitbreiding en<em&gt; In vivo</em&gt; Controle van Human NK cellen uit menselijke embryonale stamcellen (hESC &#39;s) en en geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on Poly(&#949;-caprolactone) Electrospun Yarns

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on PolyÃƒÅ½Ã‚Âµ-caprolactone Electrospun Yarns

Het optimaliseren van Bevestiging van menselijke mesenchymale stamcellen op Poly (ε-caprolacton) elektrogesponnen Yarns

Research into biomaterials and tissue engineering often includes cell-based in vitro investigations, which require initial knowledge of the starting cell ...

Scaffold-supported Transplantation of Islets in the Epididymal Fat Pad of Diabetic Mice

Steiger-gesteunde transplantatie van eilanden in het epididymale vetpaneel van diabetische muizen

Islet transplantation has been clinically proven to be effective at treating type 1 diabetes. However, the current intrahepatic transplantation strategy ...

Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells

Isolatie van mesenchymale stamcellen uit menselijke alveolaire beenvlies en effecten van vitamine D op Osteogenic activiteit van beenvlies-afgeleide cellen

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the ...

Exploring the Potential of Mesenchymal Stem Cell Sheet on The Development of Hepatocellular Carcinoma In Vivo

Exploring the Potential of Mesenchymal Stem Cell Sheet on The Development of Hepatocellular Carcinoma In Vivo

Verkennen van de mogelijkheden van mesenchymale stamcellen blad over de ontwikkeling van hepatocellulaire Carcinoma In Vivo

An in vivo animal model that mimics human cancer could have various applications that deliver significant clinical information. The currently used ...

Construction and Use of an Electrical Stimulation Chamber for Enhancing Osteogenic Differentiation in Mesenchymal Stem/Stromal Cells In Vitro

Constructie en het gebruik van een elektrische stimulatie kamer voor het verbeteren van Osteogenic differentiatie in mesenchymale stamcellen/stromale cellen In Vitro

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) have been used extensively to promote bone healing in tissue engineering approaches. Electrical stimulation (EStim) ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Eencellige optische actiepotentiaalmeting in door de mens geïnduceerde pluripotente van stamcellen afgeleide cardiomyocyten

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Generation of Human Blood Vessel Organoids from Pluripotent Stem Cells

Generatie van menselijke bloedvatorganoïden uit pluripotente stamcellen

An organoid is defined as an engineered multicellular in vitro tissue that mimics its corresponding in vivo organ such that it can be used to study ...

Creation of a Knee Joint-on-a-Chip for Modeling Joint Diseases and Testing Drugs

Creatie van een kniegewricht-op-een-chip voor het modelleren van gewrichtsaandoeningen en het testen van medicijnen

The high prevalence of debilitating joint diseases like osteoarthritis (OA) poses a high socioeconomic burden. Currently, the available drugs that target ...