Name: isolation, expansion, and differentiation of mesenchymal stem cells from the infrapatellar fat pad of the goat stifle joint
Uploaded: 2022-08-02T13:00:00
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SH bedankt sich für die Unterstützung durch das Postdoktorandenstipendium des Instituts des IIT Kanpur und das SYST-Stipendium der DST (SEED Division) (SP / YO / 618 / 2018). AM dankt dem Indian Institute of Technology-Kanpur (IIT-Kanpur) für ein Institutsstipendium. DSK dankt der Gireesh Jankinath Chair Professur und dem Department of Biotechnology, Indien, für die Finanzierung (BT/PR22445/MED/32/571/2016). AM, SH und DSK danken dem Mehta Family Centre for Engineering in Medicine am IIT-Kanpur für ihre großzügige Unterstützung.

Das Protokoll basiert auf der Isolierung von IFP-MSCs aus Ziegen. Ziegen-IFP und Blut wurden in einem örtlichen Schlachthof gesammelt. Da solche Gewebeentnahmen nicht in den Zuständigkeitsbereich einer institutionellen Tierethikkommission fallen, war eine ethische Genehmigung nicht erforderlich.
1. Isolierung von IFP-MSCs aus dem Femorotibialgelenk des Ziegenknies
<ol><li>Sammeln Sie ein Femorotibialgelenk (Probe) der Ziege, das jeweils ~15 cm der Oberschenkel- und Tibiare...

Im vorliegenden Protokoll wurde eine einfache, zuverlässige und reproduzierbare Methode zur Isolierung von MSCs aus Ziegen-IFP bereitgestellt. Zellen, die mit dieser Methode isoliert wurden, wurden in unseren früheren Studien erfolgreich zur In-vitro-Geweberegeneration eingesetzt. Es wurde beobachtet, dass die isolierten Zellen proliferativ waren, auf verschiedene Wachstumsfaktoren ansprachen und ihre biologische Aktivität behielten, wenn sie auf elektrogesponnenen Fasern und Gerüsten ausgesät wurden<sup cl...

Mesenchymale Stammzellen (MSCs) sind ein attraktiver Kandidat für zellbasierte Therapien in der regenerativen Medizin 1,2. Sie können aus einer Vielzahl von Gewebequellen wie Knochenmark, Nabelschnur, Plazenta, Zahnpulpa und subkutanem Fettgewebe gewonnen werden3. Da die Verfügbarkeit von Stammzellen bei Erwachsenen jedoch begrenzt ist und ihr Isolationsverfahren oft invasiv ist (was zu Morbidität an der Spenderstelle führt), ist es wünschenswert, eine alternative Stammzellquelle zu haben, die diese Herausforderungen umgehen könnte.
Das Kniegelenk ist ein Depot verschiedener Zelltypen, wie z.B. infrapatellare Fettpolster-abgeleitete MSCs, Synovialmembran-abgeleitete MSCs, Synovialflüssigkeits-abgeleitete MSCs, Ligament-Fibroblasten, artikuläre Chondrozyten usw. 4,5,6. Diese Zellen haben das Potenzial, in der muskuloskelettalen Tissue Engineering-basierten Forschung umfassend erforscht zu werden. Daher könnte das Kniegelenk eine mögliche und zuverlässige Quelle für mehrere Arten von MSCs sein. Das im Kniegelenk befindliche Fettdepot, das als infrapatelläres Fettpolster (IFP) oder Hoffa-Fettpolster bekannt ist, ist eine vielversprechende und alternative Wahl des MSC-Depots. Das IFP ist eine relativ leicht zugängliche und klinisch erhältliche Quelle für MSCs, da es routinemäßig reseziert und als chirurgischer Abfall während einer Kniearthroskopie oder einer Operation am offenen Knie entsorgt wird. Die Entfernung des IFP ist mit einer minimalen Morbidität an der Spenderstelle verbunden, was es auch zu einer attraktiven Gewebequelle macht. Obwohl sie ein ähnliches phänotypisches Profil aufweisen, haben MSCs aus IFP (IFP-MSCs) ein erhöhtes klonogenes Potenzial im Vergleich zu mesenchymalen Stammzellen aus dem Knochenmark (BM-MSCs)6 und eine bessere Proliferationskapazität im Vergleich zu subkutanen Fettstammzellen (ADSCs)7. Interessanterweise verlieren IFP-MSCs im Vergleich zu Synovialflüssigkeits-abgeleiteten MSCs (SF-MSCs) weder ihre Proliferationskapazität bei späten Passagen, noch erhöht sich die Verdopplungszeit bei späten Passagen. Dies deutet darauf hin, dass IFP-MSCs während der Zellexpansion eine ausreichend große Anzahl von Zellen für In-vitro-Tissue-Engineering-Anwendungen erreichen können, ohne ihre Proliferationsrate zu beeinträchtigen8. Neuere Studien deuten auch darauf hin, dass IFP-MSCs ein überlegenes chondrogenes Differenzierungspotenzial im Vergleich zu Knochenmark-abgeleiteten MSCs (BMSCs) und adipositas-abgeleiteten MSCs (ADSCs) besitzen, wahrscheinlich aufgrund ihrer anatomischen Nähe zum Gelenkknorpel, was auf ihre Eignung für das Knorpelgewebe-Engineering hinweist 6,7,9,10. Darüber hinaus besitzen sie auch ein altersunabhängiges osteogenes Differenzierungspotenzial11. Es wurde gezeigt, dass die intraartikuläre Injektion von IFP-MSCs bei Patienten mit Osteoarthritis (OA) Schmerzen lindert und die Kniegelenksfunktionen verbessert12,13. Darüber hinaus wurde auch über starke immunsuppressive Reaktionen und verbesserte immunmodulatorische Eigenschaften von IFP-MSCs in Gegenwart von inflammatorischen Zytokinen unter pathologischen Zuständen berichtet6.
IFP-MSCs sind eine vielversprechende und alternative Quelle für MSCs; Ihr therapeutischer Nutzen im Tissue Engineering und in der regenerativen Medizin ist jedoch relativ wenig erforscht. Die bestehenden Studien zu IFP-MSCs haben hauptsächlich Zellen von menschlichen Spendern verwendet. Unter diesen haben einige neuere Studien IFP-MSCs von gesunden menschlichen Spendern (nicht-arthritische Patienten im Alter von 17-60 Jahren) untersucht6,14, während die meisten Studien IFP-MSCs von älteren Patienten verwendet haben, die sich einer Kniegelenkersatzoperation unterzogen haben (erkrankte Patienten im Alter von 70-80 Jahren). Da bekannt ist, dass sowohl das Alter als auch die Krankheit die normale Funktion der Stammzellen verändern (reduzierte Anzahl und Verlust des funktionellen Potenzials), könnte dies möglicherweise zu Inkonsistenzen in den Ergebnissen der MSC-basierten Studienführen 7,15,16,17. Darüber hinaus stellt die Verwendung von IFP-MSCs von Patienten mit pathophysiologischen Zuständen (z. B. Arthritis und Adipositas) auch Schwierigkeiten dar, die grundlegenden Eigenschaften gesunder Zellen in vitro zu verstehen, was als limitierender Faktor bei der Entwicklung von MSCs-basierten Therapien wirkt. Um diese Probleme zu überwinden, ist die Verwendung von IFP-MSCs von gesunden Spendern von entscheidender Bedeutung. Da der Zugang zu einem gesunden menschlichen Spender eine Herausforderung darstellt, könnten Tiermodelle eine bessere Alternative sein. In diesem Zusammenhang gibt es einige Studien, in denen IFP aus Mäusen isoliert wurde18. Aufgrund der geringen Größe des Fettpolsters bei normalen Mäusen wurde jedoch Fettgewebe von mehreren Tieren kombiniert, um genügend Gewebe für die Durchführung aufwendiger experimenteller Verfahren zu erhalten19. Daher besteht ein Bedarf an einem großen Tiermodell, das die Anforderung an die höhere Anzahl von Zellen erfüllen und gleichzeitig die 3R-Prinzipien (verfeinern, ersetzen und reduzieren) im Tierversuch erfüllenkönnte 20. Die Verwendung von Großtieren hat erhebliche Auswirkungen auf die translationale Forschung. Insbesondere im Bereich des muskuloskelettalen Tissue Engineering wurde eine Reihe von Großtieren wie Hunden, Schweinen, Schafen, Ziegen und Pferden untersucht21. Die Ziege (Capra aegagrus hircus) ist eine ausgezeichnete Wahl für große Tiere, da ihr Würgegelenk die Anatomie hat, die dem menschlichen Kniegelenk am nächsten kommt22,23,24. Die subchondrale Knochentrabekelstruktur und die subchondrale Knochendicke von Ziegen ähneln denen des Menschen, und auch das Verhältnis von Knorpel zu Knochen wird dem des Menschen nahe gebracht21. Darüber hinaus wurden Ziegen auf der ganzen Welt domestiziert, so dass sie leicht verfügbar sind, wenn sie skelettreif sind. Darüber hinaus haben die geringen Wartungskosten und die einfache Handhabung sie zu einem attraktiven Tiermodell für die Forschung gemacht22.
In der vorliegenden Studie werden ein einfaches Protokoll für die Isolierung von IFP-MSCs aus dem Stifle-Gelenk von Capra aegagrus hircus (Ziege ) und in vitro Kulturbedingungen für ihre Expansion und Differenzierung demonstriert. Die isolierten Zellen sind adhärent, haben eine MSC-ähnliche Morphologie, bilden CFU-F-Kolonien (koloniebildende Einheitsfibroblasten) und besitzen ein adipogenes, chondrogenes und osteogenes Differenzierungspotential. Daher zeigen IFP-MSCs Potenzial als alternative Quelle für MSCs für biomedizinische Anwendungen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#946;-glycerophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9422-10G</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin- 0.02% EDTA</td>
			<td>Hi-Media</td>
			<td>TCL049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15-mL centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>49752-10G</td>
			<td>50 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TCL021-50ml</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50-mL centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian Blue</td>
			<td>Hi-Media</td>
			<td>RM471</td>
			<td>For sufated gycosaminoglycans staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alizarin Red S</td>
			<td>S D Fine-Chem Limited</td>
			<td>26048-25G</td>
			<td>For calcium deposition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>A011</td>
			<td>2.5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic fibroblast growth factor (bFGF)</td>
			<td>Sino Biologicals</td>
			<td>10014-HNAE</td>
			<td>5 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCIP/NBT ALP Substrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B5655-5TAB</td>
			<td>For ALP staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>MB-083</td>
			<td>Long name: Bovine Serum Albumin (1.25 mg/mL )</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TCP-182</td>
			<td>70 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>REMI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin</td>
			<td>RANBAXY LAB. Limited</td>
			<td>B17407T1</td>
			<td>2.5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Violet</td>
			<td>S D Fine-Chem Limited</td>
			<td>42555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.94925.0521</td>
			<td>25 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2915</td>
			<td>1 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM LG</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D5523</td>
			<td>Long name: Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Media Low Glucose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270</td>
			<td>Long name: Fetal Bovine Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution 37%-41%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>61780805001730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indomethacin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7378</td>
			<td>100 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I9278</td>
			<td>10 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon Eclipse TS 100</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS + 1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2521-5mL</td>
			<td>Long name: insulin, transferrin, sodium selenite + linoleic-BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Proline</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TO-109-25G</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>61751605001730</td>
			<td>For lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Meck</td>
			<td>1.07018.2521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes and sterile tips (20 &#181;L, 200 &#181;L, 1000 &#181;L)</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MUSE Cell analyser</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td></td>
			<td>For cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT compound</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>4583</td>
			<td>Long name: Optimal Cutting Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red O dye</td>
			<td>S D Fine-Chem Limited</td>
			<td>54304</td>
			<td>For lipid vacuole staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>A007</td>
			<td>100 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (150 mm and 90 mm)</td>
			<td>NEST</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safranin O</td>
			<td>S D Fine-Chem Limited</td>
			<td>50240</td>
			<td>For sufated gycosaminoglycans staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3434</td>
			<td>3.4 % (w/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile scissors, forceps and scalpels</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For isolation of IFP-MSC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.94953.0521</td>
			<td>35 % (w/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF-&#946;1</td>
			<td>Sino Biologicals</td>
			<td></td>
			<td>Long name: Transforming growth factor- &#946;1 (10 ng/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture incubator 37 &#176;C, 5% CO2</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris buffer</td>
			<td>Merck</td>
			<td>61771405001730</td>
			<td>For lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>S D Fine-Chem Limited</td>
			<td>40632</td>
			<td>For lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type II collagenase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17101015</td>
			<td>1.5 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin D3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9756-1G</td>
			<td>10 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Well plates (6 -WP and 24-WP)</td>
			<td>NEST</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, expansion, and differentiation of mesenchymal stem cells from the infrapatellar fat pad of the goat stifle joint

Das IFP, das im Kniegelenk vorhanden ist, dient als vielversprechende Quelle für MSCs. Das IFP ist ein leicht zugängliches Gewebe, da es routinemäßig bei arthroskopischen Eingriffen und Kniegelenkersatzoperationen reseziert und verworfen wird. Darüber hinaus ist seine Entfernung mit einer minimalen Morbidität an der Spenderstelle verbunden. Neuere Studien haben gezeigt, dass IFP-MSCs während der In-vitro-Expansion ihre Proliferationsfähigkeit nicht verlieren und ein altersunabhängiges osteogenes Differenzierungspotenzial aufweisen. IFP-MSCs besitzen ein überlegenes chondrogenes Differenzierungspotenzial im Vergleich zu Knochenmark-abgeleiteten MSCs (BMSCs) und adipösen Stammzellen (ADSCs). Obwohl diese Zellen von älteren und kranken Patienten leicht zu erhalten sind, ist ihre Wirksamkeit begrenzt. Daher ist die Verwendung von IFP-MSCs von gesunden Spendern wichtig, um ihre Wirksamkeit in biomedizinischen Anwendungen zu bestimmen. Da der Zugang zu einem gesunden menschlichen Spender schwierig ist, könnten Tiermodelle eine bessere Alternative sein, um ein grundlegendes Verständnis zu ermöglichen. Großtiere wie Hunde, Pferde, Schafe und Ziegen spielen in der translationalen Forschung eine entscheidende Rolle. Unter diesen könnte die Ziege ein bevorzugtes Modell sein, da das Würgegelenk der Ziege die Anatomie hat, die dem menschlichen Kniegelenk am nächsten kommt. Darüber hinaus kann Ziegen-IFP die höheren MSC-Werte erfüllen, die für Geweberegenerationsanwendungen benötigt werden. Niedrige Kosten, Verfügbarkeit und die Einhaltung der 3R-Prinzipien für Tierversuche machen sie zudem zu einem attraktiven Modell. Diese Studie demonstriert ein einfaches Protokoll zur Isolierung von IFP-MSCs aus dem Würgegelenk von Ziegen und In-vitro-Kulturbedingungen für ihre Expansion und Differenzierung. Das aseptisch isolierte IFP aus der Ziege wurde gewaschen, zerkleinert und enzymatisch verdaut. Nach der Filtration und Zentrifugation wurden die gesammelten Zellen kultiviert. Diese Zellen waren adhärent, hatten eine MSCs-ähnliche Morphologie und zeigten bemerkenswerte klonogene Fähigkeiten. Darüber hinaus differenzierten sie sich in adipogene, chondrogene und osteogene Linien und demonstrierten ihre Multipotenz. Zusammenfassend zeigt die Studie die Isolierung und Ausbreitung von MSCs, die Potenzial für Anwendungen im Tissue Engineering und in der regenerativen Medizin zeigen.

Isolierung von IFP-MSCs aus dem Femorotibialgelenk einer Ziege Die Schritte bei der Isolierung von IFP-MSCs aus dem Würgegelenk einer Ziege sind in Abbildung 1 dargestellt. Das Fettpolster, das in der inneren nicht artikulierten Oberfläche der Patella vorhanden war, wurde entfernt, zerkleinert und enzymatisch verdaut. Die IFP-MSCs wurden erfolgreich isoliert und in vitro kultiviert (Abbildung 2A).
<stron...

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Isolation, Expansion, and Differentiation of Mesenchymal Stem Cells from the Infrapatellar Fat Pad of the Goat Stifle Joint

Infrapatellare Fettpolster mesenchymale Stammzellen (IFP-MSCs) können leicht aus dem infrapatellaren Fettpolster des Kniegelenks isoliert werden. Sie vermehren sich gut in vitro, bilden CFU-F-Kolonien und differenzieren sich in adipogene, chondrogene und osteogene Linien. Hierin wird die Methodik für die Isolierung, Expansion und Differenzierung von IFP-MSCs aus dem Ziegenstielgelenk bereitgestellt.

Isolierung, Expansion und Differenzierung von mesenchymalen Stammzellen aus dem infrapatellaren Fettpolster des Ziegenwürgegelenks

The IFP, present in the knee joint, serves as a promising source of MSCs. The IFP is an easily accessible tissue as it is routinely resected and discarded ...

Infrapatellare Fettpolster-abgeleitete mesenchymale Stammzellen, oder kurz IFP-MSCs, sind ein relativ wenig untersuchter Stammzelltyp. Dieses Protokoll ist eine einfache, zuverlässige und reproduzierbare Methode, die die Isolierung von IFP-MSCs aus dem Ziegenwürgegelenk demonstriert. Der Hauptvorteil der Technik besteht darin, dass eine große Anzahl von hochwertigen IFP-MSCs erhalten werden kann.Isolierte IFP-MSCs können sich in mehrere Linien differenzieren und besitzen ein umfangreiches regeneratives Potenzial. Aufgrund ihrer anatomischen Lage haben IFP-MSCs Interesse an der Reparatur von Knorpeldefekten und der Linderung des Knorpelabbaus bei Arthrose gewonnen. Die Methode hat Implikationen für die zellbasierte Therapie im Bereich des Tissue Engineering und der regenerativen Medizin.Das Verfahren zur Isolierung, Expansion und Differenzierung von IFP-MSCs wird von Dr. Sugata Hazra und Herrn Aman Mahajan demonstriert. Um mit der Isolierung von Infrapatellar Fat Pad Mesenchymal Stammzellen (IFP-MSCs) zu beginnen, werden Femorotibialgelenke von Ziegen, die etwa 15 Zentimeter der Femur- und Tibiaregionen der Hinterbeine umfassen, in einer sterilisierten Probenbox entnommen. Lagern Sie die Probe bei vier Grad Celsius für den Transport ins Labor zur weiteren Verarbeitung.Legen Sie die Probe auf eine 150-Millimeter-Petrischale und stellen Sie sicher, dass die Probe während des gesamten Verfahrens aseptisch und in einer Biosicherheitswerkbank verarbeitet wird. Spülen Sie es gründlich mit autoklaviertem PBS, das mit Antibiotika ergänzt wird. Halten Sie die Probe mit PBS hydratisiert.Untersuchen Sie sorgfältig die anatomischen Regionen der Probe. Um den Zugang zu erleichtern, entfernen Sie das zusätzliche Gewebe vollständig von den beiden langen Knochen, indem Sie die Endfläche des Oberschenkelknochens mit einer Hand halten und mit einer scharfen Schere in Längsrichtung zum Gelenk schneiden. Dann, ohne das die Gelenkkapsel umgebende Gewebe zu stören, entfernen Sie die Muskeln und das Fettgewebe aus dem Knochen.Machen Sie einen weiteren Schnitt am Tibiaende der Probe und entfernen Sie die Muskeln und das Fettgewebe aus dem Tibiaknochen. Stellen Sie sicher, dass sowohl die langen Knochen vollständig freigelegt sind als auch die Gelenkkapsel sichtbar ist. Als nächstes machen Sie einen Schnitt von beiden Seiten der Synovialmembran, um das Gelenk aufzuschneiden.Schneiden Sie die Kniescheibe von der Synovialmembran und den Patellabändern mit einer frischen, sterilisierten Schere und Pinzette ab. Legen Sie die abgetrennte Patella sofort in eine Petrischale, die PBS enthält. Entfernen Sie das gesamte Fettpolster auf der Innenseite mit Schere und Pinzette aus der abgetrennten Kniescheibe.Sammeln Sie es in einer anderen frischen Petrischale und zerkleinern Sie es mit einem Skalpell. Fügen Sie andere chirurgische Instrumente hinzu, um die kleinen Fettsegmente von etwa zwei bis drei Millimetern zu erhalten. Übertragen Sie das Hackfleisch mit einem Spatel in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und waschen Sie es dreimal mit PBS, ergänzt mit Antibiotika, für 15 Minuten bei Raumtemperatur mit einem Reagenzglasmischer.Für die enzymatische Verdauung inkubieren Sie etwa fünf Gramm des gehackten Gewebes in Dulbecco's Modified Eagle Media oder DMEM, einem Medium mit niedrigem Glukosegehalt, das 1,5 Milligramm pro Milliliter Typ-II-Kollagenase und 2% FBS bei 37 Grad Celsius für 12 bis 16 Stunden enthält. Saugen Sie das verdaute Gewebe vorsichtig ab und filtern Sie es durch ein 70-Mikron-Zellsieb, um unverdaute Teile zu entfernen. Das Filtrat wird in einem 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen fünf Minuten lang mit 150 mal g zentrifugiert.Entfernen Sie den Überstand, bevor Sie das Zellpellet zweimal mit DMEM-Low-Glucose waschen. Suspendieren Sie das Pellet in vollständigem DMEM, auch bekannt als Expansionsmedium. Säen Sie die Zellen auf einer 150-Millimeter-Petrischale und kultivieren Sie sie in den Expansionsmedien, die mit fünf Nanogramm pro Milliliter Basic Fibroblast Growth Factor (BFGF) und 50 Mikrogramm pro Milliliter 2-Phospho-L-Ascorbinsäuretrinatriumsalz ergänzt werden.Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius in einem 5% Kohlendioxid-Inkubator, damit die Zellen haften und sich vermehren können. Überwachen Sie täglich die Anheftung und das Wachstum der Zellen. Für eine ordnungsgemäße Wartung und Erweiterung der IFP-MSCs sollten die Medien alle drei Tage gewechselt werden.Geben Sie beim Wechseln des Mediums frische fünf Nanogramm pro Milliliter BFGF und 50 Mikrogramm pro Millimeter 2-Phospho-L-ascorbinsäure-Trinatriumsalz direkt in die Petrischale. Sobald die Zellen zu 80% bis 90% konfluent sind, subkulturieren Sie sie, indem Sie das Expansionsmedium aus der Petrischale entfernen und die Zellen mit 1X PBS waschen. Dann geben Sie vier Milliliter 0,25% Trypsin-EDTA in die Schale und inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius in einem 5% Kohlendioxid-Inkubator.Klopfen Sie nach vier Minuten auf die Seite der Platte, um die Zellen zu entfernen. Bestätigen Sie die vollständige Ablösung aller Zellen unter dem Mikroskop. Nach der Bestätigung fügen Sie ein gleiches Volumen an Expansionsmedien hinzu, um das Trypsin zu neutralisieren.Verwenden Sie eine Pipette, um diese dissoziierten Zellen in einem frischen 15-Milliliter-Polypropylen-Röhrchen zu sammeln und zentrifugieren Sie sie bei 150 mal g für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in der gewünschten Menge des Expansionsmediums wieder auf. Zählen Sie die Zellen mit der Standard-Zellzählmethode und subkulturieren Sie sie für die weitere Expansion bei einer Impfdichte von 10.000 Zellen pro Quadratzentimeter in einer 150-Milliliter-Petrischale.Für alle Assays ist eine konfluente Monoschicht von Zellen der Passagen P2 bis P5 zu verwenden. Wenn die expandierten Zellen eine Konfluenzrate von 80 % bis 90 % erreichen, dissoziieren Sie die Zellen mit Trypsin-EDTA-Lösung, bevor Sie sie fünf Minuten lang in einem 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen bei 150-mal g pelletieren. Dann resuspendieren Sie das Pellet im Ziegenplasma mit einer Dichte von 2 Millionen Zellen pro 50 Mikroliter. Fügen Sie 50 Mikroliter Plasma, das die Zellen enthält, auf eine sterilisierte 90-Millimeter-Petrischale hinzu, gefolgt von der Zugabe von Calciumchlorid in einer Endkonzentration von 0,3%.Nach der Inkubation des hergestellten Hydrogels bei 37 Grad Celsius für 40 Minuten werden die Hydrogele auf 24-Well-Gewebekulturplatten übertragen, die chondrogene Medien enthalten. Wechseln Sie die Medien alle drei Tage für 14 Tage. Die Hydrogele, die in vollständigen DMEM-Medien ohne TGF-beta 1 kultiviert werden, gelten als nicht induzierte Kontrollen.Nach 14 Tagen chondrogener Differenzierung von Zellen in Plasmahydrogel waschen Sie die Hydrogele dreimal mit PBS für jeweils fünf Minuten und fixieren Sie die Proben drei Stunden lang in neutralem gepuffertem Formalin. Isolierte IFP-MSCs waren homogen adhärent und erreichten innerhalb von 24 Stunden nach In-vitro-Kultur eine längliche Morphologie. Die Zellen vermehrten sich innerhalb von sechs Tagen nach der Expansion effizient um 80% bis 90% und zeigten eine klonogene Kapazität, was auf eine effiziente Proliferations- und Selbsterneuerungsfähigkeit hindeutet.Bei der Behandlung zur Differenzierung in eine adipogene Linie produzierten die isolierten Zellen Lipidtröpfchen, was durch eine Ölrot-O-Färbung an den Tagen 14 und 21 bestätigt wurde. Solche Öltröpfchen waren in den Zellen ohne adipogene induzierende Faktoren nicht sichtbar. Die isolierten Zellen, die in Plasma-Hydrogel eingekapselt waren, zeigten die Bildung von weißem und glänzendem Neo-Gewebe nach 14 Tagen in der induzierten Gruppe, die das chondrogene Potenzial aufwies.Die nicht induzierte Gruppe hatte blasses weißes Gewebe mit vermindertem Glanz. Darüber hinaus deutete eine positive histologische Färbung für Alcianblau und Safranin O in der induzierten Gruppe darauf hin, dass die Zellen sulfatierte Glykosaminoglykane, einen der Hauptbestandteile der Knorpelmatrix, sezernieren konnten. Im Gegensatz dazu waren die Hydrogel-Abschnitte aus den nicht induzierten Gruppen negativ für die Safranin-O- und Alcian-Blau-Färbung, was das chondrogene Differenzierungspotenzial der mesenchymalen Stammzellen nur in Gegenwart von chondrogenen Stimuli bestätigt.Die isolierten Zellen, die mit osteogenen Medien induziert wurden, zeigten eine positive Färbung für alkalische Phosphatase, was die Mineralisierung nach 14 Tagen bestätigte. Nach 28 Tagen osteogener Induktion wurden die verkalkten Ablagerungen mit Alizarinrot-S-Färbung beobachtet. Die Ergebnisse unterstrichen das Differenzierungspotenzial induzierter Zellen in adipogene, chondrogene und osteogene Linien.Es ist wichtig, die Probe unter aseptischen Bedingungen zu verarbeiten, um eine Kontamination zu vermeiden. Es ist auch wichtig, die korrekte Position der Kniescheibe zu identifizieren. Dieses Verfahren eröffnet die Möglichkeit, verschiedene Zelltypen wie Gelenkchondrozyten, Bandfibroblasten und Stammzellen aus Synovia und Synovialflüssigkeit zu isolieren, die breite Anwendungen in der regenerativen Medizin haben.Nach der Isolierung von IFP-MSCs mit dieser Technik wurde ihre Wirksamkeit insbesondere für die Regeneration von Muskel-Skelett-Geweben wie Knorpel, Knochen und Band unter Verwendung von Gerüsten und gerüstfreien Ansätzen untersucht.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

Alginat-Mikrokapseln als 3D-Plattform für die Vermehrung und Differenzierung von humanen embryonalen Stammzellen (hES) auf verschiedenen Linien

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Forschung

Biotechnik

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

Entwicklung, Erweiterung und<em&gt; In vivo</em&gt; Monitoring von humanen NK Zellen aus humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) und und induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on Poly(&#949;-caprolactone) Electrospun Yarns

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on PolyÃƒÅ½Ã‚Âµ-caprolactone Electrospun Yarns

Optimierung der Befestigung der humanen mesenchymalen Stammzellen auf Poly (ε-caprolacton) Elektrogesponnene Garne

Research into biomaterials and tissue engineering often includes cell-based in vitro investigations, which require initial knowledge of the starting cell ...

Scaffold-supported Transplantation of Islets in the Epididymal Fat Pad of Diabetic Mice

Gerüstgestützte Transplantation von Inseln in der epididymalen Fettauflage von diabetischen Mäusen

Islet transplantation has been clinically proven to be effective at treating type 1 diabetes. However, the current intrahepatic transplantation strategy ...

Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells

Isolierung von mesenchymalen Stammzellen aus menschlichen alveoläre Periost und Effekte von Vitamin D auf knochenbildenden Aktivität Periost-abgeleitete Zellen

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the ...

Exploring the Potential of Mesenchymal Stem Cell Sheet on The Development of Hepatocellular Carcinoma In Vivo

Exploring the Potential of Mesenchymal Stem Cell Sheet on The Development of Hepatocellular Carcinoma In Vivo

Ermittlung des Potenzials von mesenchymalen Stammzellen Blatt auf die Entwicklung des hepatozellulären Karzinoms In Vivo

An in vivo animal model that mimics human cancer could have various applications that deliver significant clinical information. The currently used ...

Construction and Use of an Electrical Stimulation Chamber for Enhancing Osteogenic Differentiation in Mesenchymal Stem/Stromal Cells In Vitro

Bau und Betrieb von einer Kammer elektrische Stimulation zur Verbesserung der osteogene Differenzierung mesenchymaler Stammzellen/Stromazellen Zellen In Vitro

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) have been used extensively to promote bone healing in tissue engineering approaches. Electrical stimulation (EStim) ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Einzelzellige optische Aktionspotentialmessung in human induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Generation of Human Blood Vessel Organoids from Pluripotent Stem Cells

Erzeugung menschlicher Blutgefäß-Organoide aus pluripotenten Stammzellen

An organoid is defined as an engineered multicellular in vitro tissue that mimics its corresponding in vivo organ such that it can be used to study ...

Creation of a Knee Joint-on-a-Chip for Modeling Joint Diseases and Testing Drugs

Erstellung eines Kniegelenk-on-a-Chips zur Modellierung von Gelenkerkrankungen und zur Erprobung von Medikamenten

The high prevalence of debilitating joint diseases like osteoarthritis (OA) poses a high socioeconomic burden. Currently, the available drugs that target ...