Name: isolation, expansion, and differentiation of mesenchymal stem cells from the infrapatellar fat pad of the goat stifle joint
Uploaded: 2022-08-02T13:00:00
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SH reconnaît le soutien de la bourse postdoctorale de l’Institut de l’IIT Kanpur et la subvention SYST de DST (Division SEED) (SP/YO/618/2018). AM remercie l’Institut indien de technologie de Kanpur (IIT-Kanpur) pour une bourse de l’Institut. DSK remercie la chaire Gireesh Jankinath et le département de biotechnologie de l’Inde pour leur financement (BT/PR22445/MED/32/571/2016). AM, SH et DSK remercient le Mehta Family Centre for Engineering in Medicine de l’IIT-Kanpur pour son généreux soutien.

Le protocole est basé sur l’isolement des IFP-MSC des chèvres. L’IFP caprin et le sang ont été prélevés dans un abattoir local. Étant donné que ces collections de tissus ne relèvent pas d’un comité d’éthique des animaux institutionnel, l’approbation éthique n’était pas requise.
1. Isolement des IFP-CSM de l’articulation fémorotibiale du genou de chèvre
<ol><li>Prélever l’articulation fémorotibiale de chèvre (échantillon) englobant ~15 cm ch...

Dans le protocole actuel, une méthode simple, fiable et reproductible pour l’isolement des CSM de l’IFP caprin a été fournie. Les cellules isolées à l’aide de cette méthode ont été utilisées avec succès dans nos études précédentes pour la régénération tissulaire in vitro. Il a été observé que les cellules isolées étaient prolifératives, répondaient à divers facteurs de croissance et conservaient leur activité biologique lorsqu’elles étaient ensemencées sur des fibres électrofi...

Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) sont un candidat intéressant pour les thérapies cellulaires en médecine régénérative 1,2. Ils peuvent être récoltés à partir d’une variété de sources tissulaires telles que la moelle osseuse, le cordon ombilical, le placenta, la pulpe dentaire et le tissu adipeux sous-cutané3. Cependant, comme la disponibilité des cellules souches chez les adultes est limitée et que leur procédure d’isolement est souvent invasive (entraînant une morbidité au site donneur), il est souhaitable de disposer d’une autre source de cellules souches qui pourrait contourner ces défis.
L’articulation du genou est un dépôt de divers types de cellules, tels que les CSM dérivés du coussinet adipeux infrapatellar, les CSM dérivés de la membrane synoviale, les CSM dérivés du liquide synovial, les fibroblastes ligamentaires, les chondrocytes articulaires, etc. 4,5,6. Ces cellules ont le potentiel d’être largement explorées dans la recherche basée sur le génie tissulaire musculo-squelettique. Par conséquent, l’articulation du genou pourrait être une source possible et fiable de plusieurs types de CSM. Le dépôt adipeux situé dans l’articulation du genou, connu sous le nom de coussinet adipeux infrapatellaire (IFP) ou coussinet adipeux de Hoffa, est un choix prometteur et alternatif de dépôt MSC. L’IFP est une source relativement facilement accessible et cliniquement accessible de CSM, car il est régulièrement réséqué et jeté sous forme de déchets chirurgicaux lors d’une arthroscopie du genou ou d’une chirurgie ouverte du genou. L’élimination de l’IFP est associée à une morbidité minimale du site donneur, ce qui en fait également une source tissulaire attrayante. Tout en ayant un profil phénotypique similaire, les CSM de l’IFP (IFP-MSC) ont un potentiel clonogène accru par rapport aux cellules souches mésenchymateuses dérivées de la moelle osseuse (BM-MSCs)6 et une meilleure capacité de prolifération par rapport aux cellules souches sous-cutanées dérivées du tissu adipeux (ADSC)7. Il est intéressant de noter que, par rapport aux CSM dérivées du liquide synovial (SF-MSC), les IFP-MSC ne perdent pas leur capacité de prolifération aux passages tardifs, pas plus que le temps de doublement n’augmente aux passages tardifs. Cela suggère que, pendant l’expansion cellulaire, les IFP-MSC peuvent atteindre un nombre suffisamment important de cellules pour des applications d’ingénierie tissulaire in vitro sans compromettre leur taux de prolifération8. Des études récentes ont également suggéré que les IFP-MSC possèdent un potentiel de différenciation chondrogénique supérieur à celui des CSM dérivées de la moelle osseuse (BMSC) et des CSM dérivées du tissu adipeux (ADSC), probablement en raison de leur proximité anatomique avec le cartilage articulaire, ce qui indique leur aptitude à l’ingénierie tissulaire du cartilage 6,7,9,10. De plus, ils possèdent également un potentiel de différenciation ostéogénique indépendant de l’âge11. Il a été démontré que l’injection intra-articulaire d’IFP-MSCs réduit la douleur et améliore les fonctions articulaires du genou chez les patients atteints d’arthrose12,13. En outre, de fortes réponses immunosuppressives et une amélioration des propriétés immunomodulatrices des IFP-MSC en présence de cytokines inflammatoires dans des conditions pathologiques ont également été rapportées6.
Les IFP-MSC sont une source alternative prometteuse de MSC; Cependant, leur bénéfice thérapeutique en génie tissulaire et en médecine régénérative est relativement moins exploré. Les études existantes sur les IFP-MSC ont principalement utilisé des cellules provenant de donneurs humains. Parmi celles-ci, quelques études récentes ont examiné les IFP-MSC de donneurs humains sains (patients non arthritiques, âgés de 17 à 60 ans)6,14, tandis que la plupart des études ont utilisé des IFP-MSC de patients âgés subissant une arthroplastie totale du genou (patients malades, âgés de 70 à 80 ans). Comme on sait que l’âge et la maladie altèrent le fonctionnement normal des cellules souches (réduction du nombre et perte de potentiel fonctionnel), cela pourrait potentiellement entraîner des incohérences dans les résultats des études basées sur les CSM 7,15,16,17. En outre, l’utilisation d’IFP-MSC provenant de patients atteints de maladies physiopathologiques (par exemple, arthrite et obésité) pose également des difficultés pour comprendre les caractéristiques de base des cellules saines in vitro, agissant ainsi comme un facteur limitant dans le développement de thérapies basées sur les CSM. Pour surmonter ces problèmes, l’utilisation de l’IFP-MSC provenant de donneurs sains est vitale. Comme l’accès à un donneur humain en bonne santé est difficile, les modèles animaux pourraient être une meilleure alternative. À cet égard, il existe quelques études où l’IFP a été isolé chez des souris18. Cependant, en raison de la petite taille du coussinet graisseux chez les souris normales, les tissus adipeux de plusieurs animaux ont été combinés pour obtenir suffisamment de tissu pour exécuter des procédures expérimentales élaborées19. Par conséquent, il est nécessaire de disposer d’un grand modèle animal, qui pourrait répondre à l’exigence d’un plus grand nombre de cellules tout en respectant les principes 3R (affiner, remplacer et réduire) dans la recherche animale20. L’utilisation de grands animaux a des implications importantes dans la recherche translationnelle. Plus précisément, dans le domaine de l’ingénierie tissulaire musculo-squelettique, une gamme de grands animaux tels que les chiens, les porcs, les moutons, les chèvres et les chevaux ont été étudiés21. La chèvre (Capra aegagrus hircus) est un excellent choix de gros animal car son articulation étouffante a l’anatomie la plus proche de l’articulation du genou humain22,23,24. La structure trabéculaire osseuse sous-chondrale et l’épaisseur osseuse sous-chondrale des chèvres sont similaires à celles des humains, et la proportion du cartilage par rapport à l’os serait également proche de celle des humains21. En outre, les chèvres ont été largement domestiquées dans le monde entier, ce qui les rend facilement disponibles lorsqu’elles sont squelettiques. En outre, les faibles coûts d’entretien et la facilité de manipulation en ont fait un modèle animal attrayant pour la recherche22.
Dans la présente étude, un protocole simple pour l’isolement des IFP-MSC de l’articulation étouffante de Capra aegagrus hircus (chèvre) et des conditions de culture in vitro pour leur expansion et leur différenciation sont démontrés. Les cellules isolées sont adhérentes, ont une morphologie semblable à celle des CSM, forment des colonies de fibroblastes CFU-F (fibroblastes formant des colonies) et possèdent un potentiel de différenciation adipogénique, chondrogénique et ostéogénique. Par conséquent, les IFP-MSC présentent un potentiel en tant que source alternative de MSC pour les applications biomédicales.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#946;-glycerophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9422-10G</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin- 0.02% EDTA</td>
			<td>Hi-Media</td>
			<td>TCL049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15-mL centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>49752-10G</td>
			<td>50 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TCL021-50ml</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50-mL centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian Blue</td>
			<td>Hi-Media</td>
			<td>RM471</td>
			<td>For sufated gycosaminoglycans staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alizarin Red S</td>
			<td>S D Fine-Chem Limited</td>
			<td>26048-25G</td>
			<td>For calcium deposition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>A011</td>
			<td>2.5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic fibroblast growth factor (bFGF)</td>
			<td>Sino Biologicals</td>
			<td>10014-HNAE</td>
			<td>5 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCIP/NBT ALP Substrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B5655-5TAB</td>
			<td>For ALP staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>MB-083</td>
			<td>Long name: Bovine Serum Albumin (1.25 mg/mL )</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TCP-182</td>
			<td>70 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>REMI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin</td>
			<td>RANBAXY LAB. Limited</td>
			<td>B17407T1</td>
			<td>2.5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Violet</td>
			<td>S D Fine-Chem Limited</td>
			<td>42555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.94925.0521</td>
			<td>25 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2915</td>
			<td>1 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM LG</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D5523</td>
			<td>Long name: Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Media Low Glucose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270</td>
			<td>Long name: Fetal Bovine Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution 37%-41%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>61780805001730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indomethacin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7378</td>
			<td>100 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I9278</td>
			<td>10 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon Eclipse TS 100</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS + 1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2521-5mL</td>
			<td>Long name: insulin, transferrin, sodium selenite + linoleic-BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Proline</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TO-109-25G</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>61751605001730</td>
			<td>For lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Meck</td>
			<td>1.07018.2521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes and sterile tips (20 &#181;L, 200 &#181;L, 1000 &#181;L)</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MUSE Cell analyser</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td></td>
			<td>For cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT compound</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>4583</td>
			<td>Long name: Optimal Cutting Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red O dye</td>
			<td>S D Fine-Chem Limited</td>
			<td>54304</td>
			<td>For lipid vacuole staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>A007</td>
			<td>100 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (150 mm and 90 mm)</td>
			<td>NEST</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safranin O</td>
			<td>S D Fine-Chem Limited</td>
			<td>50240</td>
			<td>For sufated gycosaminoglycans staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3434</td>
			<td>3.4 % (w/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile scissors, forceps and scalpels</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For isolation of IFP-MSC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.94953.0521</td>
			<td>35 % (w/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF-&#946;1</td>
			<td>Sino Biologicals</td>
			<td></td>
			<td>Long name: Transforming growth factor- &#946;1 (10 ng/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture incubator 37 &#176;C, 5% CO2</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris buffer</td>
			<td>Merck</td>
			<td>61771405001730</td>
			<td>For lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>S D Fine-Chem Limited</td>
			<td>40632</td>
			<td>For lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type II collagenase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17101015</td>
			<td>1.5 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin D3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9756-1G</td>
			<td>10 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Well plates (6 -WP and 24-WP)</td>
			<td>NEST</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, expansion, and differentiation of mesenchymal stem cells from the infrapatellar fat pad of the goat stifle joint

L’IFP, présent dans l’articulation du genou, est une source prometteuse de CSM. L’IFP est un tissu facilement accessible car il est régulièrement réséqué et jeté lors de procédures arthroscopiques et de chirurgies de remplacement du genou. De plus, son élimination est associée à une morbidité minimale du site donneur. Des études récentes ont démontré que les IFP-MSC ne perdent pas leur capacité de prolifération lors de l’expansion in vitro et ont un potentiel de différenciation ostéogénique indépendant de l’âge. Les IFP-MSC possèdent un potentiel de différenciation chondrogénique supérieur à celui des CSM dérivées de la moelle osseuse (BMSC) et des cellules souches dérivées du tissu adipeux (ADSC). Bien que ces cellules soient facilement accessibles chez les patients âgés et malades, leur efficacité est limitée. Par conséquent, l’utilisation d’IFP-MSC provenant de donneurs sains est importante pour déterminer leur efficacité dans des applications biomédicales. Comme l’accès à un donneur humain en bonne santé est difficile, les modèles animaux pourraient être une meilleure alternative pour permettre une compréhension fondamentale. Les grands animaux tels que les chiens, les chevaux, les moutons et les chèvres jouent un rôle crucial dans la recherche translationnelle. Parmi ceux-ci, la chèvre pourrait être un modèle préféré puisque l’articulation étouffante de la chèvre a l’anatomie la plus proche de l’articulation du genou humain. De plus, l’IFP caprin peut atteindre les valeurs MSC plus élevées nécessaires pour les applications de régénération tissulaire. De plus, le faible coût, la disponibilité et le respect des principes 3R pour la recherche animale en font un modèle attrayant. Cette étude démontre un protocole simple pour isoler les IFP-MSC de l’articulation étouffante des chèvres et les conditions de culture in vitro pour leur expansion et leur différenciation. L’IFP isolé de manière aseptique de la chèvre a été lavé, haché et digéré par voie enzymatique. Après filtration et centrifugation, les cellules collectées ont été cultivées. Ces cellules étaient adhérentes, avaient une morphologie semblable à celle des CSM et présentaient une capacité clonogène remarquable. En outre, ils se sont différenciés en lignées adipogènes, chondrogènes et ostéogéniques, démontrant leur multipotence. En conclusion, l’étude démontre l’isolement et l’expansion des CSM, qui présentent un potentiel dans les applications d’ingénierie tissulaire et de médecine régénérative.

Isolement des IFP-MSC de l’articulation fémorotibiale de chèvre Les étapes de l’isolement des IFP-MSC de l’articulation étouffante d’une chèvre sont illustrées à la figure 1. Le coussinet graisseux présent dans la surface interne non articulée de la rotule a été retiré, haché et digéré enzymatiquement. Les IFP-MSC ont été isolés avec succès et cultivés in vitro (Figure 2A).
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Isolation, Expansion, and Differentiation of Mesenchymal Stem Cells from the Infrapatellar Fat Pad of the Goat Stifle Joint

Les cellules souches mésenchymateuses du coussinet adipeux infrapatellaire (IFP-MSC) peuvent être isolées facilement du coussinet adipeux infrapatellaire de l’articulation du genou. Ils prolifèrent bien in vitro, forment des colonies CFU-F et se différencient en lignées adipogènes, chondrogènes et ostéogéniques. La méthodologie d’isolement, d’expansion et de différenciation des IFP-MSC par rapport à l’articulation d’étouffement de chèvre est fournie.

Isolement, expansion et différenciation des cellules souches mésenchymateuses du coussinet adipeux infra-patellaire de l’articulation étouffante de chèvre

The IFP, present in the knee joint, serves as a promising source of MSCs. The IFP is an easily accessible tissue as it is routinely resected and discarded ...

Les cellules souches mésenchymateuses dérivées de coussinets adipeux infrapatellals, ou en bref, IFP-MSCs, sont un type de cellules souches relativement moins étudié. Ce protocole est une méthode simple, fiable et reproductible démontrant l’isolement des IFP-MSC de l’articulation de l’étouffement de chèvre. Le principal avantage de la technique est qu’un grand nombre d’IFP-MSC de haute qualité peuvent être obtenus.Les IFP-MSC isolées peuvent se différencier en plusieurs lignées et possèdent un potentiel de régénération étendu. En raison de leur emplacement anatomique, les IFP-MSC ont gagné en intérêt pour la réparation des défauts du cartilage et l’atténuation de la dégradation du cartilage dans l’arthrose. La méthode a des implications pour la thérapie cellulaire dans le domaine de l’ingénierie tissulaire et de la médecine régénérative.La procédure d’isolement, d’expansion et de différenciation des IFP-MSC sera démontrée par le Dr Sugata Hazra et M. Aman Mahajan. Pour commencer l’isolement des cellules souches mésenchymateuses à coussinet adipeux infrapatellaire, ou IFP-MSC, prélever des articulations fémorotibiales de chèvre englobant environ 15 centimètres des régions fémorales et tibiales des membres postérieurs dans une boîte d’échantillons de prélèvement stérilisée. Conservez l’échantillon à quatre degrés Celsius pour le transporter au laboratoire en vue d’un traitement ultérieur.Placez l’échantillon sur une boîte de Petri de 150 millimètres et assurez-vous de traiter l’échantillon de manière aseptique et une enceinte de biosécurité tout au long de la procédure. Rincez-le abondamment avec du PBS autoclavé complété par des antibiotiques. Gardez l’échantillon hydraté à l’aide de PBS.Examinez attentivement les régions anatomiques de l’échantillon. Pour un accès facile, retirez complètement les tissus supplémentaires des deux os longs en tenant la surface terminale de l’os du fémur d’une main et en la coupant longitudinalement vers l’articulation à l’aide de ciseaux tranchants. Ensuite, sans perturber le tissu entourant la capsule articulaire, retirez les muscles et le tissu adipeux de l’os.De même, faites une autre incision à l’extrémité tibiale de l’échantillon et retirez les muscles et le tissu adipeux de l’os tibial. Assurez-vous que les deux os longs sont complètement exposés et que la capsule articulaire est visible. Ensuite, faites une incision de chaque côté de la membrane synoviale pour ouvrir l’articulation articulaire.Coupez la rotule de la membrane synoviale et des ligaments rotuliens à l’aide de ciseaux et de pinces fraîchement stérilisés. Placez immédiatement la rotule séparée dans une boîte de Petri contenant du PBS. De la rotule séparée, retirez tout le coussinet graisseux présent sur la surface interne à l’aide de ciseaux et de pinces.Recueillez-le dans une autre boîte de Petri fraîche et hachez-le à l’aide d’un scalpel. Inclure d’autres outils chirurgicaux pour obtenir les petits segments de graisse d’environ deux à trois millimètres. Utilisez une spatule pour transférer le tissu haché dans un tube à centrifuger de 50 millilitres et lavez-le trois fois avec du PBS supplémenté en antibiotiques pendant 15 minutes à température ambiante à l’aide d’un mélangeur à tube à essai.Pour la digestion enzymatique, incuber environ cinq grammes de tissu haché dans le milieu Eagle modifié de Dulbecco, ou DMEM, un milieu à faible teneur en glucose contenant 1,5 milligramme par millilitre de collagénase de type II et 2% FBS à 37 degrés Celsius pendant 12 à 16 heures. Aspirez soigneusement le tissu digéré et filtrez-le à travers une passoire cellulaire de 70 microns pour éliminer toute partie non digérée. Centrifuger le filtrat dans un tube à centrifuger de 15 millilitres à 150 fois g pendant cinq minutes.Retirez le surnageant avant de laver deux fois la pastille de cellule avec du DMEM à faible teneur en glucose. Remettez la pastille en suspension dans du DMEM complet, également appelé fluide d’expansion. Ensemencez les cellules sur une boîte de Petri de 150 millimètres et cultivez-les dans le milieu d’expansion complété par cinq nanogrammes par millilitre de facteur de croissance des fibroblastes de base, ou BFGF, et 50 microgrammes par millilitre de sel trisodique d’acide 2-phospho-L-ascorbique.Incuber les cellules à 37 degrés Celsius dans un incubateur de dioxyde de carbone à 5% pour permettre aux cellules d’adhérer et de proliférer. Surveillez quotidiennement l’attachement et la croissance des cellules. Pour une maintenance et une expansion correctes des IFP-MSC, changez le support tous les trois jours.Tout en changeant le média, ajoutez cinq nanogrammes frais par millilitre BFGF et 50 microgrammes par millimètre de sel trisodique d’acide 2-phospho-L-ascorbique directement dans la boîte de Pétri. Une fois que les cellules deviennent 80% à 90% confluentes, sous-cultivez-les en retirant le milieu d’expansion de la boîte de Petri et en lavant les cellules avec 1X PBS. Ajoutez ensuite quatre millilitres de trypsine-EDTA à 0,25% dans le plat et incuber les cellules à 37 degrés Celsius dans un incubateur à 5% de dioxyde de carbone.Après quatre minutes, tapotez la plaque sur le côté pour déloger les cellules. Confirmer le détachement complet de toutes les cellules au microscope. Une fois confirmé, ajoutez un volume égal de milieu d’expansion pour neutraliser la trypsine.Utilisez une pipette pour recueillir ces cellules dissociées dans un tube en polypropylène frais de 15 millilitres et centrifugez-les à 150 fois g pendant cinq minutes à température ambiante. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille dans le volume de dilatation souhaité. Comptez les cellules en utilisant la méthode standard de comptage des cellules et sous-cultivez-les pour une expansion ultérieure à une densité de semis de 10 000 cellules par centimètre carré dans une boîte de Petri de 150 millilitres.Pour tous les essais, utiliser une monocouche confluente de cellules du numéro de passage P2 à P5. Lorsque les cellules expansées atteignent 80% à 90% de confluence, dissocier les cellules à l’aide d’une solution de trypsine-EDTA avant de les pelleter dans un tube centrifuge de 15 millilitres à 150 fois g pendant cinq minutes. Ensuite, remettez la pastille en suspension dans du plasma de chèvre à une densité de 2 millions de cellules par 50 microlitres. Ajouter 50 microlitres de plasma contenant les cellules sur une boîte de Petri stérilisée de 90 millimètres, suivie de l’ajout de chlorure de calcium à une concentration finale de 0,3%Bien mélanger pour fabriquer un hydrogel plasma réticulé.Après avoir incubé l’hydrogel fabriqué à 37 degrés Celsius pendant 40 minutes, transférer les hydrogels dans des plaques de culture tissulaire de 24 puits contenant des milieux chondrogènes. Changez le support tous les trois jours pendant 14 jours. Les hydrogels cultivés dans un milieu DMEM complet sans TGF-bêta 1 sont considérés comme des témoins non induits.Après 14 jours de différenciation chondrogénique des cellules dans l’hydrogel plasmatique, laver les hydrogels trois fois avec du PBS pendant cinq minutes chacun et fixer les échantillons dans du formol tamponné neutre pendant trois heures. Les IFP-MSC isolées étaient homogènes et ont atteint une morphologie allongée dans les 24 heures suivant la culture in vitro. Les cellules proliféraient efficacement de 80% à 90% de confluence dans les six jours suivant l’expansion et présentaient une capacité clonogène, indiquant des capacités efficaces de prolifération et d’auto-renouvellement.Lorsqu’elles ont été traitées pour se différencier en lignée adipogénique, les cellules isolées ont produit des gouttelettes lipidiques, ce qui a été confirmé par la coloration Oil Red O aux jours 14 et 21. De telles gouttelettes d’huile n’étaient pas visibles dans les cellules sans facteurs inducteurs adipogènes. Les cellules isolées encapsulées dans de l’hydrogel plasmatique ont montré la formation de néo-tissus blancs et brillants après 14 jours dans le groupe induit présentant le potentiel chondrogénique.Le groupe non induit avait un tissu blanc pâle avec une brillance réduite. De plus, une coloration histologique positive pour le bleu d’Alcian et la safranine O dans le groupe induit a indiqué que les cellules pouvaient sécréter des glycosaminoglycanes sulfatés, l’un des principaux composants de la matrice cartilagineuse. En revanche, les coupes d’hydrogel des groupes non induits étaient négatives pour la coloration à la safranine O et au bleu d’Alcian, confirmant le potentiel de différenciation chondrogénique des cellules souches mésenchymateuses uniquement en présence de stimuli chondrogènes.Les cellules isolées induites avec les milieux ostéogéniques ont montré une coloration positive pour la phosphatase alcaline, confirmant la minéralisation au bout de 14 jours. Après 28 jours d’induction ostéogénique, les dépôts calcifiés ont été observés avec une coloration au rouge d’alizarine S. Les résultats ont souligné le potentiel de différenciation des cellules induites en lignées adipogènes, chondrogéniques et ostéogéniques.Il est essentiel de traiter l’échantillon dans des conditions aseptiques pour éviter toute contamination. Il est également important d’identifier l’emplacement correct de la rotule. Cette procédure ouvre la voie à l’isolement de divers types de cellules, telles que les chondrocytes articulaires, les fibroblastes ligamentaires et les cellules souches de la synoviale et du liquide synovial, ayant de nombreuses applications en médecine régénérative.Après isolement des IFP-MSC à l’aide de cette technique, son efficacité a été particulièrement étudiée pour la régénération des tissus musculo-squelettiques, tels que le cartilage, les os et les ligaments, à l’aide d’approches sans échafaudage et sans échafaudage.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

Microcapsules d&#39;alginate comme une plate-forme 3D pour la Propagation et différenciation des cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) à différentes lignées

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Recherche

Bio-ingénierie

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

Le développement, l&#39;expansion et<em&gt; In vivo</em&gt; Suivi des cellules NK humaines à partir de cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) et et induit des cellules souches pluripotentes (CISP)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on Poly(&#949;-caprolactone) Electrospun Yarns

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on PolyÃƒÅ½Ã‚Âµ-caprolactone Electrospun Yarns

Optimisation Fixation des mésenchymateuses humaines cellules souches sur Poly (ε-caprolactone) électrofilées Yarns

Research into biomaterials and tissue engineering often includes cell-based in vitro investigations, which require initial knowledge of the starting cell ...

Scaffold-supported Transplantation of Islets in the Epididymal Fat Pad of Diabetic Mice

Transplantation soutenue d&#39;échafaudage d&#39;îlots dans la pate épididimale de souris diabétiques

Islet transplantation has been clinically proven to be effective at treating type 1 diabetes. However, the current intrahepatic transplantation strategy ...

Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells

Isolement des cellules souches mésenchymateuses du périoste alvéolaire humaine et les effets de la vitamine D sur activité ostéogène du périoste dérivées des cellules

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the ...

Exploring the Potential of Mesenchymal Stem Cell Sheet on The Development of Hepatocellular Carcinoma In Vivo

Exploring the Potential of Mesenchymal Stem Cell Sheet on The Development of Hepatocellular Carcinoma In Vivo

Explorer le potentiel des cellules souches mésenchymateuses feuille sur le développement du carcinome hépatocellulaire In Vivo

An in vivo animal model that mimics human cancer could have various applications that deliver significant clinical information. The currently used ...

Construction and Use of an Electrical Stimulation Chamber for Enhancing Osteogenic Differentiation in Mesenchymal Stem/Stromal Cells In Vitro

Construction et utilisation d’une chambre de Stimulation électrique pour renforcer la différenciation ostéogénique dans les cellules souches mésenchymateuses/stromales In Vitro

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) have been used extensively to promote bone healing in tissue engineering approaches. Electrical stimulation (EStim) ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Mesure du potentiel d’action optique unicellulaire dans les cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Generation of Human Blood Vessel Organoids from Pluripotent Stem Cells

Génération d’organoïdes de vaisseaux sanguins humains à partir de cellules souches pluripotentes

An organoid is defined as an engineered multicellular in vitro tissue that mimics its corresponding in vivo organ such that it can be used to study ...

Creation of a Knee Joint-on-a-Chip for Modeling Joint Diseases and Testing Drugs

Création d’une articulation du genou sur puce pour modéliser les maladies articulaires et tester des médicaments

The high prevalence of debilitating joint diseases like osteoarthritis (OA) poses a high socioeconomic burden. Currently, the available drugs that target ...