Name: isolation, expansion, and differentiation of mesenchymal stem cells from the infrapatellar fat pad of the goat stifle joint
Uploaded: 2022-08-02T13:00:00
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SHは、IITカンプールの研究所ポスドクフェローシップおよびDST(SEED部門)からのSYST助成金(SP / YO / 618/2018)からの支援を認めています。AMは、インド工科大学カンプール校(IIT-カンプール)のフェローシップを認めています。DSKは、インドのギリーシュ・ジャンキナス議長教授職およびバイオテクノロジー学科の資金提供を認めています(BT/PR22445/MED/32/571/2016)。AM、SH、およびDSKは、IIT-KanpurのMehtaファミリー医学工学センターの寛大な支援に感謝します。

このプロトコルは、ヤギからのIFP-MSCの分離に基づいています。ヤギのIFPと血液は地元の食肉処理場から採取されました。このような組織採取は施設動物倫理委員会の範囲外であるため、倫理的承認は必要ありませんでした。
1.ヤギ膝の大腿脛関節からのIFP-MSCの分離
<ol><li>後肢の大腿骨領域と脛骨領域のそれぞれ~15 cmを含むヤギの大腿脛関節(サンプル)を収?...

本プロトコルでは、ヤギIFPからMSCを単離するための簡単で信頼性が高く、再現性のある方法が提供されています。この方法を使用して単離された細胞は、in vitro組織再生のための以前の研究で成功裏に使用されています。単離された細胞は増殖性であり、様々な成長因子に応答し、電界紡糸繊維および足場に播種したときにそれらの生物学的活性を保持することが観察された<sup class="xr...

間葉系幹細胞(MSC)は、再生医療における細胞ベースの治療の魅力的な候補です1,2。それらは、骨髄、臍帯、胎盤、歯髄、皮下脂肪組織などのさまざまな組織源から採取できます3。ただし、成人における幹細胞の利用可能性は限られており、それらの単離手順はしばしば侵襲的である(ドナー部位の罹患率をもたらす)ため、これらの課題を回避できる代替幹細胞源を有することが望ましい。
膝関節は、乳膝下脂肪パッド由来MSC、滑膜由来MSC、滑液由来MSC、靭帯線維芽細胞、関節軟骨細胞など、様々な細胞型のデポーである4,5,6。これらの細胞は、筋骨格系組織工学に基づく研究で広く探求される可能性があります。したがって、膝関節は、複数のタイプのMSCの可能で信頼できる供給源になる可能性があります。 膝関節にある脂肪デポは、膝蓋下脂肪パッド(IFP)またはホファ脂肪パッドとして知られており、MSCデポの有望で代替的な選択肢です。IFPは、膝関節鏡検査または膝関節手術中に外科的廃棄物として日常的に切除および廃棄されるため、比較的簡単にアクセスでき、臨床的に入手可能なMSCの供給源です。IFPの除去は、ドナー部位の罹患率が最小限に抑えられることと関連しており、これも魅力的な組織源となる。IFP由来のMSC(IFP-MSC)は、同様の表現型プロファイルを持ちながら、骨髄由来間葉系幹細胞(BM-MSC)6と比較してクローン形成能を高め、皮下脂肪由来幹細胞(ADSC)と比較して増殖能が優れています7。興味深いことに、滑液由来MSC(SF-MSC)と比較して、IFP-MSCは継代が遅くても増殖能力を失うことはなく、継代が遅くなっても倍増時間が長くなることはありません。これは、IFP-MSCが細胞増殖中に、増殖速度を損なうことなく、in vitro組織工学アプリケーションのために十分に多数の細胞を達成できることを示唆しています8。最近の研究では、IFP-MSCは骨髄由来MSC(BMSC)や脂肪由来MSC(ADSC)と比較して優れた軟骨分化能を有することが示唆されており、おそらく解剖学的に関節軟骨に近接しているためであり、軟骨組織工学への適合性を示しています6,7,9,10。さらに、それらは年齢に依存しない骨形成分化能も持っています11。IFP-MSCの関節内注射は、変形性関節症(OA)患者の疼痛を軽減し、膝関節機能を改善することが示されています12,13。さらに、病的状態における炎症性サイトカインの存在下でのIFP-MSCの強力な免疫抑制応答および改善された免疫調節特性も報告されています6。
IFP-MSCは、MSCの有望で代替的な供給源です。しかし、組織工学や再生医療におけるそれらの治療上の利点は比較的探求されていません。IFP-MSCに関する既存の研究では、主にヒトドナーからの細胞が利用されています。これらのうち、最近のいくつかの研究では、健康なヒトドナー(非関節炎患者、17〜60歳)からのIFP-MSCを調査していますが6,14、ほとんどの研究では、人工膝関節全置換術を受けている高齢患者(罹患患者、70〜80歳)のIFP-MSCを使用しています。年齢と疾患の両方が幹細胞の正常な機能を変化させることが知られているため(数の減少と機能電位の喪失)、これはMSCベースの研究の結果に矛盾をもたらす可能性があります7,15,16,17。それに加えて、病態生理学的状態(関節炎や肥満など)の患者からのIFP-MSCの使用は、in vitroで健康な細胞の基本的な特性を理解することも困難であり、それによってMSCベースの治療法の開発における制限因子として機能します。これらの問題を克服するためには、健康なドナーからのIFP-MSCの使用が不可欠です。健康な人間のドナーへのアクセスは困難であるため、動物モデルはより良い代替手段になる可能性があります。これに関して、IFPがマウスから単離されたいくつかの研究がある18。しかし、通常のマウスでは脂肪パッドのサイズが小さいため、複数の動物の脂肪組織が組み合わされて、精巧な実験手順を実行するのに十分な組織が得られています19。したがって、より多くの細胞の要件を満たすと同時に、動物研究における3Rの原則(精製、置換、および削減)に準拠することができる大型動物モデルが必要です20。大型動物の使用は、トランスレーショナルリサーチにおいて重要な意味を持ちます。具体的には、筋骨格組織工学において、イヌ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマなどの様々な大型動物が調査されている21。ヤギ(Capra aegagrus hircus)は、その窒息関節が人間の膝関節に最も近い解剖学的構造を持っているため、大型動物の優れた選択肢です22,23,24。ヤギの軟骨下骨梁構造と軟骨下骨の厚さはヒトと類似しており、骨に対する軟骨の割合もヒトに近いと報告されています21。さらに、ヤギは世界中で広く家畜化されており、骨格的に成熟しているときに簡単に入手できるようになりました。さらに、メンテナンスコストが低く、取り扱いが容易なため、研究にとって魅力的な動物モデルとなっています22。
本研究では、IFP-MSCを Capra aegagrus hircus (ヤギ)の窒息関節から単離するための簡単なプロトコルと、それらの増殖と分化のための in vitro 培養条件が実証されています。単離された細胞は接着性であり、MSC様形態を有し、CFU-F(コロニー形成単位-線維芽細胞)コロニーを形成し、脂肪原性、軟骨形成性、および骨形成分化能を有する。したがって、IFP-MSCは、生物医学的用途のためのMSCの代替供給源としての可能性を示しています。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#946;-glycerophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9422-10G</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin- 0.02% EDTA</td>
			<td>Hi-Media</td>
			<td>TCL049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15-mL centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>49752-10G</td>
			<td>50 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TCL021-50ml</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50-mL centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian Blue</td>
			<td>Hi-Media</td>
			<td>RM471</td>
			<td>For sufated gycosaminoglycans staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alizarin Red S</td>
			<td>S D Fine-Chem Limited</td>
			<td>26048-25G</td>
			<td>For calcium deposition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>A011</td>
			<td>2.5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic fibroblast growth factor (bFGF)</td>
			<td>Sino Biologicals</td>
			<td>10014-HNAE</td>
			<td>5 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCIP/NBT ALP Substrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B5655-5TAB</td>
			<td>For ALP staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>MB-083</td>
			<td>Long name: Bovine Serum Albumin (1.25 mg/mL )</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TCP-182</td>
			<td>70 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>REMI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin</td>
			<td>RANBAXY LAB. Limited</td>
			<td>B17407T1</td>
			<td>2.5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Violet</td>
			<td>S D Fine-Chem Limited</td>
			<td>42555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.94925.0521</td>
			<td>25 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2915</td>
			<td>1 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM LG</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D5523</td>
			<td>Long name: Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Media Low Glucose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270</td>
			<td>Long name: Fetal Bovine Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution 37%-41%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>61780805001730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indomethacin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7378</td>
			<td>100 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I9278</td>
			<td>10 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon Eclipse TS 100</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS + 1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2521-5mL</td>
			<td>Long name: insulin, transferrin, sodium selenite + linoleic-BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Proline</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TO-109-25G</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>61751605001730</td>
			<td>For lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Meck</td>
			<td>1.07018.2521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes and sterile tips (20 &#181;L, 200 &#181;L, 1000 &#181;L)</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MUSE Cell analyser</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td></td>
			<td>For cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT compound</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>4583</td>
			<td>Long name: Optimal Cutting Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red O dye</td>
			<td>S D Fine-Chem Limited</td>
			<td>54304</td>
			<td>For lipid vacuole staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>A007</td>
			<td>100 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (150 mm and 90 mm)</td>
			<td>NEST</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safranin O</td>
			<td>S D Fine-Chem Limited</td>
			<td>50240</td>
			<td>For sufated gycosaminoglycans staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3434</td>
			<td>3.4 % (w/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile scissors, forceps and scalpels</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For isolation of IFP-MSC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.94953.0521</td>
			<td>35 % (w/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF-&#946;1</td>
			<td>Sino Biologicals</td>
			<td></td>
			<td>Long name: Transforming growth factor- &#946;1 (10 ng/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture incubator 37 &#176;C, 5% CO2</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris buffer</td>
			<td>Merck</td>
			<td>61771405001730</td>
			<td>For lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>S D Fine-Chem Limited</td>
			<td>40632</td>
			<td>For lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type II collagenase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17101015</td>
			<td>1.5 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin D3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9756-1G</td>
			<td>10 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Well plates (6 -WP and 24-WP)</td>
			<td>NEST</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, expansion, and differentiation of mesenchymal stem cells from the infrapatellar fat pad of the goat stifle joint

膝関節に存在するIFPは、MSCの有望な供給源として機能します。IFPは、関節鏡手術や膝関節置換術中に日常的に切除および廃棄されるため、簡単にアクセスできる組織です。さらに、その除去は、最小限のドナー部位の罹患率に関連しています。最近の研究では、IFP-MSCは in vitro 拡張中に増殖能力を失わず、年齢に依存しない骨形成分化の可能性を有することが実証されています。IFP-MSCは、骨髄由来MSC(BMSC)や脂肪由来幹細胞(ADSC)と比較して、優れた軟骨形成分化能を有する。これらの細胞は高齢患者や罹患患者から容易に入手できるが、その有効性は限られている。したがって、健康なドナーからのIFP-MSCを使用することは、生物医学的用途におけるそれらの有効性を決定するために重要です。健康な人間のドナーへのアクセスは困難であるため、動物モデルは基本的な理解を可能にするためのより良い代替手段になる可能性があります。犬、馬、羊、山羊などの大型動物は、トランスレーショナルリサーチにおいて重要な役割を果たします。これらの中で、ヤギの窒息関節は人間の膝関節に最も近い解剖学的構造を持っているので、ヤギが好ましいモデルである可能性があります。さらに、ヤギIFPは、組織再生アプリケーションに必要なより高いMSC数を満たすことができます。さらに、低コスト、入手可能性、および動物研究の3R原則への準拠により、魅力的なモデルになっています。この研究は、IFP-MSCをヤギの窒息関節から分離するための簡単なプロトコルと、それらの増殖と分化のための in vitro 培養条件を示しています。ヤギから無菌的に単離されたIFPを洗浄し、ミンチし、酵素的に消化した。濾過及び遠心分離後、回収した菌体を培養した。これらの細胞は接着性であり、MSCs様形態を有し、顕著なクローン形成能を示した。さらに、それらは脂肪原性、軟骨形成性、および骨形成系の系統に分化し、それらの多能性を示しました。結論として、この研究は、組織工学および再生医療の応用に可能性を示すMSCの分離と拡大を示しています。

ヤギの大腿脛骨関節からのIFP-MSCの分離 ヤギの窒息関節からのIFP-MSCの分離に関連するステップを 図1に示します。膝蓋骨の内側の非関節表面に存在する脂肪パッドを取り外し、細かく刻み、酵素的に消化した。IFP-MSCは、 インビトロで 単離および培養に成功しました(図2A)。
IFP-MSCの増殖とクローン形...

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Isolation, Expansion, and Differentiation of Mesenchymal Stem Cells from the Infrapatellar Fat Pad of the Goat Stifle Joint

膝下脂肪パッド間葉系幹細胞(IFP-MSC)は、膝関節の膝蓋下脂肪パッドから容易に単離することができる。それらは in vitroでよく増殖し、CFU-Fコロニーを形成し、脂肪原性、軟骨形成性、および骨形成系統に分化します。本明細書では、IFP-MSCsをヤギ窒息関節から単離、拡大、および分化するための方法論が提供される。

ヤギ窒息関節の膝蓋下脂肪パッドからの間葉系幹細胞の単離、増殖、および分化

The IFP, present in the knee joint, serves as a promising source of MSCs. The IFP is an easily accessible tissue as it is routinely resected and discarded ...

膝蓋下脂肪パッド由来間葉系幹細胞、または要するにIFP-MSCは、比較的研究されていない幹細胞タイプです。このプロトコルは、ヤギの窒息関節からのIFP-MSCの分離を実証する、シンプルで信頼性が高く、再現性のある方法です。この技術の主な利点は、高品質のIFP-MSCを多数得ることができることです。単離されたIFP-MSCは、複数の系統に分化し、広範な再生可能性を有する。IFP-MSCは、その解剖学的位置により、変形性関節症における軟骨欠損の修復および軟骨劣化の緩和に関心を集めています。この方法は、組織工学および再生医療の分野における細胞ベースの治療に影響を及ぼします。IFP-MSCの分離、拡大、および分化の手順は、菅田ハズラ博士とアマンマハジャン氏によって実証されます。膝蓋骨下脂肪パッド間葉系幹細胞(IFP-MSC)の分離を開始するには、滅菌された収集サンプルボックスに後肢の大腿骨および脛骨領域の約15センチメートルを含むヤギの大腿骨関節を収集します。サンプルを摂氏4度で保管し、さらなる処理のために実験室に輸送します。サンプルを150ミリメートルのペトリ皿に置き、手順全体を通してサンプルを無菌的に処理し、バイオセーフティキャビネットで処理するようにしてください。抗生物質を添加したオートクレーブ滅菌PBSで十分にすすいでください。PBSを使用してサンプルを水和してください。サンプルの解剖学的領域を注意深く調べます。簡単にアクセスできるように、片手で大腿骨の端面を持ち、鋭利なハサミを使用して関節に向かって縦方向に切断することにより、両方の長骨から余分な組織を完全に取り除きます。その後、関節包周囲の組織を乱すことなく、筋肉と脂肪組織を骨から取り除きます。同様に、サンプルの脛骨端に別の切開を行い、脛骨から筋肉と脂肪組織を取り除きます。両方の長骨が完全に露出し、関節包が見えることを確認してください。次に、滑膜の両側から切開を行い、関節関節を切り開きます。新鮮な滅菌ハサミと鉗子を使用して、滑膜と膝蓋骨靭帯から膝蓋骨を切り取ります。分離した膝蓋骨をPBSを含むペトリ皿にすぐに入れます。分離した膝蓋骨から、はさみと鉗子を使用して内面に存在する脂肪パッド全体を取り除きます。別の新鮮なペトリ皿にそれを集めて、メスを使ってそれをひきます。約2〜3ミリメートルの小さな脂肪セグメントを得るために他の手術器具を含めます。スパチュラを使用してミンチ組織を50ミリリットルの遠沈管に移し、抗生物質を添加したPBSで試験管ミキサーを使用して室温で15分間3回洗浄します。酵素消化のために、ダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)で約5グラムのミンチ組織を、1ミリリットルあたり1.5ミリグラムのII型コラゲナーゼと2%FBSを含む低グルコース培地で摂氏37度で12〜16時間インキュベートします。消化された組織を注意深く吸引し、70ミクロンのセルストレーナーでろ過して、未消化の部分を取り除きます。ろ液を15ミリリットルの遠沈管で150倍gで5分間遠心分離します。細胞ペレットをDMEM低グルコースで2回洗浄する前に上清を除去した。ペレットを完全なDMEM(膨張培地とも呼ばれる)に再懸濁します。細胞を150ミリメートルのペトリ皿に播種し、塩基性線維芽細胞成長因子(BFGF)のミリリットルあたり5ナノグラム、およびミリリットルあたり50マイクログラムの2-ホスホ-L-アスコルビン酸三ナトリウム塩を添加した増殖培地で培養します。5%二酸化炭素インキュベーターで摂氏37度で細胞をインキュベートし、細胞を接着して増殖させます。細胞の付着と成長を毎日監視します。IFP-MSCの適切なメンテナンスと拡張のために、3日ごとにメディアを交換してください。培地を交換しながら、ミリリットルBFGFあたり5ナノグラムと2-ホスホ-L-アスコルビン酸三ナトリウム塩のミリメートルあたり50マイクログラムをペトリ皿に直接加えます。細胞が80%から90%コンフルエントになったら、ペトリ皿から増殖培地を除去し、1X PBSで細胞を洗浄して継代培養します。次に、4ミリリットルの0.25%トリプシン-EDTAを皿に加え、5%二酸化炭素インキュベーター内で摂氏37度で細胞をインキュベートします。4分後、プレートの側面を軽くたたいてセルを取り除きます。顕微鏡下ですべての細胞の完全な剥離を確認します。確認したら、等量の膨張培地を加えてトリプシンを中和します。ピペットを使用して、これらの解離した細胞を新しい15ミリリットルのポリプロピレンチューブに集め、室温で5分間150倍gで遠心分離します。上清を廃棄し、ペレットを所望の容量の膨張培地に再懸濁する。標準的な細胞計数法を用いて細胞を計数し、150ミリリットルのペトリ皿に1平方センチメートル当たり10, 000細胞を播種密度でさらに増殖させるために継代培養する。全てのアッセイについて、継代数P2〜P5の細胞のコンフルエント単層を使用する。増殖した細胞が80%から90%のコンフルエントに達したら、トリプシン-EDTA溶液を使用して細胞を解離してから、15ミリリットルの遠沈管で150倍gで5分間ペレット化します。次に、ペレットを50マイクロリットルあたり200万細胞の密度でヤギ血漿中に再懸濁します。細胞を含む50マイクロリットルの血漿を滅菌した90ミリメートルのペトリ皿に加え、続いて最終濃度0.3%の塩化カルシウムを加えてよく混合して架橋血漿ヒドロゲルを作製する。作製したヒドロゲルを摂氏37度で40分間インキュベートした後、軟骨形成培地を含む24穴組織培養プレートにヒドロゲルを移します。メディアを 3 日ごとに 14 日間交換します。TGF−β1を含まない完全なDMEM培地で培養されたヒドロゲルは、非誘導対照とみなされる。血漿ヒドロゲル中で細胞の軟骨形成分化の14日後、ヒドロゲルをPBSでそれぞれ5分間3回洗浄し、サンプルを中性緩衝ホルマリンに3時間固定します。単離されたIFP-MSCは均質に接着し、in vitro培養から24時間以内に細長い形態を達成しました。細胞は増殖から6日以内に80%から90%のコンフルエントに効率的に増殖し、クローン生成能力を示し、効率的な増殖能力と自己複製能力を示しました。脂肪生成系統に分化するように処理した場合、単離された細胞は脂肪滴を産生し、これは14日目および21日目にOil Red O染色によって確認された。このような油滴は、脂肪生成誘導因子のない細胞では見えなかった。血漿ヒドロゲルに封入された単離された細胞は、軟骨形成能を示した誘導群において14日後に白色および光沢のある新組織の形成を示した。非誘導群は、光沢度が低下した淡い白色組織を有していた。さらに、誘導群のアルシアンブルーとサフラニンOの陽性組織学的染色は、細胞が軟骨基質の主要成分の1つである硫酸化グリコサミノグリカンを分泌できることを示しました。対照的に、誘導されていないグループのヒドロゲル切片は、サフラニンOおよびアルシアンブルー染色に対して陰性であり、軟骨形成刺激の存在下でのみ間葉系幹細胞の軟骨形成分化能が確認された。骨形成培地で誘導された単離細胞は、アルカリホスファターゼに対して陽性染色を示し、14日の終わりに石灰化を確認した。骨形成誘導の28日後、石灰化沈着物をアリザリンレッドS染色で観察した。結果は、誘導された細胞が脂肪原性、軟骨形成性、および骨形成系統に分化する可能性を強調しました。汚染を避けるために、無菌条件下でサンプルを処理することが不可欠です。膝蓋骨の正しい位置を特定することも重要です。関節軟骨細胞、靭帯線維芽細胞、幹細胞など、滑膜や滑液から様々な細胞型を分離する道を開き、再生医療に幅広く応用できます。この手法を用いてIFP-MSCを単離した後、足場および足場のないアプローチを使用して、軟骨、骨、靭帯などの筋骨格組織の再生に対してその有効性を特に調査しました。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

異なる系統にヒト胚性幹細胞（hESCの）の伝播との差別化のための3Dプラットフォームとしてのアルギン酸マイクロカプセル

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

開発、展開、および<em生体内で&gt;</em&gt;ヒト胚性幹細胞（ヒトES細胞）からヒトNK細胞のモニタリングとや人工多能性幹細胞（性IPSC）

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on Poly(&#949;-caprolactone) Electrospun Yarns

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on PolyÃƒÅ½Ã‚Âµ-caprolactone Electrospun Yarns

ポリ（εカプロラクトン）エレクトロ糸にヒト間葉系幹細胞の添付ファイルの最適化

Research into biomaterials and tissue engineering often includes cell-based in vitro investigations, which require initial knowledge of the starting cell ...

Scaffold-supported Transplantation of Islets in the Epididymal Fat Pad of Diabetic Mice

糖尿病マウスの精巣上体脂肪細胞における膵島支持骨格移植

Islet transplantation has been clinically proven to be effective at treating type 1 diabetes. However, the current intrahepatic transplantation strategy ...

Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells

人間歯槽骨膜から骨膜由来細胞の骨形成促進活性に及ぼすビタミン D の間葉系幹細胞の分離

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the ...

Exploring the Potential of Mesenchymal Stem Cell Sheet on The Development of Hepatocellular Carcinoma In Vivo

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生体内で肝細胞癌の開発の間葉系幹細胞シートの可能性を探る

An in vivo animal model that mimics human cancer could have various applications that deliver significant clinical information. The currently used ...

Construction and Use of an Electrical Stimulation Chamber for Enhancing Osteogenic Differentiation in Mesenchymal Stem/Stromal Cells In Vitro

建設と質間葉系幹細胞の骨分化を強化するため電気刺激室の使用

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) have been used extensively to promote bone healing in tissue engineering approaches. Electrical stimulation (EStim) ...

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ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞における単細胞光学作用電位測定

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Creation of a Knee Joint-on-a-Chip for Modeling Joint Diseases and Testing Drugs

関節疾患のモデリングと薬剤検査のための膝関節チップの作成

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