Name: isolation, expansion, and differentiation of mesenchymal stem cells from the infrapatellar fat pad of the goat stifle joint
Uploaded: 2022-08-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Expansion, and Differentiation of Mesenchymal Stem Cells from the Infrapatellar Fat Pad of the Goat Stifle Joint at JoVE.com

SH מודה על תמיכה ממלגת המכון לפוסט-דוקטורט של IIT Kanpur ומענק SYST מ-DST (חטיבת SEED) (SP/YO/618/2018). AM מודה למכון ההודי לטכנולוגיה-קנפור (IIT-Kanpur) על מלגת המכון. DSK מכירה בקתדרה ע"ש ג'ריש ג'נקינאת ופרופסור ובמחלקה לביוטכנולוגיה, הודו, למימון (BT/PR22445/MED/32/571/2016). AM, SH ו-DSK מודים למרכז משפחת מהטה להנדסה ברפואה ב-IIT-Kanpur על תמיכתם הנדיבה.

הפרוטוקול מבוסס על בידוד של IFP-MSCs מעיזים. עז IFP ודם נאספו מאבטואר מקומי. מכיוון שאיסוף רקמות כזה נמצא מחוץ לתחום אחריותה של ועדת אתיקה מוסדית לבעלי חיים, לא נדרש אישור אתי.
1. בידוד של IFP-MSCs מהמפרק femorotibial של ברך עז
<ol><li>לאסוף מפרק femorotibial עז (דגימה) המקיף ~ 15 ס"מ כל אחד מאז?...

בפרוטוקול הנוכחי, שיטה פשוטה, אמינה וניתנת לשחזור לבידוד של MSCs מ- IFP עזים סופקה. תאים שבודדו בשיטה זו שימשו בהצלחה במחקרים הקודמים שלנו להתחדשות רקמות במבחנה. נצפה כי התאים המבודדים היו מתרבים, היו מגיבים לגורמי גדילה שונים, ושמרו על פעילותם הביולוגית כאשר נזרעו על גבי סיבים חשמליים ופ...

תאי גזע מזנכימליים (MSCs) הם מועמדים אטרקטיביים לטיפולים מבוססי תאים ברפואה רגנרטיבית 1,2. ניתן לקצור אותם ממגוון מקורות רקמה כגון מח עצם, חבל טבור, שליה, מוך השן ורקמת שומן תת עורית3. עם זאת, מכיוון שהזמינות של תאי גזע במבוגרים מוגבלת והליך הבידוד שלהם הוא לעתים קרובות פולשני (וכתוצאה מכך תחלואה באתר התורם), רצוי שיהיה מקור חלופי לתאי גזע שיוכל לעקוף את האתגרים הללו.
מפרק הברך הוא מחסן של סוגי תאים שונים, כגון MSCs שמקורם בכריות שומן אינפרא-כוכביות, MSCs שמקורם בקרום סינוביאלי, MSCs שמקורם בנוזל סינוביאלי, פיברובלסטים של רצועות, כונדרוציטים מפרקיים וכו'4,5,6. לתאים אלה יש פוטנציאל להיחקר באופן נרחב במחקר מבוסס הנדסת רקמות שלד-שריר. לכן, מפרק הברך יכול להיות מקור אפשרי ואמין לסוגים רבים של MSCs. מחסן השומן הממוקם במפרק הברך, המכונה כרית השומן האינפרא-כוכבית (IFP) או כרית השומן של הופה, הוא בחירה מבטיחה ואלטרנטיבית של מחסן MSC. ה- IFP הוא מקור נגיש יחסית וניתן להשגה קלינית של MSCs, שכן הוא נכרת ומושלך באופן שגרתי כפסולת כירורגית במהלך ארתרוסקופיה של הברך או ניתוח ברך פתוחה. הסרת ה-IFP קשורה לתחלואה מינימלית באתר התורם, מה שהופך אותו גם למקור רקמתי אטרקטיבי. למרות שיש להם פרופיל פנוטיפי דומה, ל-MSCs מ-IFP (IFP-MSCs) יש פוטנציאל קלונוגני משופר בהשוואה לתאי גזע מזנכימליים שמקורם במח העצם (BM-MSCs)6 ויכולת שגשוג טובה יותר בהשוואה לתאי גזע תת-עוריים שמקורם בשומן (ADSCs)7. באופן מעניין, בהשוואה ל-MSCs שמקורם בנוזל סינוביאלי (SF-MSCs), IFP-MSCs אינם מאבדים את יכולת ההתרבות שלהם במעברים מאוחרים, וגם זמן ההכפלה אינו גדל במעברים מאוחרים. זה מצביע על כך שבמהלך התרחבות התא, IFP-MSCs יכולים להשיג מספר גדול מספיק של תאים עבור יישומים של הנדסת רקמות במבחנה מבלי להתפשר על קצב ההתרבות שלהם8. מחקרים אחרונים גם הציעו כי ל-IFP-MSCs יש פוטנציאל התמיינות כונדרוגני מעולה בהשוואה ל-MSCs שמקורם במח עצם (BMSCs) ו-MSCs שמקורם בשומן (ADSCs), ככל הנראה בשל קרבתם האנטומית לסחוס מפרקי, מה שמעיד על התאמתם להנדסת רקמת סחוס 6,7,9,10. יתר על כן, יש להם גם פוטנציאל התמיינות אוסטאוגני בלתי תלוי גיל11. הודגם כי הזרקה תוך-מפרקית של IFP-MSCs מפחיתה כאבים ומשפרת את תפקודי מפרק הברך במטופלים עם דלקת מפרקים ניוונית (OA)12,13. יתר על כן, תגובות חיסוניות חזקות ותכונות אימונומודולטוריות משופרות של IFP-MSCs בנוכחות ציטוקינים דלקתיים במהלך תנאים פתולוגיים דווחו גם6.
IFP-MSCs הם מקור מבטיח וחלופי של MSCs; עם זאת, התועלת הטיפולית שלהם בהנדסת רקמות וברפואה רגנרטיבית נחקרת פחות באופן יחסי. המחקרים הקיימים על IFP-MSCs השתמשו בעיקר בתאים מתורמים אנושיים. בין אלה, כמה מחקרים אחרונים חקרו IFP-MSCs מתורמים אנושיים בריאים (חולים שאינם מפרקים, בגילאי 17-60 שנים)6,14, בעוד שרוב המחקרים השתמשו ב- IFP-MSCs מחולים מבוגרים שעברו ניתוח החלפת ברך כולל (חולים חולים, בגילאי 70-80 שנים). מכיוון שידוע שגם גיל וגם מחלה משנים את התפקוד התקין של תאי גזע (מספר מופחת ואובדן פוטנציאל תפקודי), הדבר עלול להוביל לחוסר עקביות בתוצאות המחקרים מבוססי MSC 7,15,16,17. בנוסף לכך, השימוש ב- IFP-MSCs מחולים עם מצבים פתופיזיולוגיים (למשל, דלקת פרקים והשמנת יתר) מהווה גם קושי בהבנת המאפיינים הבסיסיים של תאים בריאים במבחנה, ובכך פועל כגורם מגביל בפיתוח טיפולים מבוססי MSCs. כדי להתגבר על בעיות אלה, השימוש ב- IFP-MSCs מתורמים בריאים הוא חיוני. מכיוון שהגישה לתורם אנושי בריא היא מאתגרת, מודלים של בעלי חיים יכולים להיות חלופה טובה יותר. בהקשר זה, ישנם כמה מחקרים שבהם IFP בודד מעכברים18. עם זאת, בשל גודלה הקטן של כרית השומן בעכברים רגילים, רקמות שומן מבעלי חיים רבים שולבו כדי לקבל מספיק רקמות לביצוע הליכי ניסוי משוכללים19. לפיכך, יש צורך במודל של בעלי חיים גדולים, שיוכל למלא את הדרישה למספר התאים הגבוה יותר ובמקביל לעמוד בעקרונות 3R (עידון, החלפה והפחתה) במחקר בבעלי חיים20. לשימוש בבעלי חיים גדולים יש השלכות משמעותיות במחקר התרגומי. באופן ספציפי, בהנדסת רקמות שריר-שלד, נחקרו21 מגוון של בעלי חיים גדולים כמו כלבים, חזירים, כבשים, עזים וסוסים. עז (Capra aegagrus hircus) היא בחירה מצוינת של בעל חיים גדול מכיוון שלמפרק המחניק שלה יש את האנטומיה הקרובה ביותר למפרק הברך האנושי22,23,24. המבנה הטרבקולרי של העצם התת-כונדרלית ועובי העצם התת-כונדרלית של העזים דומים לבני אדם, ודווח גם כי היחס בין הסחוס לעצם קרוב לבני אדם21. בנוסף, עזים בויתו באופן נרחב ברחבי העולם, מה שהופך אותן לזמינות בקלות כאשר הן בוגרות מבחינה שלדית. יתר על כן, עלויות תחזוקה נמוכות וטיפול קל הפכו אותם למודל בעלי חיים אטרקטיבי למחקר22.
במחקר הנוכחי מודגם פרוטוקול פשוט לבידוד של IFP-MSCs מהמפרק המחניק של Capra aegagrus hircus (עז) ותנאי תרבית במבחנה להרחבתם והבדלתם. התאים המבודדים הם דבקים, בעלי מורפולוגיה דמוית MSC, יוצרים מושבות CFU-F (יחידות יוצרות מושבה-פיברובלסט) ובעלי פוטנציאל התמיינות אדיפוגני, כונדרוגני ואוסטיאוגני. לכן, IFP-MSCs מראים פוטנציאל כמקור חלופי של MSCs עבור יישומים ביו-רפואיים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#946;-glycerophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9422-10G</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin- 0.02% EDTA</td>
			<td>Hi-Media</td>
			<td>TCL049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15-mL centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>49752-10G</td>
			<td>50 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TCL021-50ml</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50-mL centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian Blue</td>
			<td>Hi-Media</td>
			<td>RM471</td>
			<td>For sufated gycosaminoglycans staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alizarin Red S</td>
			<td>S D Fine-Chem Limited</td>
			<td>26048-25G</td>
			<td>For calcium deposition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>A011</td>
			<td>2.5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic fibroblast growth factor (bFGF)</td>
			<td>Sino Biologicals</td>
			<td>10014-HNAE</td>
			<td>5 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCIP/NBT ALP Substrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B5655-5TAB</td>
			<td>For ALP staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>MB-083</td>
			<td>Long name: Bovine Serum Albumin (1.25 mg/mL )</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TCP-182</td>
			<td>70 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>REMI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin</td>
			<td>RANBAXY LAB. Limited</td>
			<td>B17407T1</td>
			<td>2.5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Violet</td>
			<td>S D Fine-Chem Limited</td>
			<td>42555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.94925.0521</td>
			<td>25 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2915</td>
			<td>1 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM LG</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D5523</td>
			<td>Long name: Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Media Low Glucose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270</td>
			<td>Long name: Fetal Bovine Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution 37%-41%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>61780805001730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indomethacin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7378</td>
			<td>100 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I9278</td>
			<td>10 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon Eclipse TS 100</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS + 1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2521-5mL</td>
			<td>Long name: insulin, transferrin, sodium selenite + linoleic-BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Proline</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TO-109-25G</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>61751605001730</td>
			<td>For lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Meck</td>
			<td>1.07018.2521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes and sterile tips (20 &#181;L, 200 &#181;L, 1000 &#181;L)</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MUSE Cell analyser</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td></td>
			<td>For cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT compound</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>4583</td>
			<td>Long name: Optimal Cutting Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red O dye</td>
			<td>S D Fine-Chem Limited</td>
			<td>54304</td>
			<td>For lipid vacuole staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>A007</td>
			<td>100 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (150 mm and 90 mm)</td>
			<td>NEST</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safranin O</td>
			<td>S D Fine-Chem Limited</td>
			<td>50240</td>
			<td>For sufated gycosaminoglycans staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3434</td>
			<td>3.4 % (w/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile scissors, forceps and scalpels</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For isolation of IFP-MSC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.94953.0521</td>
			<td>35 % (w/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF-&#946;1</td>
			<td>Sino Biologicals</td>
			<td></td>
			<td>Long name: Transforming growth factor- &#946;1 (10 ng/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture incubator 37 &#176;C, 5% CO2</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris buffer</td>
			<td>Merck</td>
			<td>61771405001730</td>
			<td>For lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>S D Fine-Chem Limited</td>
			<td>40632</td>
			<td>For lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type II collagenase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17101015</td>
			<td>1.5 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin D3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9756-1G</td>
			<td>10 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Well plates (6 -WP and 24-WP)</td>
			<td>NEST</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, expansion, and differentiation of mesenchymal stem cells from the infrapatellar fat pad of the goat stifle joint

ה- IFP, הנמצא במפרק הברך, משמש כמקור מבטיח של MSCs. ה- IFP הוא רקמה נגישה בקלות מכיוון שהיא נכרתת ומושלכת באופן שגרתי במהלך הליכים ארתרוסקופיים וניתוחי החלפת ברך. בנוסף, הסרתו קשורה לתחלואה מינימלית באתר התורם. מחקרים אחרונים הראו כי IFP-MSCs אינם מאבדים את יכולת ההתרבות שלהם במהלך התרחבות במבחנה ויש להם פוטנציאל התמיינות אוסטאוגני שאינו תלוי בגיל. ל-IFP-MSCs יש פוטנציאל התמיינות כונדרוגני מעולה בהשוואה ל-MSCs (BMSCs) שמקורם במח עצם ולתאי גזע שמקורם בשומן (ADSCs). למרות שתאים אלה ניתנים להשגה בקלות מחולים מבוגרים וחולים, יעילותם מוגבלת. לפיכך, חשוב להשתמש ב-IFP-MSCs מתורמים בריאים כדי לקבוע את יעילותם ביישומים ביו-רפואיים. מכיוון שהגישה לתורם אנושי בריא היא מאתגרת, מודלים של בעלי חיים יכולים להיות חלופה טובה יותר שתאפשר הבנה בסיסית. בעלי חיים גדולים כמו כלבים, סוסים, כבשים ועזים ממלאים תפקיד מכריע במחקר התרגומי. מבין אלה, העז יכולה להיות מודל מועדף מכיוון שלמפרק המחניק של העז יש את האנטומיה הקרובה ביותר למפרק הברך האנושי. יתר על כן, goat-IFP יכול למלא את מספרי MSC הגבוהים יותר הדרושים ליישומי התחדשות רקמות. יתר על כן, עלות נמוכה, זמינות ועמידה בעקרונות 3R למחקר בבעלי חיים הופכים אותם למודל אטרקטיבי. מחקר זה מדגים פרוטוקול פשוט לבידוד IFP-MSCs מהמפרק המחניק של עזים ותנאי תרבית חוץ גופית להרחבתם והתמיינותם. ה-IFP המבודד באספטית מהעז נשטף, נטחן ועוכל באופן אנזימטי. לאחר סינון וצנטריפוגה, התאים שנאספו היו בתרבית. תאים אלה היו דבקים, היו בעלי מורפולוגיה דמוית MSCs, והפגינו יכולת קלונוגנית יוצאת דופן. יתר על כן, הם נבדלו לשושלות אדיפוגניות, כונדרוגניות ואוסטיאוגניות, והפגינו את הרב-פוטנטיות שלהם. לסיכום, המחקר מדגים את הבידוד וההרחבה של MSCs, אשר מראים פוטנציאל בהנדסת רקמות וביישומים של רפואה רגנרטיבית.

בידוד של IFP-MSCs מהמפרק הפמורוטיבי של עז השלבים הכרוכים בבידוד של IFP-MSCs מהמפרק המחניק של עז מתוארים באיור 1. כרית השומן שהייתה נוכחת במשטח הפנימי שאינו מפרקי של הפטלה הוסרה, נטחנה והתעכלה באופן אנזימטי. ה-IFP-MSCs בודדו בהצלחה ועברו תרבית במבחנה (איור 2A</s...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Expansion, and Differentiation of Mesenchymal Stem Cells from the Infrapatellar Fat Pad of the Goat Stifle Joint at JoVE.com

Isolation, Expansion, and Differentiation of Mesenchymal Stem Cells from the Infrapatellar Fat Pad of the Goat Stifle Joint

ניתן לבודד בקלות תאי גזע מזנכימליים של כריות שומן אינפרא-פטלריות (IFP-MSCs) ממשטח השומן האינפרא-פטלרי של מפרק הברך. הם מתרבים היטב במבחנה, יוצרים מושבות CFU-F, ומתבדלים לשושלות אדיפוגניות, כונדרוגניות ואוסטיאוגניות. כאן מסופקת המתודולוגיה לבידוד, הרחבה והבחנה של IFP-MSCs ממפרק מחניק עזים.

בידוד, הרחבה והתמיינות של תאי גזע מזנכימליים ממשטח השומן האינפרא-פטלרי של מפרק העיזים מחניק

The IFP, present in the knee joint, serves as a promising source of MSCs. The IFP is an easily accessible tissue as it is routinely resected and discarded ...

תאי גזע מזנכימליים שמקורם ב-Infrapatellar Pad, או בקיצור, IFP-MSCs, הוא סוג תאי גזע יחסית פחות נחקר. פרוטוקול זה הוא שיטה פשוטה, אמינה וניתנת לשחזור המדגימה את הבידוד של IFP-MSCs ממפרק מחניק עזים. היתרון העיקרי של הטכניקה הוא כי מספר גדול של IFP-MSCs באיכות גבוהה ניתן להשיג.IFP-MSCs מבודדים יכולים להתבדל לשושלות מרובות ולהיות בעלי פוטנציאל התחדשות נרחב. בשל מיקומם האנטומי, IFP-MSCs צברו עניין בתיקון פגמים בסחוס ובהקלה על התדרדרות הסחוס בדלקת מפרקים ניוונית. לשיטה השלכות על טיפול מבוסס תאים בתחום הנדסת רקמות ורפואה רגנרטיבית.הליך הבידוד, ההרחבה וההבחנה של IFP-MSCs יודגם על ידי ד"ר סוגטה הזארה ומר אמן מחאג'אן. כדי להתחיל את הבידוד של תאי גזע מזנכימליים של שומן אינפרא-כוכבי, או IFP-MSCs, לאסוף מפרקים פמורוטיביאליים עזים המקיפים כ -15 ס"מ של אזורי הירך והטיביאליות של הגפיים האחוריות בתיבת דגימת איסוף מעוקרת. אחסנו את הדגימה בארבע מעלות צלזיוס להובלה למעבדה להמשך עיבוד.הניחו את הדגימה על צלחת פטרי בקוטר 150 מ"מ והקפידו לעבד את הדגימה באופן אספטי וארון בטיחות ביולוגי לאורך כל ההליך. שטפו אותו ביסודיות עם PBS אוטומטי בתוספת אנטיביוטיקה. שמור על הדגימה hydrated באמצעות PBS.בחן היטב את האזורים האנטומיים של הדגימה. לגישה נוחה, הסירו את הרקמות הנוספות משתי העצמות הארוכות לחלוטין על ידי החזקת המשטח הסופי של עצם הירך ביד אחת וחיתוך אורכי לכיוון המפרק באמצעות מספריים חדים. לאחר מכן, מבלי להפריע לרקמה המקיפה את קפסולת המפרק, הסר את השרירים ואת רקמת השומן מהעצם.באופן דומה, לבצע חתך נוסף בקצה הטיביאלי של הדגימה ולהסיר את השרירים ורקמת השומן מהעצם הטיביאלית. ודא כי שתי העצמות הארוכות חשופות לחלוטין וכי הקפסולה המשותפת גלויה. לאחר מכן, בצע חתך משני צדי הממברנה הסינוביאלית כדי לחתוך את המפרק המפרק.חותכים את הפטלה מהקרום הסינוביאלי והרצועות הפטאליות באמצעות מספריים ומלקחיים מעוקרים טריים. מיד מניחים את הפטלה המופרדת בצלחת פטרי המכילה PBS. מהפטלה המופרדת, הסר את כל כרית השומן הקיימת על המשטח הפנימי באמצעות מספריים ומלקחיים.אוספים אותו בצלחת פטרי טרייה אחרת, וטוחנים אותו באמצעות אזמל. כלול כלי ניתוח אחרים כדי להשיג את קטעי השומן הקטנים של כשניים עד שלושה מילימטרים. השתמשו במרית כדי להעביר את הרקמה הטחונה לצינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר ושטפו אותה שלוש פעמים עם PBS בתוספת אנטיביוטיקה למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר באמצעות מערבל מבחנה.לעיכול אנזימטי, יש לדגור על כחמישה גרם של הרקמה הטחונה ב-Modified Eagle Media של Dulbecco, או DMEM, מדיה דלת גלוקוז המכילה 1.5 מיליגרם למיליליטר של קולגן מסוג II ו-2% FBS בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 12 עד 16 שעות. שאפו בזהירות את הרקמה המעוכלת וסננו אותה דרך מסננת תאים של 70 מיקרון כדי להסיר כל חלק לא מעוכל. צנטריפוגה את התסנין בצינור צנטריפוגה 15 מיליליטר ב 150 פעמים גרם במשך חמש דקות.יש להסיר את הסופר-נטנט לפני שטיפת כדור התא עם DMEM דל גלוקוז פעמיים. השעה מחדש את הכדור ב- DMEM שלם, הידוע גם בשם מדיית הרחבה. זרעו את התאים על צלחת פטרי בקוטר 150 מילימטר ותרבבו אותם במדיית ההרחבה בתוספת חמישה ננוגרם למיליליטר של גורם גדילה פיברובלסטי בסיסי, או BFGF, ו-50 מיקרוגרם למיליליטר 2-Phospho-L-חומצה אסקורבית מלח טריסודיום.דגירה של התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור של 5% פחמן דו-חמצני כדי לאפשר לתאים להיצמד ולהתרבות. עקוב אחר ההתקשרות והצמיחה של התאים מדי יום. לתחזוקה נאותה והרחבה של IFP-MSCs, שנה את המדיה כל שלושה ימים.תוך כדי שינוי המדיה, הוסיפו חמישה ננוגרם טריים למיליליטר BFGF ו-50 מיקרוגרם למילימטר של מלח טריסודיום חומצה 2-פוספו-L-אסקורבית ישירות לצלחת פטרי. ברגע שהתאים הופכים ל-80% עד 90% קונפלואנטים, תת-תרבות אותם על ידי הסרת מדיית ההתפשטות מצלחת הפטרי ושטיפת התאים עם 1X PBS. לאחר מכן מוסיפים ארבעה מיליליטר של 0.25% טריפסין-EDTA לצלחת ודוגרים את התאים ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור 5% פחמן דו חמצני.לאחר ארבע דקות, הקש על הצלחת שעל צדה כדי לנתק את התאים. אשר את הניתוק המלא של כל התאים תחת מיקרוסקופ. לאחר האישור, הוסף נפח שווה של מדיית הרחבה כדי לנטרל את הטריפסין.השתמש פיפטה כדי לאסוף את התאים המנותקים האלה בצינור פוליפרופילן טרי של 15 מיליליטר וצנטריפוגה שלהם ב 150 פעמים גרם במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. השליכו את ה-supernatant והחזירו את הכדור בנפח הרצוי של מדיית ההרחבה. לספור את התאים בשיטת ספירת התאים הסטנדרטית ולתת להם תרבית להרחבה נוספת בצפיפות זריעה של 10, 000 תאים לסנטימטר מרובע בצלחת פטרי של 150 מיליליטר.עבור כל המבחנים, השתמש במונו-שכבה מקבילה של תאים ממספר המעבר P2 עד P5. כאשר התאים המורחבים מגיעים למפגש של 80% עד 90%, יש לנתק את התאים באמצעות תמיסת טריפסין-EDTA לפני שהם מפילים אותם בצינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר ב-150 פעמים גרם למשך חמש דקות. ואז לתלות את הכדור בפלזמה עיזים בצפיפות של 2 מיליון תאים לכל 50 מיקרוליטר. הוסיפו 50 מיקרוליטרים של פלזמה המכילה את התאים על צלחת פטרי מעוקרת בקוטר 90 מ"מ, ולאחר מכן הוסיפו סידן כלורי בריכוז סופי של 0.3% ערבבו היטב כדי לייצר הידרוג'ל פלזמה צולב.לאחר דגירה של הידרוג'ל מפוברק בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 40 דקות, העבירו את ההידרוג'לים ללוחות תרבית רקמה של 24 בארות המכילות מדיה כונדרוגנית. החלף את המדיה כל שלושה ימים למשך 14 יום. ההידרוג'לים שגודלו בתרבית במדיית DMEM מלאה ללא TGF-beta 1 נחשבים לבקרות לא מושרות.לאחר 14 ימים של התמיינות כונדרוגנית של תאים בהידרוג'ל פלזמה, שטפו את ההידרוג'לים שלוש פעמים עם PBS במשך חמש דקות כל אחד, וקבעו את הדגימות בפורמלין נייטרלי במשך שלוש שעות. IFP-MSCs מבודדים היו דבקים הומוגנית והשיגו מורפולוגיה מוארכת תוך 24 שעות מתרבית המבחנה. התאים התרבו ביעילות של 80% עד 90% מפגש תוך שישה ימים מההתפשטות והפגינו יכולת קלונוגנית, מה שמעיד על יכולות שגשוג והתחדשות עצמית יעילות.כאשר טופלו כדי להתמיין לשושלת אדיפוגנית, התאים המבודדים ייצרו טיפות שומנים, אשר אושרו על ידי שמן אדום O מכתים בימים 14 ו -21. טיפות שמן כאלה לא נראו בתאים ללא גורמים גורמים מעוררים אדיפוגניים. התאים המבודדים העטופים בהידרוג'ל פלזמה הראו היווצרות של רקמות ניאו-רקמה לבנה ומבריקה לאחר 14 יום בקבוצה המושרה הציגו את הפוטנציאל הכונדרוגני.לקבוצה שלא נגרמה הייתה רקמה לבנה חיוורת עם ברק מופחת. בנוסף, צביעה היסטולוגית חיובית עבור כחול אלקסיאני וספרנין O בקבוצה המושרה הצביעה על כך שהתאים יכולים להפריש גליקוזאמינוגליקנים סולפטיים, אחד המרכיבים העיקריים של מטריצת הסחוס. לעומת זאת, מקטעי ההידרוג'ל מהקבוצות הלא מושרות היו שליליים עבור כתמי ספרנין O וכחול אלקיאני, מה שאישר את פוטנציאל ההתמיינות הכונדרוגנית של תאי הגזע המזנכימליים רק בנוכחות גירויים כונדרוגניים.התאים המבודדים המושרים במדיה אוסטאוגנית הראו כתמים חיוביים עבור phosphatase אלקליין, המאשר מינרליזציה בתום 14 ימים. לאחר 28 ימים של אינדוקציה אוסטאוגנית, נצפו תצהירים עם הכתמה אדומה של אליזרין. התוצאות הדגישו את פוטנציאל ההתמיינות של תאים מושרים לשושלות אדיפוגניות, כונדרוגניות ואוסטיאוגניות.זה חיוני כדי לעבד את הדגימה בתנאים אספטיים כדי למנוע זיהום. חשוב גם לזהות את המיקום הנכון של patella. הליך זה פותח את הדרך לבודד סוגי תאים שונים, כגון כונדרוציטים מפרקיים, פיברובלסטים של רצועות ותאי גזע מסינוביום ונוזל סינוביאלי, עם יישומים נרחבים ברפואה רגנרטיבית.לאחר בידוד של IFP-MSCs באמצעות טכניקה זו, יעילותה נחקרה במיוחד להתחדשות של רקמות שלד-שריר, כגון סחוס, עצם ורצועות באמצעות גישות נטולות פיגומים ופיגומים.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

אלגינט microcapsule כפלטפורמה 3D עבור ריבוי והתמיינות של בתאי גזע עובריים אנושיים (hESC) כדי שושלות שונות

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

פיתוח, הרחבה, ו<em&gt; בvivo</emתאי גזע pluripotent&gt; ניטור של תאי NK אדם מתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) ומושרה (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on Poly(&#949;-caprolactone) Electrospun Yarns

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on PolyÃƒÅ½Ã‚Âµ-caprolactone Electrospun Yarns

אופטימיזציה של קובץ מצורף של תאי גזע mesenchymal האדם על פולי (ε-caprolactone) חוטים electrospun

Research into biomaterials and tissue engineering often includes cell-based in vitro investigations, which require initial knowledge of the starting cell ...

Scaffold-supported Transplantation of Islets in the Epididymal Fat Pad of Diabetic Mice

פיגום נתמך השתלת איים בשומן השומן האפידידימלי של עכברים סוכרתית

Islet transplantation has been clinically proven to be effective at treating type 1 diabetes. However, the current intrahepatic transplantation strategy ...

Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells

בידוד של גזע Mesenchymal מן האדם קרום העצם מכתשיים ואפקטים של ויטמין D על פעילות Osteogenic של תאים נגזר קרום העצם

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the ...

Exploring the Potential of Mesenchymal Stem Cell Sheet on The Development of Hepatocellular Carcinoma In Vivo

Exploring the Potential of Mesenchymal Stem Cell Sheet on The Development of Hepatocellular Carcinoma In Vivo

חקר את הפוטנציאל של תא גזע Mesenchymal גיליון על הפיתוח של קרצינומה Hepatocellular In Vivo

An in vivo animal model that mimics human cancer could have various applications that deliver significant clinical information. The currently used ...

Construction and Use of an Electrical Stimulation Chamber for Enhancing Osteogenic Differentiation in Mesenchymal Stem/Stromal Cells In Vitro

בנייה ושימוש חדר גירוי חשמלי לשיפור Osteogenic התמיינות בתאי גזע Mesenchymal/סטרומה במבחנה

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) have been used extensively to promote bone healing in tissue engineering approaches. Electrical stimulation (EStim) ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

מדידה פוטנציאלית לפעולה אופטית חד-תאית בקרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע מושרים על ידי תאי גזע אנושיים

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Generation of Human Blood Vessel Organoids from Pluripotent Stem Cells

יצירת אורגנואידים של כלי דם אנושיים מתאי גזע פלוריפוטנטיים

An organoid is defined as an engineered multicellular in vitro tissue that mimics its corresponding in vivo organ such that it can be used to study ...

Creation of a Knee Joint-on-a-Chip for Modeling Joint Diseases and Testing Drugs

יצירת מפרק ברך על שבב למידול מחלות מפרקים ובדיקת תרופות

The high prevalence of debilitating joint diseases like osteoarthritis (OA) poses a high socioeconomic burden. Currently, the available drugs that target ...