Name: isolation, expansion, and differentiation of mesenchymal stem cells from the infrapatellar fat pad of the goat stifle joint
Uploaded: 2022-08-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Expansion, and Differentiation of Mesenchymal Stem Cells from the Infrapatellar Fat Pad of the Goat Stifle Joint at JoVE.com

SH riconosce il supporto dell'Institute Post-Doctoral Fellowship di IIT Kanpur e la sovvenzione SYST di DST (SEED Division) (SP / YO / 618 / 2018). AM riconosce l'Indian Institute of Technology-Kanpur (IIT-Kanpur) per una borsa di studio dell'Istituto. DSK riconosce Gireesh Jankinath Chair Professorship e Department of Biotechnology, India, per il finanziamento (BT / PR22445 / MED / 32/571 / 2016). AM, SH e DSK ringraziano il Mehta Family Centre for Engineering in Medicine di IIT-Kanpur per il loro generoso supporto.

Il protocollo si basa sull'isolamento delle IFP-MSC dalle capre. Capra IFP e sangue sono stati raccolti da un mattatoio locale. Poiché tali collezioni di tessuti sono al di fuori della competenza di un comitato etico istituzionale per gli animali, non era richiesta l'approvazione etica.
1. Isolamento delle IFP-MSC dall'articolazione femorotibiale del ginocchio di capra
<ol><li>Raccogliere l'articolazione femorotibiale della capra (campione) che comprende ~ 15 cm ciascuna de...

Nel presente protocollo è stato fornito un metodo semplice, affidabile e riproducibile per l'isolamento delle MSC dall'IFP caprino. Le cellule isolate con questo metodo sono state utilizzate con successo nei nostri precedenti studi per la rigenerazione tissutale in vitro. È stato osservato che le cellule isolate erano proliferative, rispondevano a vari fattori di crescita e conservavano la loro attività biologica quando seminate su fibre elettrofilate e scaffold25,26<sup cla...

Le cellule staminali mesenchimali (MSC) sono un candidato interessante per le terapie cellulari nella medicina rigenerativa 1,2. Possono essere raccolti da una varietà di fonti tissutali come midollo osseo, cordone ombelicale, placenta, polpa dentale e tessuto adiposo sottocutaneo3. Tuttavia, poiché la disponibilità di cellule staminali negli adulti è limitata e la loro procedura di isolamento è spesso invasiva (con conseguente morbilità del sito donatore), è auspicabile avere una fonte alternativa di cellule staminali che potrebbe aggirare queste sfide.
L'articolazione del ginocchio è un deposito di vari tipi di cellule, come MSC derivate da cuscinetti di grasso infrarotuleo, MSC derivate dalla membrana sinoviale, MSC derivate dal liquido sinoviale, fibroblasti legamentosi, condrociti articolari, ecc 4,5,6. Queste cellule hanno il potenziale per essere ampiamente esplorate nella ricerca basata sull'ingegneria dei tessuti muscoloscheletrici. Pertanto, l'articolazione del ginocchio potrebbe essere una fonte possibile e affidabile di più tipi di MSC. Il deposito adiposo situato nell'articolazione del ginocchio, noto come cuscinetto adiposo infrarotuleo (IFP) o cuscinetto adiposo di Hoffa, è una scelta promettente e alternativa del deposito MSC. L'IFP è una fonte relativamente facilmente accessibile e clinicamente ottenibile di MSC, poiché viene regolarmente resecata e scartata come rifiuto chirurgico durante l'artroscopia del ginocchio o la chirurgia del ginocchio aperto. La rimozione dell'IFP è associata a una morbilità minima del sito donatore, che lo rende anche una fonte di tessuto attraente. Pur avendo un profilo fenotipico simile, le MSC da IFP (IFP-MSCs) hanno un potenziale clonogenico aumentato rispetto alle cellule staminali mesenchimali derivate dal midollo osseo (BM-MSCs)6 e una migliore capacità proliferativa rispetto alle cellule staminali derivate dal tessuto adiposo sottocutaneo (ADSC)7. È interessante notare che, rispetto alle MSC derivate dal liquido sinoviale (SF-MSCs), le IFP-MSC non perdono la loro capacità proliferativa nei passaggi tardivi, né il tempo di raddoppio aumenta nei passaggi tardivi. Ciò suggerisce che, durante l'espansione cellulare, le IFP-MSC possono raggiungere un numero sufficientemente elevato di cellule per applicazioni di ingegneria tissutale in vitro senza compromettere il loro tasso di proliferazione8. Studi recenti hanno anche suggerito che le IFP-MSC possiedono un potenziale di differenziazione condrogena superiore rispetto alle MSC derivate dal midollo osseo (BMSC) e alle MSC derivate dal tessuto adiposo (ADSC), probabilmente a causa della loro vicinanza anatomica alla cartilagine articolare, indicando la loro idoneità per l'ingegneria del tessuto cartilagineo 6,7,9,10. Inoltre, possiedono anche un potenziale di differenziazione osteogenica indipendente dall'età11. È stato dimostrato che l'iniezione intra-articolare di IFP-MSCs riduce il dolore e migliora le funzioni articolari del ginocchio nei pazienti con osteoartrite (OA)12,13. Inoltre, sono state riportate anche forti risposte immunosoppressive e migliori proprietà immunomodulatorie delle IFP-MSCs in presenza di citochine infiammatorie durante condizioni patologiche6.
Le IFP-MSC sono una fonte promettente e alternativa di MSC; Tuttavia, il loro beneficio terapeutico nell'ingegneria tissutale e nella medicina rigenerativa è relativamente meno esplorato. Gli studi esistenti sulle IFP-MSC hanno utilizzato principalmente cellule provenienti da donatori umani. Tra questi, alcuni studi recenti hanno indagato IFP-MSC da donatori umani sani (pazienti non artritici, di età compresa tra 17 e 60 anni)6,14, mentre la maggior parte degli studi ha utilizzato IFP-MSC di pazienti anziani sottoposti a chirurgia sostitutiva totale del ginocchio (pazienti malati, età 70-80 anni). Poiché sia l'età che la malattia sono note per alterare il normale funzionamento delle cellule staminali (numero ridotto e perdita di potenziale funzionale), ciò potrebbe potenzialmente portare a incongruenze nei risultati degli studi basati su MSC 7,15,16,17. Inoltre, l'uso di IFP-MSCs da pazienti con condizioni fisiopatologiche (ad esempio, artrite e obesità) pone anche difficoltà per la comprensione delle caratteristiche di base delle cellule sane in vitro, agendo così come fattore limitante nello sviluppo di terapie basate su MSC. Per superare questi problemi, l'uso di IFP-MSC da donatori sani è vitale. Poiché l'accesso a un donatore umano sano è impegnativo, i modelli animali potrebbero essere un'alternativa migliore. A questo proposito, ci sono alcuni studi in cui IFP è stato isolato dai topi18. Tuttavia, a causa delle piccole dimensioni del cuscinetto adiposo nei topi normali, i tessuti grassi di più animali sono stati combinati per ottenere abbastanza tessuto per eseguire elaborate procedure sperimentali19. Quindi, c'è bisogno di un modello animale di grandi dimensioni, che potrebbe soddisfare il requisito per il maggior numero di cellule e contemporaneamente rispettare i principi 3R (perfezionare, sostituire e ridurre) nella ricerca sugli animali20. L'uso di grandi animali ha implicazioni significative nella ricerca traslazionale. In particolare, nell'ingegneria dei tessuti muscoloscheletrici, è stata studiata una serie di animali di grandi dimensioni come cani, maiali, pecore, capre e cavalli21. La capra (Capra aegagrus hircus) è un'ottima scelta di animali di grandi dimensioni poiché la sua articolazione soffocante ha l'anatomia più vicina all'articolazione del ginocchio umano22,23,24. La struttura trabecolare ossea subcondrale e lo spessore osseo subcondrale delle capre sono simili a quelli degli esseri umani, e la proporzione della cartilagine rispetto all'osso è anche segnalata per essere vicina agli esseri umani21. Inoltre, le capre sono state ampiamente addomesticate in tutto il mondo, rendendole facilmente disponibili quando sono scheletricamente mature. Inoltre, i bassi costi di manutenzione e la facilità d'uso li hanno resi un modello animale attraente per la ricerca22.
Nel presente studio viene dimostrato un semplice protocollo per l'isolamento delle IFP-MSC dall'articolazione soffocante di Capra aegagrus hircus (capra) e le condizioni di coltura in vitro per la loro espansione e differenziazione. Le cellule isolate sono aderenti, hanno morfologia simile alle MSC, formano colonie CFU-F (unità formanti colonie-fibroblasti) e possiedono un potenziale di differenziazione adipogenico, condrogeno e ostegenico. Pertanto, le IFP-MSC mostrano il potenziale come fonte alternativa di MSC per applicazioni biomediche.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#946;-glycerophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9422-10G</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin- 0.02% EDTA</td>
			<td>Hi-Media</td>
			<td>TCL049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15-mL centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>49752-10G</td>
			<td>50 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TCL021-50ml</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50-mL centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian Blue</td>
			<td>Hi-Media</td>
			<td>RM471</td>
			<td>For sufated gycosaminoglycans staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alizarin Red S</td>
			<td>S D Fine-Chem Limited</td>
			<td>26048-25G</td>
			<td>For calcium deposition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>A011</td>
			<td>2.5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic fibroblast growth factor (bFGF)</td>
			<td>Sino Biologicals</td>
			<td>10014-HNAE</td>
			<td>5 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCIP/NBT ALP Substrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B5655-5TAB</td>
			<td>For ALP staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>MB-083</td>
			<td>Long name: Bovine Serum Albumin (1.25 mg/mL )</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TCP-182</td>
			<td>70 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>REMI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin</td>
			<td>RANBAXY LAB. Limited</td>
			<td>B17407T1</td>
			<td>2.5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Violet</td>
			<td>S D Fine-Chem Limited</td>
			<td>42555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.94925.0521</td>
			<td>25 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2915</td>
			<td>1 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM LG</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D5523</td>
			<td>Long name: Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Media Low Glucose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270</td>
			<td>Long name: Fetal Bovine Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution 37%-41%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>61780805001730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indomethacin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7378</td>
			<td>100 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I9278</td>
			<td>10 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon Eclipse TS 100</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS + 1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2521-5mL</td>
			<td>Long name: insulin, transferrin, sodium selenite + linoleic-BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Proline</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TO-109-25G</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>61751605001730</td>
			<td>For lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Meck</td>
			<td>1.07018.2521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes and sterile tips (20 &#181;L, 200 &#181;L, 1000 &#181;L)</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MUSE Cell analyser</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td></td>
			<td>For cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT compound</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>4583</td>
			<td>Long name: Optimal Cutting Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red O dye</td>
			<td>S D Fine-Chem Limited</td>
			<td>54304</td>
			<td>For lipid vacuole staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>A007</td>
			<td>100 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (150 mm and 90 mm)</td>
			<td>NEST</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safranin O</td>
			<td>S D Fine-Chem Limited</td>
			<td>50240</td>
			<td>For sufated gycosaminoglycans staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3434</td>
			<td>3.4 % (w/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile scissors, forceps and scalpels</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For isolation of IFP-MSC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.94953.0521</td>
			<td>35 % (w/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF-&#946;1</td>
			<td>Sino Biologicals</td>
			<td></td>
			<td>Long name: Transforming growth factor- &#946;1 (10 ng/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture incubator 37 &#176;C, 5% CO2</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris buffer</td>
			<td>Merck</td>
			<td>61771405001730</td>
			<td>For lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>S D Fine-Chem Limited</td>
			<td>40632</td>
			<td>For lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type II collagenase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17101015</td>
			<td>1.5 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin D3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9756-1G</td>
			<td>10 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Well plates (6 -WP and 24-WP)</td>
			<td>NEST</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, expansion, and differentiation of mesenchymal stem cells from the infrapatellar fat pad of the goat stifle joint

L'IFP, presente nell'articolazione del ginocchio, funge da fonte promettente di MSC. L'IFP è un tessuto facilmente accessibile in quanto viene regolarmente resecato e scartato durante le procedure artroscopiche e gli interventi chirurgici di sostituzione del ginocchio. Inoltre, la sua rimozione è associata a una morbilità minima del sito donatore. Studi recenti hanno dimostrato che le IFP-MSC non perdono la loro capacità di proliferazione durante l'espansione in vitro e hanno un potenziale di differenziazione osteogenica indipendente dall'età. Le IFP-MSC possiedono un potenziale di differenziazione condrogena superiore rispetto alle MSC derivate dal midollo osseo (BMSC) e alle cellule staminali derivate dal tessuto adiposo (ADSC). Sebbene queste cellule siano facilmente ottenibili da pazienti anziani e malati, la loro efficacia è limitata. Pertanto, l'utilizzo di IFP-MSC da donatori sani è importante per determinare la loro efficacia nelle applicazioni biomediche. Poiché l'accesso a un donatore umano sano è difficile, i modelli animali potrebbero essere un'alternativa migliore per consentire la comprensione fondamentale. Grandi animali come cani, cavalli, pecore e capre svolgono un ruolo cruciale nella ricerca traslazionale. Tra questi, la capra potrebbe essere un modello preferito poiché l'articolazione soffocante della capra ha l'anatomia più vicina all'articolazione del ginocchio umano. Inoltre, l'IFP di capra può soddisfare i numeri MSC più elevati necessari per le applicazioni di rigenerazione dei tessuti. Inoltre, il basso costo, la disponibilità e la conformità ai principi 3R per la ricerca sugli animali li rendono un modello attraente. Questo studio dimostra un semplice protocollo per isolare le IFP-MSC dall'articolazione soffocante delle capre e dalle condizioni di coltura in vitro per la loro espansione e differenziazione. L'IFP asettico isolato dalla capra è stato lavato, tritato e digerito enzimaticamente. Dopo la filtrazione e la centrifugazione, le cellule raccolte sono state coltivate. Queste cellule erano aderenti, avevano una morfologia simile alle MSC e dimostravano una notevole capacità clonogenica. Inoltre, si sono differenziati in linee adipogeniche, condrogeniche e osteogeniche, dimostrando la loro multipotenza. In conclusione, lo studio dimostra l'isolamento e l'espansione delle MSC, che mostrano il potenziale nelle applicazioni di ingegneria tissutale e medicina rigenerativa.

Isolamento delle IFP-MSC dall'articolazione femorotibiale della capra Le fasi coinvolte nell'isolamento delle IFP-MSC dall'articolazione soffocante di una capra sono illustrate nella Figura 1. Il cuscinetto adiposo presente nella superficie interna non articolata della rotula è stato rimosso, tritato e digerito enzimaticamente. Le IFP-MSC sono state isolate e coltivate con successo in vitro (Figura 2A).
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Isolation, Expansion, and Differentiation of Mesenchymal Stem Cells from the Infrapatellar Fat Pad of the Goat Stifle Joint

Le cellule staminali mesenchimali infrarotulee (IFP-MSC) possono essere isolate facilmente dal cuscinetto adiposo infrarotuleo dell'articolazione del ginocchio. Proliferano bene in vitro, formano colonie CFU-F e si differenziano in linee adipogeniche, condrogeniche e osteogeniche. Qui viene fornita la metodologia per l'isolamento, l'espansione e la differenziazione delle IFP-MSC dall'articolazione del soffocamento della capra.

Isolamento, espansione e differenziazione delle cellule staminali mesenchimali dal cuscinetto di grasso infrarotuleo dell'articolazione soffocante della capra

The IFP, present in the knee joint, serves as a promising source of MSCs. The IFP is an easily accessible tissue as it is routinely resected and discarded ...

Le cellule staminali mesenchimali derivate da cuscinetti di grasso infrarotuleo, o in breve, IFP-MSC, sono un tipo di cellule staminali relativamente meno studiato. Questo protocollo è un metodo semplice, affidabile e riproducibile che dimostra l'isolamento delle IFP-MSC dall'articolazione di soffocamento della capra. Il vantaggio principale della tecnica è che è possibile ottenere un gran numero di IFP-MSC di alta qualità.Le IFP-MSC isolate possono differenziarsi in più linee e possedere un ampio potenziale rigenerativo. Grazie alla loro posizione anatomica, le IFP-MSC hanno acquisito interesse nella riparazione dei difetti della cartilagine e nell'alleviare la degradazione della cartilagine nell'osteoartrite. Il metodo ha implicazioni per la terapia cellulare nel campo dell'ingegneria tissutale e della medicina rigenerativa.La procedura per l'isolamento, l'espansione e la differenziazione delle IFP-MSC sarà dimostrata dal Dr.Sugata Hazra e dal Sig. Aman Mahajan. Per iniziare l'isolamento delle cellule staminali mesenchimali infrapatulee, o IFP-MSC, raccogliere le articolazioni femorotibiali di capra che comprendono circa 15 centimetri delle regioni femorali e tibiali degli arti posteriori in una scatola di campioni di raccolta sterilizzata. Conservare il campione a quattro gradi Celsius per il trasporto in laboratorio per ulteriori elaborazioni.Posizionare il campione su una piastra di Petri da 150 millimetri e assicurarsi di elaborare il campione in modo asettico e su un armadio di biosicurezza durante tutta la procedura. Risciacquare abbondantemente con PBS autoclavato integrato con antibiotici. Mantenere il campione idratato utilizzando PBS.Esaminare attentamente le regioni anatomiche del campione. Per un facile accesso, rimuovere completamente i tessuti extra da entrambe le ossa lunghe tenendo la superficie terminale dell'osso del femore con una mano e tagliandola longitudinalmente verso l'articolazione usando forbici affilate. Quindi, senza disturbare il tessuto che circonda la capsula articolare, rimuovere i muscoli e il tessuto adiposo dall'osso.Allo stesso modo, fare un'altra incisione all'estremità tibiale del campione e rimuovere i muscoli e il tessuto adiposo dall'osso tibiale. Assicurarsi che entrambe le ossa lunghe siano completamente esposte e che la capsula articolare sia visibile. Quindi, praticare un'incisione da entrambi i lati della membrana sinoviale per tagliare l'articolazione articolare.Tagliare la rotula dalla membrana sinoviale e dai legamenti rotulei usando forbici e pinze sterilizzate fresche. Posizionare immediatamente la rotula separata in una capsula di Petri contenente PBS. Dalla rotula separata, rimuovere l'intero cuscinetto adiposo presente sulla superficie interna usando forbici e pinze.Raccoglietelo in un'altra capsula di Petri fresca e tritatelo usando un bisturi. Includere altri strumenti chirurgici per ottenere i piccoli segmenti di grasso di circa due o tre millimetri. Utilizzare una spatola per trasferire il tessuto tritato in una provetta da centrifuga da 50 millilitri e lavarlo tre volte con PBS integrato con antibiotici per 15 minuti a temperatura ambiente utilizzando un miscelatore per provetta.Per la digestione enzimatica, incubare circa cinque grammi di tessuto tritato in Modified Eagle Media di Dulbecco, o DMEM, mezzi a basso contenuto di glucosio contenenti 1,5 milligrammi per millilitro di collagenasi di tipo II e 2% FBS a 37 gradi Celsius per 12-16 ore. Aspirare con cura il tessuto digerito e filtrarlo attraverso un filtro cellulare da 70 micron per rimuovere qualsiasi parte non digerita. Centrifugare il filtrato in una provetta da 15 millilitri a 150 volte g per cinque minuti.Rimuovere il surnatante prima di lavare il pellet cellulare con DMEM a basso contenuto di glucosio due volte. Risospendere il pellet in DMEM completo, noto anche come mezzo di espansione. Seminare le cellule su una piastra di Petri da 150 millimetri e coltivarle nel mezzo di espansione integrato con cinque nanogrammi per millilitro di fattore di crescita dei fibroblasti di base, o BFGF, e 50 microgrammi per millilitro di sale trisodico dell'acido 2-fosfo-L-ascorbico.Incubare le cellule a 37 gradi Celsius in un incubatore di anidride carbonica al 5% per consentire alle cellule di aderire e proliferare. Monitorare l'attaccamento e la crescita delle cellule ogni giorno. Per una corretta manutenzione ed espansione delle IFP-MSC, cambiare il supporto ogni tre giorni.Durante la sostituzione del supporto, aggiungere cinque nanogrammi freschi per millilitro di BFGF e 50 microgrammi per millimetro di sale trisodico dell'acido 2-fosfo-L-ascorbico direttamente nella capsula di Petri. Una volta che le cellule diventano confluenti dall'80% al 90%, sottocoltivarle rimuovendo il mezzo di espansione dalla piastra di Petri e lavando le cellule con 1X PBS. Quindi aggiungere quattro millilitri di 0,25% Tripsina-EDTA al piatto e incubare le cellule a 37 gradi Celsius in un incubatore di anidride carbonica al 5%.Dopo quattro minuti, picchiettare la piastra su un lato per rimuovere le celle. Confermare il completo distacco di tutte le cellule al microscopio. Una volta confermato, aggiungere un volume uguale di mezzi di espansione per neutralizzare la tripsina.Utilizzare una pipetta per raccogliere queste cellule dissociate in un tubo di polipropilene fresco da 15 millilitri e centrifugarle a 150 volte g per cinque minuti a temperatura ambiente. Scartare il surnatante e risospendere il pellet nel volume desiderato di mezzi di espansione. Contare le cellule utilizzando il metodo standard di conteggio delle cellule e sottocoltivarle per un'ulteriore espansione a una densità di semina di 10.000 cellule per centimetro quadrato in una capsula di Petri da 150 millilitri.Per tutti i test, utilizzare un monostrato confluente di celle di passaggio da P2 a P5. Quando le cellule espanse raggiungono l'80% al 90% di confluenza, dissociare le cellule usando la soluzione di tripsina-EDTA prima di pellettarle in una provetta da centrifuga da 15 millilitri a 150 volte g per cinque minuti. Quindi risospendere il pellet nel plasma di capra ad una densità di 2 milioni di cellule per 50 microlitri. Aggiungere 50 microlitri di plasma contenente le cellule su una capsula di Petri sterilizzata da 90 millimetri, seguita dall'aggiunta di cloruro di calcio ad una concentrazione finale dello 0,3% Mescolare bene per fabbricare idrogel plasmatico reticolato.Dopo aver incubato l'idrogel fabbricato a 37 gradi Celsius per 40 minuti, trasferire gli idrogel in piastre di coltura tissutale a 24 pozzetti contenenti mezzi condrogeni. Cambiare il supporto ogni tre giorni per 14 giorni. Gli idrogel coltivati in mezzi DMEM completi senza TGF-beta 1 sono considerati controlli non indotti.Dopo 14 giorni di differenziazione condrogena delle cellule in idrogel plasmatico, lavare gli idrogel tre volte con PBS per cinque minuti ciascuno e fissare i campioni in formalina tamponata neutra per tre ore. Le IFP-MSC isolate erano omogeneicamente aderenti e hanno raggiunto una morfologia allungata entro 24 ore dalla coltura in vitro. Le cellule hanno proliferato in modo efficiente dall'80% al 90% di confluenza entro sei giorni dall'espansione e hanno mostrato capacità clonogeniche, indicando efficienti capacità proliferative e di auto-rinnovamento.Quando trattate per differenziarsi in lenza adipogenica, le cellule isolate hanno prodotto goccioline lipidiche, che è stata confermata dalla colorazione Oil Red O nei giorni 14 e 21. Tali goccioline di olio non erano visibili nelle cellule senza fattori induttori adipogeni. Le cellule isolate incapsulate in idrogel plasmatico hanno mostrato la formazione di neo-tessuto bianco e lucido dopo 14 giorni nel gruppo indotto ha mostrato il potenziale condrogenico.Il gruppo non indotto aveva tessuto bianco pallido con ridotta lucentezza. Inoltre, la colorazione istologica positiva per Alcian Blue e Safranin O nel gruppo indotto ha indicato che le cellule potrebbero secernere glicosaminoglicani solfatati, uno dei componenti principali della matrice cartilaginea. Al contrario, le sezioni di idrogel dei gruppi non indotti erano negative per la colorazione con Safranina O e Alcian Blue, confermando il potenziale di differenziazione condrogena delle cellule staminali mesenchimali solo in presenza di stimoli condrogeni.Le cellule isolate indotte con mezzi osteogenici hanno mostrato colorazione positiva per fosfatasi alcalina, confermando la mineralizzazione alla fine di 14 giorni. Dopo 28 giorni di induzione osteogenica, le deposizioni calcificate sono state osservate con colorazione Alizarin Red S. I risultati hanno sottolineato il potenziale di differenziazione delle cellule indotte in linee adipogeniche, condrogeniche e osteogeniche.È essenziale trattare il campione in condizioni asettiche per evitare la contaminazione. È anche importante identificare la posizione corretta della rotula. Questa procedura apre la strada per isolare vari tipi di cellule, come condrociti articolari, fibroblasti legamentosi e cellule staminali da sinovia e liquido sinoviale, con ampie applicazioni nella medicina rigenerativa.Dopo l'isolamento delle IFP-MSC utilizzando questa tecnica, la sua efficacia è stata studiata in particolare per la rigenerazione dei tessuti muscoloscheletrici, come cartilagine, osso e legamento, utilizzando approcci senza impalcature e impalcature.

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Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on Poly(&#949;-caprolactone) Electrospun Yarns

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on PolyÃƒÅ½Ã‚Âµ-caprolactone Electrospun Yarns

Ottimizzare Allegato di cellule staminali mesenchimali umane su Poli (ε-caprolattone) elettrofilate Filati

Research into biomaterials and tissue engineering often includes cell-based in vitro investigations, which require initial knowledge of the starting cell ...

Scaffold-supported Transplantation of Islets in the Epididymal Fat Pad of Diabetic Mice

Il trapianto di isole nel supporto del grasso epididimico dei topi diabetici

Islet transplantation has been clinically proven to be effective at treating type 1 diabetes. However, the current intrahepatic transplantation strategy ...

Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells

Isolamento di cellule staminali mesenchimali da periostio alveolare umano e gli effetti della vitamina D su attività osteogenica delle cellule derivate dal periostio

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the ...

Exploring the Potential of Mesenchymal Stem Cell Sheet on The Development of Hepatocellular Carcinoma In Vivo

Exploring the Potential of Mesenchymal Stem Cell Sheet on The Development of Hepatocellular Carcinoma In Vivo

Esplorare il potenziale delle cellule staminali mesenchimali foglio sullo sviluppo di Carcinoma epatocellulare In Vivo

An in vivo animal model that mimics human cancer could have various applications that deliver significant clinical information. The currently used ...

Construction and Use of an Electrical Stimulation Chamber for Enhancing Osteogenic Differentiation in Mesenchymal Stem/Stromal Cells In Vitro

Costruzione e l'uso di una camera di stimolazione elettrica per migliorare la differenziazione osteogenica in cellule mesenchimali staminali/Stromal In Vitro

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) have been used extensively to promote bone healing in tissue engineering approaches. Electrical stimulation (EStim) ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Misurazione del potenziale d'azione ottico a singola cellula in cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Generation of Human Blood Vessel Organoids from Pluripotent Stem Cells

Generazione di organoidi dei vasi sanguigni umani da cellule staminali pluripotenti

An organoid is defined as an engineered multicellular in vitro tissue that mimics its corresponding in vivo organ such that it can be used to study ...

Creation of a Knee Joint-on-a-Chip for Modeling Joint Diseases and Testing Drugs

Creazione di un ginocchio joint-on-a-chip per la modellazione delle malattie articolari e la sperimentazione di farmaci

The high prevalence of debilitating joint diseases like osteoarthritis (OA) poses a high socioeconomic burden. Currently, the available drugs that target ...