Name: isolation, expansion, and differentiation of mesenchymal stem cells from the infrapatellar fat pad of the goat stifle joint
Uploaded: 2022-08-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Expansion, and Differentiation of Mesenchymal Stem Cells from the Infrapatellar Fat Pad of the Goat Stifle Joint at JoVE.com

SH anerkjenner støtte fra instituttets postdoktorstipend av IIT Kanpur og SYST-stipend fra DST (SEED Division) (SP / YO / 618/2018). AM anerkjenner Indian Institute of Technology-Kanpur (IIT-Kanpur) for et instituttstipend. DSK anerkjenner Gireesh Jankinath Chair Professorship og Institutt for bioteknologi, India, for finansiering (BT / PR22445 / MED / 32/571/2016). AM, SH og DSK takker Mehta Family Centre for Engineering in Medicine ved IIT-Kanpur for deres sjenerøse støtte.

Protokollen er basert på isolering av IFP-MSCs fra geiter. Geit IFP og blod ble samlet inn fra et lokalt slakteri. Siden slike vevssamlinger er utenfor ansvarsområdet til en institusjonell dyreetisk komité, var det ikke nødvendig med etisk godkjenning.
1. Isolering av IFP-MSCs fra femorotibial ledd av geit kne
<ol><li>Samle geit femorotibial ledd (prøve) som omfatter ~ 15 cm hver av lårbenet og tibial regioner av bakre lemmer. Plasser prøven umiddelbart i en sterilise...

I denne protokollen er det gitt en enkel, pålitelig og reproduserbar metode for isolering av MSCs fra geit IFP. Celler isolert ved hjelp av denne metoden har blitt brukt med hell i våre tidligere studier for in vitro vevregenerering. Det ble observert at de isolerte cellene var proliferative, reagerte på ulike vekstfaktorer, og beholdt sin biologiske aktivitet når de ble sådd på elektrospunfibre og stillaser25,26. Videre ble det observert at et sto...

Mesenkymale stamceller (MSCs) er en attraktiv kandidat for cellebaserte terapier i regenerativ medisin 1,2. De kan høstes fra en rekke vevskilder som benmarg, navlestreng, morkake, tannmasse og subkutant fettvev3. Men da tilgjengeligheten av stamceller hos voksne er begrenset og deres isolasjonsprosedyre ofte er invasiv (noe som resulterer i morbiditet på donorstedet), er det ønskelig å ha en alternativ stamcellekilde som kan omgå disse utfordringene.
Kneleddet er et depot av forskjellige celletyper, for eksempel infrapatellar fettpute-avledede MSCer, synovialmembran-avledede MSCer, synovialvæskeavledede MSCer, ligamentfibroblaster, leddkondrocytter, etc 4,5,6. Disse cellene har potensial til å bli mye utforsket i muskuloskeletale vev engineering-basert forskning. Derfor kan kneleddet være en mulig og pålitelig kilde til flere typer MSCs. Fettdepot som ligger i kneleddet, kjent som infrapatellar fettpute (IFP) eller Hoffas fettpute, er et lovende og alternativt valg av MSC depot. IFP er en relativt lett tilgjengelig og klinisk oppnåelig kilde til MSCs, da den rutinemessig resekteres og kastes som kirurgisk avfall under knelektroskopi eller åpen knekirurgi. Fjerning av IFP er forbundet med minimal donor-site morbiditet, noe som også gjør det til en attraktiv vevskilde. Selv om de har en lignende fenotypisk profil, har MSCer fra IFP (IFP-MSCs) forbedret klonogent potensial sammenlignet med benmargsavledede mesenkymale stamceller (BM-MSCs)6 og bedre proliferativ kapasitet sammenlignet med subkutane fettavledede stamceller (ADSC)7. Interessant nok, sammenlignet med synovialvæskeavledede MSCer (SF-MSCs), mister IFP-MSCs ikke sin proliferative kapasitet ved sene passasjer, og doblingstiden øker heller ikke ved sene passasjer. Dette antyder at IFP-MSC-er under celleutvidelse kan oppnå et tilstrekkelig stort antall celler for in vitro vevstekniske applikasjoner uten at det går ut over spredningshastigheten8. Nylige studier har også antydet at IFP-MSCs har overlegen kondrogen differensieringspotensial sammenlignet med benmargsavledede MSCs (BMSCs) og fettavledede MSCs (ADSCs), sannsynligvis på grunn av deres anatomiske nærhet til leddbrusk, noe som indikerer deres egnethet for bruskvevsteknikk 6,7,9,10. Videre har de også aldersuavhengig osteogen differensieringspotensial11. Intraartikulær injeksjon av IFP-MSCs har vist seg å redusere smerte og forbedre kneleddfunksjoner hos pasienter med slitasjegikt (OA) 12,13. Videre erdet også rapportert sterke immunsuppressive responser og forbedrede immunmodulerende egenskaper til IFP-MSCs i nærvær av inflammatoriske cytokiner under patologiske forhold 6.
IFP-MSCs er en lovende og alternativ kilde til MSCs; Imidlertid er deres terapeutiske fordel i vevsteknikk og regenerativ medisin relativt mindre utforsket. De eksisterende studiene på IFP-MSCs har i stor grad benyttet celler fra humane givere. Blant disse har noen få nyere studier undersøkt IFP-MSCs fra friske humane donorer (ikke-artrittiske pasienter, i alderen 17-60 år) 6,14, mens de fleste studiene har brukt IFP-MSCs fra eldre pasienter som gjennomgår total kneprotesekirurgi (syke pasienter, alder 70-80 år). Siden både alder og sykdom er kjent for å endre stamcellers normale funksjon (redusert antall og tap av funksjonelt potensial), kan dette potensielt føre til uoverensstemmelser i utfallet av de MSC-baserte studiene 7,15,16,17. I tillegg til dette utgjør bruken av IFP-MSCs fra pasienter med patofysiologiske tilstander (f.eks. leddgikt og fedme) også vanskeligheter med å forstå de grunnleggende egenskapene til friske celler in vitro, og fungerer dermed som en begrensende faktor i utviklingen av MSCs-baserte terapier. For å overvinne disse problemene er bruk av IFP-MSCs fra friske givere avgjørende. Ettersom tilgangen til en sunn menneskelig donor er utfordrende, kan dyremodeller være et bedre alternativ. I denne forbindelse er det noen få studier der IFP har blitt isolert fra mus18. På grunn av den lille størrelsen på fettputen i normale mus, har fettvev fra flere dyr blitt kombinert for å få nok vev til å utføre forseggjorte eksperimentelle prosedyrer19. Derfor er det behov for en stor dyremodell, som kan oppfylle kravet til det høyere antall celler og samtidig overholde 3R-prinsippene (forfine, erstatte og redusere) i dyreforsøk20. Bruken av store dyr har betydelige implikasjoner i translasjonsforskning. Spesielt i muskel- og skjelettvevsteknikk har en rekke store dyr som hunder, griser, sauer, geiter og hester blitt undersøkt21. Geit (Capra aegagrus hircus) er et utmerket valg av stort dyr siden kvelerleddet har den nærmeste anatomien til det menneskelige kneleddet22,23,24. Den subchondrale beintrabekulære strukturen og subchondral beintykkelse av geiter ligner på mennesker, og andelen av brusk til bein er også rapportert å være nær mennesker21. I tillegg har geiter blitt mye tammet over hele verden, noe som gjør dem lett tilgjengelige når de er skjelettmodne. Videre har lave vedlikeholdskostnader og enkel håndtering gjort dem til en attraktiv dyremodell for forskning22.
I denne studien er det vist en enkel protokoll for isolering av IFP-MSCs fra kvelerleddet til Capra aegagrus hircus (geit) og in vitro-kulturbetingelser for utvidelse og differensiering. De isolerte cellene er vedheftige, har MSC-lignende morfologi, danner CFU-F (kolonidannende enhetsfibroblast) kolonier, og har adipogent, kondrogent og osteogent differensieringspotensial. Derfor viser IFP-MSCs potensial som en alternativ kilde til MSCs for biomedisinske applikasjoner.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#946;-glycerophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9422-10G</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin- 0.02% EDTA</td>
			<td>Hi-Media</td>
			<td>TCL049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15-mL centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>49752-10G</td>
			<td>50 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TCL021-50ml</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50-mL centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian Blue</td>
			<td>Hi-Media</td>
			<td>RM471</td>
			<td>For sufated gycosaminoglycans staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alizarin Red S</td>
			<td>S D Fine-Chem Limited</td>
			<td>26048-25G</td>
			<td>For calcium deposition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>A011</td>
			<td>2.5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic fibroblast growth factor (bFGF)</td>
			<td>Sino Biologicals</td>
			<td>10014-HNAE</td>
			<td>5 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCIP/NBT ALP Substrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B5655-5TAB</td>
			<td>For ALP staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>MB-083</td>
			<td>Long name: Bovine Serum Albumin (1.25 mg/mL )</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TCP-182</td>
			<td>70 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>REMI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin</td>
			<td>RANBAXY LAB. Limited</td>
			<td>B17407T1</td>
			<td>2.5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Violet</td>
			<td>S D Fine-Chem Limited</td>
			<td>42555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.94925.0521</td>
			<td>25 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2915</td>
			<td>1 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM LG</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D5523</td>
			<td>Long name: Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Media Low Glucose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270</td>
			<td>Long name: Fetal Bovine Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution 37%-41%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>61780805001730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indomethacin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7378</td>
			<td>100 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I9278</td>
			<td>10 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon Eclipse TS 100</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS + 1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2521-5mL</td>
			<td>Long name: insulin, transferrin, sodium selenite + linoleic-BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Proline</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TO-109-25G</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>61751605001730</td>
			<td>For lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Meck</td>
			<td>1.07018.2521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes and sterile tips (20 &#181;L, 200 &#181;L, 1000 &#181;L)</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MUSE Cell analyser</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td></td>
			<td>For cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT compound</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>4583</td>
			<td>Long name: Optimal Cutting Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red O dye</td>
			<td>S D Fine-Chem Limited</td>
			<td>54304</td>
			<td>For lipid vacuole staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>A007</td>
			<td>100 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (150 mm and 90 mm)</td>
			<td>NEST</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safranin O</td>
			<td>S D Fine-Chem Limited</td>
			<td>50240</td>
			<td>For sufated gycosaminoglycans staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3434</td>
			<td>3.4 % (w/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile scissors, forceps and scalpels</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For isolation of IFP-MSC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.94953.0521</td>
			<td>35 % (w/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF-&#946;1</td>
			<td>Sino Biologicals</td>
			<td></td>
			<td>Long name: Transforming growth factor- &#946;1 (10 ng/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture incubator 37 &#176;C, 5% CO2</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris buffer</td>
			<td>Merck</td>
			<td>61771405001730</td>
			<td>For lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>S D Fine-Chem Limited</td>
			<td>40632</td>
			<td>For lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type II collagenase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17101015</td>
			<td>1.5 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin D3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9756-1G</td>
			<td>10 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Well plates (6 -WP and 24-WP)</td>
			<td>NEST</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, expansion, and differentiation of mesenchymal stem cells from the infrapatellar fat pad of the goat stifle joint

IFP, som finnes i kneleddet, fungerer som en lovende kilde til MSCs. IFP er et lett tilgjengelig vev som det rutinemessig resekteres og kastes under artroskopiske prosedyrer og kneproteseoperasjoner. I tillegg er fjerningen forbundet med minimal morbiditet på donorstedet. Nylige studier har vist at IFP-MSCs ikke mister sin proliferasjonskapasitet under in vitro-ekspansjon og har aldersuavhengig osteogen differensieringspotensial. IFP-MSCs har overlegent kondrogent differensieringspotensial sammenlignet med benmargsavledede MSCs (BMSCs) og fettavledede stamceller (ADSC). Selv om disse cellene er lett oppnåelige fra eldre og syke pasienter, er deres effektivitet begrenset. Derfor er bruk av IFP-MSCs fra friske givere viktig for å bestemme effekten i biomedisinske applikasjoner. Ettersom tilgang til en sunn menneskelig donor er utfordrende, kan dyremodeller være et bedre alternativ for å muliggjøre grunnleggende forståelse. Store dyr som hunder, hester, sauer og geiter spiller en avgjørende rolle i translasjonsforskning. Blant disse kan geiten være en foretrukket modell siden geitens kvelerledd har den nærmeste anatomien til det menneskelige kneleddet. Videre kan geit-IFP oppfylle de høyere MSC-tallene som trengs for vevregenereringsapplikasjoner. Videre gjør lave kostnader, tilgjengelighet og overholdelse av 3R-prinsippene for dyreforsøk dem til en attraktiv modell. Denne studien demonstrerer en enkel protokoll for å isolere IFP-MSCs fra kvelningsleddet til geiter og in vitro-kulturforhold for utvidelse og differensiering. Den aseptisk isolerte IFP fra geiten ble vasket, hakket og fordøyd enzymatisk. Etter filtrering og sentrifugering ble de oppsamlede cellene dyrket. Disse cellene var vedvarende, hadde MSCs-lignende morfologi og demonstrerte bemerkelsesverdig klonogen evne. Videre differensierte de seg i adipogene, kondrogene og osteogene linjer, og demonstrerte deres multipotens. Avslutningsvis demonstrerer studien isolering og utvidelse av MSCs, som viser potensial i vevsteknikk og regenerative medisinapplikasjoner.

Isolering av IFP-MSCs fra femorotibial ledd av geit Trinnene som er involvert i isoleringen av IFP-MSCs fra kvelningsleddet til en geit, er avbildet i figur 1. Fettputen som var tilstede i patellens indre, ikke-artikulerende overflate, ble fjernet, hakket og enzymatisk fordøyd. IFP-MSCene ble vellykket isolert og dyrket in vitro (figur 2A).
Utvidelse og klonogen evne til IFP-MSCs De is...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Expansion, and Differentiation of Mesenchymal Stem Cells from the Infrapatellar Fat Pad of the Goat Stifle Joint at JoVE.com

Isolation, Expansion, and Differentiation of Mesenchymal Stem Cells from the Infrapatellar Fat Pad of the Goat Stifle Joint

Infrapatellar fettpute mesenkymale stamceller (IFP-MSCs) kan enkelt isoleres fra kneleddets infrapatellar fettpute. De sprer seg godt in vitro, danner CFU-F-kolonier og skiller seg ut i adipogene, kondrogene og osteogene linjer. Her er metodikken for isolering, utvidelse og differensiering av IFP-MSCs fra geitkvelerfeste gitt.

Isolering, utvidelse og differensiering av mesenkymale stamceller fra Infrapatellar Fat Pad of the Goat Stifle Joint

The IFP, present in the knee joint, serves as a promising source of MSCs. The IFP is an easily accessible tissue as it is routinely resected and discarded ...

Infrapatellar Fat Pad-avledet Mesenchymal Stem Cells, eller kort sagt, IFP-MSCs, er en relativt mindre studert stamcelletype. Denne protokollen er en enkel, pålitelig og reproduserbar metode som demonstrerer isoleringen av IFP-MSCs fra geitefeste. Den største fordelen med teknikken er at et stort antall IFP-MSC-er av høy kvalitet kan oppnås.Isolerte IFP-MSC-er kan differensieres i flere linjer og har et omfattende regenerativt potensial. På grunn av deres anatomiske plassering har IFP-MSCs fått interesse for å reparere bruskdefekter og lindre brusknedbrytning ved slitasjegikt. Metoden har implikasjoner for cellebasert terapi innen vevsteknikk og regenerativ medisin.Prosedyren for isolering, utvidelse og differensiering av IFP-MSCs vil bli demonstrert av Dr.Sugata Hazra og Mr.Aman Mahajan. For å begynne isoleringen av Infrapatellar Fat Pad Mesenchymal Stem Cells, eller IFP-MSCs, samle geitfemorotibiale ledd som omfatter rundt 15 centimeter av lårbenet og tibialområdene i bakre lemmer i en sterilisert innsamlingsprøveboks. Oppbevar prøven ved fire grader Celsius for transport til laboratoriet for videre behandling.Plasser prøven på en 150 millimeter petriskål og sørg for å behandle prøven aseptisk og et biosikkerhetsskap gjennom hele prosedyren. Skyll det grundig med autoklaveres PBS supplert med antibiotika. Hold prøven hydrert ved hjelp av PBS.Undersøk nøye de anatomiske områdene i prøven. For enkel tilgang, fjern det ekstra vevet fra begge de lange beinene helt ved å holde endeflaten av lårbenet med en hånd og kutte det i lengderetningen mot leddet ved hjelp av skarp saks. Deretter, uten å forstyrre vevet rundt leddkapselen, fjern musklene og fettvevet fra beinet.På samme måte gjør du et nytt snitt i tibialenden av prøven og fjerner musklene og fettvevet fra tibialbenet. Sørg for at begge de lange beinene er helt eksponert og at leddkapselen er synlig. Deretter gjør du et snitt fra hver side av synovialmembranen for å kutte opp leddleddet.Klipp patellaen fri fra synovialmembranen og patellarbåndene ved hjelp av fersk sterilisert saks og tang. Legg umiddelbart den separerte patellaen i en petriskål som inneholder PBS. Fra den separerte patellaen fjerner du hele fettputen som er tilstede på den indre overflaten ved hjelp av saks og tang.Samle den i en annen fersk petriskål, og hakk den med en skalpell. Inkluder andre kirurgiske verktøy for å oppnå de små fettsegmentene på rundt to til tre millimeter. Bruk en slikkepott til å overføre hakket vev til et 50 milliliter sentrifugerør og vask det tre ganger med PBS supplert med antibiotika i 15 minutter ved romtemperatur ved hjelp av en reagensrørblander.For enzymatisk fordøyelse, inkuber rundt fem gram av hakket vev i Dulbeccos Modified Eagle Media, eller DMEM, lavglukosemedier som inneholder 1,5 milligram per milliliter type II kollagenase og 2% FBS ved 37 grader Celsius i 12 til 16 timer. Aspirer forsiktig det fordøyede vevet og filtrer det gjennom en 70 mikron cellesil for å fjerne ufordøyd del. Sentrifuger filtratet i et 15 milliliter sentrifugerør ved 150 ganger g i fem minutter.Fjern supernatanten før du vasker cellepelleten med DMEM lavglukose to ganger. Suspendere pelleten på nytt i komplett DMEM, også kjent som ekspansjonsmedier. Frø cellene på en 150 millimeter petriskål og dyrk dem i ekspansjonsmediet supplert med fem nanogram per milliliter Basic Fibroblast Growth Factor, eller BFGF, og 50 mikrogram per milliliter 2-fosfo-L-askorbinsyre trinatriumsalt.Inkuber cellene ved 37 grader Celsius i en 5% karbondioksidinkubator for å la cellene feste seg og spre seg. Overvåk vedlegget og veksten av cellene daglig. For riktig vedlikehold og utvidelse av IFP-MSC-ene, bytt media hver tredje dag.Mens du endrer media, tilsett friske fem nanogram per milliliter BFGF og 50 mikrogram per millimeter 2-fosfo-L-askorbinsyre trinatriumsalt direkte til petriskålen. Når cellene blir 80% til 90% sammenflytende, subkultur dem ved å fjerne ekspansjonsmediet fra petriskålen og vaske cellene med 1X PBS. Tilsett deretter fire milliliter 0,25% Trypsin-EDTA til parabolen og inkuber cellene ved 37 grader Celsius i en 5% karbondioksidinkubator.Etter fire minutter, trykk på platen på siden for å løsne cellene. Bekreft fullstendig løsrivelse av alle cellene under et mikroskop. Når det er bekreftet, legg til et likt volum av ekspansjonsmedier for å nøytralisere trypsinet.Bruk en pipette til å samle disse dissosierte cellene i et friskt 15 milliliter polypropylenrør og sentrifuger dem ved 150 ganger g i fem minutter ved romtemperatur. Kast supernatanten og resuspend pelleten i ønsket volum av ekspansjonsmedier. Tell cellene ved hjelp av standard celletellingsmetode og subkultur dem for videre ekspansjon ved en sådensitet på 10.000 celler per kvadratcentimeter i en 150 milliliter petriskål.For alle analysene, bruk et sammenflytende monolag av celler med passasjenummer P2 til P5. Når de utvidede cellene når 80% til 90% sammenheng, dissosierer cellene ved hjelp av Trypsin-EDTA-løsning før du pelleterer dem ned i et 15 milliliter sentrifugerrør ved 150 ganger g i fem minutter. Deretter resuspenderes pelleten i geitplasma ved en tetthet på 2 millioner celler per 50 mikroliter. Tilsett 50 mikroliter plasma som inneholder cellene på en sterilisert 90 millimeter petriskål, etterfulgt av tilsetning av kalsiumklorid ved en endelig konsentrasjon på 0,3% Bland godt for å fremstille tverrbundet plasmahydrogel.Etter inkubering av den fremstilte hydrogelen ved 37 grader Celsius i 40 minutter, overfør hydrogelene til 24-brønns vevskulturplater som inneholder kondrogene medier. Bytt media hver tredje dag i 14 dager. Hydrogelene som dyrkes i komplette DMEM-medier uten TGF-beta 1, betraktes som ikke-induserte kontroller.Etter 14 dager med kondrogen differensiering av celler i plasmahydrogel, vask hydrogelene tre ganger med PBS i fem minutter hver, og fest prøvene i nøytral bufret formalin i tre timer. Isolerte IFP-MSCer var homogent adherente og oppnådde langstrakt morfologi innen 24 timer etter in vitro-dyrkning. Cellene spredte effektivt 80% til 90% sammenløp innen seks dager etter utvidelse og viste klonogen kapasitet, noe som indikerer effektive proliferative og selvfornyelsesevner.Ved behandling for å differensiere til adipogen avstamning produserte de isolerte cellene lipiddråper, som ble bekreftet av oljerød O-farging på dag 14 og 21. Slike oljedråper var ikke synlige i cellene uten adipogene induserende faktorer. De isolerte cellene innkapslet i plasmahydrogel viste dannelsen av hvitt og blankt neovev etter 14 dager i den induserte gruppen viste det kondrogene potensialet.Den ikke-induserte gruppen hadde blekt hvitt vev med redusert glans. I tillegg indikerte positiv histologisk farging for Alcian Blue og Safranin O i den induserte gruppen at cellene kunne utskille sulfaterte glykosaminoglykaner, en av hovedkomponentene i bruskmatrisen. I motsetning til dette var hydrogelseksjonene fra de ikke-induserte gruppene negative for Safranin O og Alcian Blue-farging, noe som bekrefter det kondrogene differensieringspotensialet til de mesenkymale stamcellene bare i nærvær av kondrogene stimuli.De isolerte cellene indusert med osteogene medier viste positiv farging for alkalisk fosfatase, som bekreftet mineralisering ved slutten av 14 dager. Etter 28 dager med osteogen induksjon ble de forkalkede avsetningene observert med Alizarin Red S-farging. Resultatene understreket differensieringspotensialet til induserte celler i adipogene, kondrogene og osteogene linjer.Det er viktig å behandle prøven under aseptiske forhold for å unngå forurensning. Det er også viktig å identifisere riktig plassering av patellaen. Denne prosedyren åpner veien for å isolere forskjellige celletyper, for eksempel leddkondrocytter, ligamentfibroblaster og stamceller fra synovium og synovialvæske, som har brede anvendelser i regenerativ medisin.Etter isolering av IFP-MSCs ved hjelp av denne teknikken, ble effektiviteten spesielt undersøkt for regenerering av muskuloskeletale vev, som brusk, bein og ligament ved hjelp av stillas og stillasfrie tilnærminger.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

Alginat Microcapsule som en 3D-plattform for Formering og Differensiering av humane embryonale stamceller (hESC) til ulike linjene

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

Utvikling, utvidelse, og<em&gt; In vivo</em&gt; Overvåking of Human NK-celler fra humane embryonale stamceller (hESCs) og og Induced pluripotent stamceller (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on Poly(&#949;-caprolactone) Electrospun Yarns

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on PolyÃƒÅ½Ã‚Âµ-caprolactone Electrospun Yarns

Optimalisere Vedlegg of Human stamceller på Poly (ε-kaprolakton) elektrospunnede Garn

Research into biomaterials and tissue engineering often includes cell-based in vitro investigations, which require initial knowledge of the starting cell ...

Scaffold-supported Transplantation of Islets in the Epididymal Fat Pad of Diabetic Mice

Stillasstøttet transplantasjon av øyer i epididymisk fettpute av diabetiske mus

Islet transplantation has been clinically proven to be effective at treating type 1 diabetes. However, the current intrahepatic transplantation strategy ...

Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells

Isolering av Mesenchymal stamceller fra menneskelige Alveolar Periosteum og effekter av Vitamin D på Osteogenic aktivitet i Periosteum-avledet celler

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the ...

Exploring the Potential of Mesenchymal Stem Cell Sheet on The Development of Hepatocellular Carcinoma In Vivo

Exploring the Potential of Mesenchymal Stem Cell Sheet on The Development of Hepatocellular Carcinoma In Vivo

Utforske potensialet av Mesenchymal stamceller ark på utvikling av leverkreft i Vivo

An in vivo animal model that mimics human cancer could have various applications that deliver significant clinical information. The currently used ...

Construction and Use of an Electrical Stimulation Chamber for Enhancing Osteogenic Differentiation in Mesenchymal Stem/Stromal Cells In Vitro

Bygging og bruk av en elektrisk stimulering kammer for å styrke Osteogenic differensiering i Mesenchymal Stem/Stromal celler i Vitro

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) have been used extensively to promote bone healing in tissue engineering approaches. Electrical stimulation (EStim) ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Enkeltcellet optisk virkningspotensial måling i humane induserte pluripotente stamcelleavledede kardiomyocytter

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Generation of Human Blood Vessel Organoids from Pluripotent Stem Cells

Generering av humane blodkarorganoider fra pluripotente stamceller

An organoid is defined as an engineered multicellular in vitro tissue that mimics its corresponding in vivo organ such that it can be used to study ...

Creation of a Knee Joint-on-a-Chip for Modeling Joint Diseases and Testing Drugs

Opprettelse av et kneledd på en brikke for modellering av leddsykdommer og testing av medisiner

The high prevalence of debilitating joint diseases like osteoarthritis (OA) poses a high socioeconomic burden. Currently, the available drugs that target ...