Name: isolation, expansion, and differentiation of mesenchymal stem cells from the infrapatellar fat pad of the goat stifle joint
Uploaded: 2022-08-02T13:00:00
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A SH reconhece o apoio da Bolsa de Pós-Doutorado do Instituto do IIT Kanpur e a bolsa SYST da DST (Divisão SEED) (SP/YO/618/2018). A AM reconhece o Instituto Indiano de Tecnologia-Kanpur (IIT-Kanpur) por uma bolsa do Instituto. A DSK reconhece a cátedra Gireesh Jankinath e o Departamento de Biotecnologia, Índia, para financiamento (BT/PR22445/MED/32/571/2016). AM, SH e DSK agradecem ao Mehta Family Centre for Engineering in Medicine no IIT-Kanpur por seu generoso apoio.

O protocolo baseia-se no isolamento de IFP-MSCs de cabras. IFP de cabra e sangue foram coletados de um matadouro local. Uma vez que tais coleções de tecidos estão fora da alçada de um Comitê Institucional de Ética Animal, a aprovação ética não era necessária.
1. Isolamento de IFP-MSCs da articulação femorotibial do joelho caprino
<ol><li>Coletar articulação femorotibial caprina (amostra) abrangendo ~15 cm cada uma das regiões femoral e tibial dos membros post...

No presente protocolo, um método simples, confiável e reprodutível para o isolamento de CTMs do IFP caprino foi fornecido. Células isoladas usando este método foram usadas com sucesso em nossos estudos anteriores para regeneração tecidual in vitro. Observou-se que as células isoladas eram proliferativas, respondiam a diversos fatores de crescimento e mantinham sua atividade biológica quando semeadas em fibras eletrofiadas e andaimes25,26. Além ...

As células-tronco mesenquimais (CTMs) são um candidato atraente para terapias baseadas em células em medicina regenerativa 1,2. Eles podem ser colhidos de uma variedade de fontes de tecido, como medula óssea, cordão umbilical, placenta, polpa dentária e tecido adiposo subcutâneo3. No entanto, como a disponibilidade de células-tronco em adultos é limitada e seu procedimento de isolamento é frequentemente invasivo (resultando em morbidade no local doador), é desejável ter uma fonte alternativa de células-tronco que possa contornar esses desafios.
A articulação do joelho é um depósito de vários tipos de células, como CTMs derivadas de almofadas de gordura infrapatelar, MSCs derivadas de membrana sinovial, MSCs derivadas de líquido sinovial, fibroblastos ligamentares, condrócitos articulares, etc 4,5,6. Essas células têm o potencial de serem amplamente exploradas em pesquisas baseadas em engenharia de tecidos musculoesqueléticos. Portanto, a articulação do joelho pode ser uma fonte possível e confiável de vários tipos de MSCs. O depósito adiposo localizado na articulação do joelho, conhecido como almofada de gordura infrapatelar (IFP) ou almofada de gordura de Hoffa, é uma escolha promissora e alternativa do depósito de MSC. O IFP é uma fonte de CTMs relativamente acessível e clinicamente obtida, pois é rotineiramente ressecado e descartado como resíduo cirúrgico durante a artroscopia do joelho ou a cirurgia do joelho aberto. A remoção do IFP está associada a uma morbidade mínima do local doador, o que também o torna uma fonte de tecido atraente. Apesar de apresentarem um perfil fenotípico semelhante, as CTMs de IFP (IFP-MSCs) têm maior potencial clonogênico quando comparadas com células-tronco mesenquimais derivadas da medula óssea (BM-MSCs)6 e melhor capacidade proliferativa em comparação com células-tronco derivadas de tecido adiposo subcutâneo (ADSCs)7. Curiosamente, em comparação com as MSCs derivadas do líquido sinovial (SF-MSCs), as IFP-MSCs não perdem sua capacidade proliferativa em passagens tardias, nem o tempo de duplicação aumenta em passagens tardias. Isso sugere que, durante a expansão celular, as IFP-MSCs podem alcançar um número suficientemente grande de células para aplicações de engenharia de tecidos in vitro sem comprometer sua taxa de proliferação8. Estudos recentes também têm sugerido que as IFP-MSCs possuem potencial de diferenciação condrogênica superior em comparação com as MSCs derivadas da medula óssea (BMSCs) e as MSCs derivadas de tecido adiposo (ADSCs), provavelmente devido à sua proximidade anatômica com a cartilagem articular, indicando sua adequação para a engenharia do tecido cartilaginoso 6,7,9,10. Além disso, também possuem potencial de diferenciação osteogênica independente da idade11. A injeção intra-articular de IFP-MSCs demonstrou reduzir a dor e melhorar as funções articulares do joelho em pacientes com osteoartrite (OA)12,13. Além disso, fortes respostas imunossupressoras e propriedades imunomoduladoras melhoradas de IFP-MSCs na presença de citocinas inflamatórias durante condições patológicas também foram relatadas6.
IFP-MSCs são uma fonte promissora e alternativa de MSCs; no entanto, seu benefício terapêutico na engenharia de tecidos e na medicina regenerativa é relativamente menos explorado. Os estudos existentes sobre IFP-MSCs utilizaram principalmente células de doadores humanos. Dentre estes, alguns estudos recentes investigaram IFP-MSCs de doadores humanos saudáveis (pacientes não artríticos, com idade entre 17 e 60 anos)6,14, enquanto a maioria dos estudos utilizou IFP-MSCs de pacientes idosos submetidos à cirurgia de substituição total do joelho (pacientes doentes, idade 70-80 anos). Como tanto a idade quanto a doença são conhecidas por alterar o funcionamento normal das células-tronco (número reduzido e perda de potencial funcional), isso poderia levar a inconsistências no desfecho dos estudos baseados em CTM 7,15,16,17. Além disso, o uso de IFP-MSCs de pacientes com condições fisiopatológicas (por exemplo, artrite e obesidade) também apresenta dificuldade para a compreensão das características básicas das células saudáveis in vitro, atuando como um fator limitante no desenvolvimento de terapias baseadas em CTMs. Para superar esses problemas, o uso de IFP-MSCs de doadores saudáveis é vital. Como o acesso a um doador humano saudável é um desafio, os modelos animais poderiam ser uma alternativa melhor. A esse respeito, existem alguns estudos em que o IFP foi isolado de camundongos18. No entanto, devido ao pequeno tamanho da almofada de gordura em camundongos normais, tecidos adiposos de vários animais têm sido combinados para obter tecido suficiente para executar procedimentos experimentais elaborados19. Assim, há a necessidade de um modelo animal de grande porte, que pudesse atender ao requisito de maior número de células e, simultaneamente, cumprir os princípios 3R (refinar, substituir e reduzir) em pesquisas com animais20. O uso de animais de grande porte tem implicações significativas na pesquisa translacional. Especificamente, na engenharia de tecidos musculoesqueléticos, uma variedade de animais de grande porte, como cães, porcos, ovelhas, cabras e cavalos, tem sido investigada21. A cabra (Capra aegagrus hircus) é uma excelente escolha de animal de grande porte, uma vez que sua articulação sufocante tem a anatomia mais próxima da articulação do joelho humano22,23,24. A estrutura trabecular do osso subcondral e a espessura óssea subcondral dos caprinos são semelhantes às dos seres humanos, e a proporção da cartilagem em relação ao osso também é relatada como próxima aos humanos21. Além disso, as cabras foram amplamente domesticadas em todo o mundo, tornando-as facilmente disponíveis quando estão esqueleticamente maduras. Além disso, os baixos custos de manutenção e o fácil manuseio os tornaram um modelo animal atraente para a pesquisa22.
No presente estudo, é demonstrado um protocolo simples para o isolamento de IFP-MSCs da articulação sufocante de Capra aegagrus hircus (caprino) e condições de cultura in vitro para sua expansão e diferenciação. As células isoladas são aderentes, têm morfologia semelhante à MSC, formam colônias CFU-F (unidade formadora de colônias-fibroblastos) e possuem potencial de diferenciação adipogênica, condrogênica e osteogênica. Portanto, os IFP-MSCs mostram potencial como uma fonte alternativa de MSCs para aplicações biomédicas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#946;-glycerophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9422-10G</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin- 0.02% EDTA</td>
			<td>Hi-Media</td>
			<td>TCL049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15-mL centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>49752-10G</td>
			<td>50 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TCL021-50ml</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50-mL centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian Blue</td>
			<td>Hi-Media</td>
			<td>RM471</td>
			<td>For sufated gycosaminoglycans staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alizarin Red S</td>
			<td>S D Fine-Chem Limited</td>
			<td>26048-25G</td>
			<td>For calcium deposition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>A011</td>
			<td>2.5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic fibroblast growth factor (bFGF)</td>
			<td>Sino Biologicals</td>
			<td>10014-HNAE</td>
			<td>5 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCIP/NBT ALP Substrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B5655-5TAB</td>
			<td>For ALP staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>MB-083</td>
			<td>Long name: Bovine Serum Albumin (1.25 mg/mL )</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TCP-182</td>
			<td>70 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>REMI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin</td>
			<td>RANBAXY LAB. Limited</td>
			<td>B17407T1</td>
			<td>2.5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Violet</td>
			<td>S D Fine-Chem Limited</td>
			<td>42555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.94925.0521</td>
			<td>25 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2915</td>
			<td>1 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM LG</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D5523</td>
			<td>Long name: Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Media Low Glucose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270</td>
			<td>Long name: Fetal Bovine Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution 37%-41%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>61780805001730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indomethacin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7378</td>
			<td>100 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I9278</td>
			<td>10 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon Eclipse TS 100</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS + 1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2521-5mL</td>
			<td>Long name: insulin, transferrin, sodium selenite + linoleic-BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Proline</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TO-109-25G</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>61751605001730</td>
			<td>For lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Meck</td>
			<td>1.07018.2521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes and sterile tips (20 &#181;L, 200 &#181;L, 1000 &#181;L)</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MUSE Cell analyser</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td></td>
			<td>For cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT compound</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>4583</td>
			<td>Long name: Optimal Cutting Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red O dye</td>
			<td>S D Fine-Chem Limited</td>
			<td>54304</td>
			<td>For lipid vacuole staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>A007</td>
			<td>100 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (150 mm and 90 mm)</td>
			<td>NEST</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safranin O</td>
			<td>S D Fine-Chem Limited</td>
			<td>50240</td>
			<td>For sufated gycosaminoglycans staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3434</td>
			<td>3.4 % (w/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile scissors, forceps and scalpels</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For isolation of IFP-MSC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.94953.0521</td>
			<td>35 % (w/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF-&#946;1</td>
			<td>Sino Biologicals</td>
			<td></td>
			<td>Long name: Transforming growth factor- &#946;1 (10 ng/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture incubator 37 &#176;C, 5% CO2</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris buffer</td>
			<td>Merck</td>
			<td>61771405001730</td>
			<td>For lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>S D Fine-Chem Limited</td>
			<td>40632</td>
			<td>For lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type II collagenase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17101015</td>
			<td>1.5 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin D3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9756-1G</td>
			<td>10 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Well plates (6 -WP and 24-WP)</td>
			<td>NEST</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, expansion, and differentiation of mesenchymal stem cells from the infrapatellar fat pad of the goat stifle joint

O IFP, presente na articulação do joelho, serve como uma fonte promissora de CTMs. O IFP é um tecido de fácil acesso, pois é rotineiramente ressecado e descartado durante procedimentos artroscópicos e cirurgias de substituição do joelho. Além disso, sua remoção está associada a morbidade mínima do local doador. Estudos recentes demonstraram que as IFP-MSCs não perdem sua capacidade de proliferação durante a expansão in vitro e têm potencial de diferenciação osteogênica independente da idade. As IFP-MSCs possuem potencial de diferenciação condrogênica superior em comparação com as MSCs derivadas da medula óssea (BMSCs) e as células-tronco derivadas do tecido adiposo (ADSCs). Embora essas células sejam facilmente obtidas de pacientes idosos e doentes, sua eficácia é limitada. Assim, o uso de IFP-MSCs de doadores saudáveis é importante para determinar sua eficácia em aplicações biomédicas. Como o acesso a um doador humano saudável é um desafio, os modelos animais podem ser uma alternativa melhor para permitir a compreensão fundamental. Animais de grande porte, como cães, cavalos, ovelhas e cabras, desempenham um papel crucial na pesquisa translacional. Entre estes, a cabra pode ser um modelo preferido, uma vez que a articulação sufocante da cabra tem a anatomia mais próxima da articulação do joelho humano. Além disso, o IFP de cabra pode atender aos números mais altos de MSC necessários para aplicações de regeneração de tecidos. Além disso, o baixo custo, a disponibilidade e a conformidade com os princípios 3R para pesquisa com animais os tornam um modelo atraente. Este estudo demonstra um protocolo simples para o isolamento de IFP-MSCs da articulação sufocante de caprinos e condições de cultura in vitro para sua expansão e diferenciação. O IFP assepticamente isolado da cabra foi lavado, picado e digerido enzimaticamente. Após filtração e centrifugação, as células coletadas foram cultivadas. Essas células eram aderentes, tinham morfologia semelhante a MSCs e demonstraram notável capacidade clonogênica. Além disso, eles se diferenciaram em linhagens adipogênicas, condrogênicas e osteogênicas, demonstrando sua multipotência. Em conclusão, o estudo demonstra o isolamento e a expansão das CTMs, que mostram potencial em aplicações de engenharia de tecidos e medicina regenerativa.

Isolamento de IFP-MSCs da articulação femorotibial de caprinos As etapas envolvidas no isolamento das IFP-MSCs da articulação sufocante de uma cabra estão representadas na Figura 1. A almofada de gordura presente na superfície interna não articulada da patela foi removida, picada e digerida enzimaticamente. As IFP-MSCs foram isoladas e cultivadas in vitro com sucesso (Figura 2A).
Expansão e...

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Isolation, Expansion, and Differentiation of Mesenchymal Stem Cells from the Infrapatellar Fat Pad of the Goat Stifle Joint

As células-tronco mesenquimais da almofada de gordura infrapatelar (IFP-MSCs) podem ser facilmente isoladas da almofada de gordura infrapatelar da articulação do joelho. Eles proliferam bem in vitro, formam colônias de UFC-F e se diferenciam em linhagens adipogênicas, condrogênicas e osteogênicas. Aqui, a metodologia para o isolamento, expansão e diferenciação de IFP-MSCs da articulação de sufocamento de cabra é fornecida.

Isolamento, Expansão e Diferenciação de Células-Tronco Mesenquimais do Coxim de Gordura Infrapatelar da Articulação Sufocante de Cabra

The IFP, present in the knee joint, serves as a promising source of MSCs. The IFP is an easily accessible tissue as it is routinely resected and discarded ...

As células-tronco mesenquimais derivadas da almofada de gordura infrapatelar, ou em suma, IFP-MSCs, são um tipo de célula-tronco relativamente menos estudado. Este protocolo é um método simples, confiável e reprodutível que demonstra o isolamento de IFP-MSCs da articulação de sufocamento de cabras. A principal vantagem da técnica é que um grande número de IFP-MSCs de alta qualidade pode ser obtido.IFP-MSCs isoladas podem se diferenciar em múltiplas linhagens e possuem amplo potencial regenerativo. Devido à sua localização anatômica, as IFP-MSCs ganharam interesse em reparar defeitos da cartilagem e aliviar a degradação da cartilagem na osteoartrite. O método tem implicações para a terapia baseada em células no campo da engenharia de tecidos e medicina regenerativa.O procedimento para isolamento, expansão e diferenciação de IFP-MSCs será demonstrado pelo Dr. Sugata Hazra e pelo Sr. Aman Mahajan. Para iniciar o isolamento das Células-Tronco Mesenquimais da Almofada de Gordura Infrapatela, ou IFP-MSCs, colete as articulações femorotibiais de cabra abrangendo cerca de 15 centímetros das regiões femoral e tibial dos membros posteriores em uma caixa de amostra de coleta esterilizada. Armazenar a amostra a quatro graus Celsius para transporte para o laboratório para processamento posterior.Coloque a amostra em uma placa de Petri de 150 milímetros e certifique-se de processar a amostra assepticamente e um armário de biossegurança durante todo o procedimento. Enxágue bem com PBS autoclavado suplementado com antibióticos. Mantenha a amostra hidratada usando PBS.Examine cuidadosamente as regiões anatômicas da amostra. Para facilitar o acesso, remova os tecidos extras de ambos os ossos longos completamente, segurando a superfície final do osso do fêmur com uma mão e cortando-a longitudinalmente em direção à articulação usando uma tesoura afiada. Em seguida, sem perturbar o tecido ao redor da cápsula articular, remova os músculos e o tecido adiposo do osso.Da mesma forma, faça outra incisão na extremidade tibial da amostra e remova os músculos e o tecido adiposo do osso tibial. Certifique-se de que ambos os ossos longos estão completamente expostos e que a cápsula articular é visível. Em seguida, faça uma incisão de ambos os lados da membrana sinovial para abrir a articulação articular.Corte a patela livre da membrana sinovial e dos ligamentos patelares usando tesouras e pinças frescas esterilizadas. Coloque imediatamente a patela separada em uma placa de Petri contendo PBS. Da patela separada, remova toda a almofada de gordura presente na superfície interna usando tesouras e pinças.Colete-o em outra placa de Petri fresca e pice-o usando um bisturi. Inclua outras ferramentas cirúrgicas para obter os pequenos segmentos de gordura de cerca de dois a três milímetros. Use uma espátula para transferir o tecido picado para um tubo de centrífuga de 50 mililitros e lave-o três vezes com PBS suplementado com antibióticos por 15 minutos à temperatura ambiente usando um misturador de tubo de ensaio.Para digestão enzimática, incubar cerca de cinco gramas do tecido picado no Dulbecco's Modified Eagle Media, ou DMEM, meio de baixa glicose contendo 1,5 miligramas por mililitro de colagenase tipo II e 2% FBS a 37 graus Celsius por 12 a 16 horas. Aspirar cuidadosamente o tecido digerido e filtrá-lo através de um filtro celular de 70 mícrons para remover qualquer parte não digerida. Centrifugar o filtrado num tubo de centrifugação de 15 mililitros a 150 vezes g durante cinco minutos.Remova o sobrenadante antes de lavar o pellet celular com DMEM de baixa glicose duas vezes. Ressuspeite o pellet em DMEM completo, também conhecido como mídia de expansão. Semeia as células em uma placa de Petri de 150 milímetros e cultive-as no meio de expansão suplementado com cinco nanogramas por mililitro de Fator de Crescimento de Fibroblastos Básicos, ou BFGF, e 50 microgramas por mililitro de sal trissódico de ácido 2-fosfo-L-ascórbico.Incubar as células a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono a 5% para permitir que as células adiram e proliferem. Monitore a fixação e o crescimento das células diariamente. Para manutenção e expansão adequadas dos IFP-MSCs, troque a mídia a cada três dias.Ao mudar o meio, adicione cinco nanogramas frescos por mililitro de BFGF e 50 microgramas por milímetro de sal trissódico de ácido 2-fosfo-L-ascórbico diretamente à placa de Petri. Uma vez que as células se tornem 80% a 90% confluentes, subcultura-as removendo o meio de expansão da placa de Petri e lavando as células com 1X PBS. Em seguida, adicione quatro mililitros de 0,25%Tripsina-EDTA ao prato e incube as células a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono a 5%.Após quatro minutos, toque na placa de lado para desalojar as células. Confirme o descolamento completo de todas as células ao microscópio. Uma vez confirmado, adicione um volume igual de meios de expansão para neutralizar a tripsina.Use uma pipeta para coletar essas células dissociadas em um tubo fresco de polipropileno de 15 mililitros e centrifuga-as a 150 vezes g por cinco minutos à temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet no volume desejado do meio de expansão. Conte as células usando o método padrão de contagem de células e subcultivá-las para expansão adicional a uma densidade de semeadura de 10.000 células por centímetro quadrado em uma placa de Petri de 150 mililitros.Para todos os ensaios, use uma monocamada confluente de células de número de passagem P2 a P5. Quando as células expandidas atingirem 80% a 90% de confluência, dissociar as células usando a solução de tripsina-EDTA antes de peletá-las em um tubo de centrífuga de 15 mililitros a 150 vezes g por cinco minutos. Em seguida, ressuscite a pelota no plasma de cabra a uma densidade de 2 milhões de células por 50 microlitros. Adicionar 50 microlitros de plasma contendo as células a uma placa de Petri esterilizada de 90 milímetros, seguida da adição de cloreto de cálcio a uma concentração final de 0,3%Misture bem para fabricar hidrogel de plasma reticulado.Depois de incubar o hidrogel fabricado a 37 graus Celsius por 40 minutos, transfira os hidrogéis para placas de cultura de tecido de 24 poços contendo meios condrogênicos. Troque a mídia a cada três dias durante 14 dias. Os hidrogéis cultivados em meio DMEM completo sem TGF-beta 1 são considerados controles não induzidos.Após 14 dias de diferenciação condrogênica de células em hidrogel plasmático, lavar os hidrogéis três vezes com PBS por cinco minutos cada e fixar as amostras em formalina tamponada neutra por três horas. As IFP-MSCs isoladas foram homogenicamente aderentes e atingiram morfologia alongada dentro de 24 horas após a cultura in vitro. As células proliferaram eficientemente de 80% a 90% de confluência dentro de seis dias de expansão e apresentaram capacidade clonogênica, indicando capacidades proliferativas e de auto-renovação eficientes.Quando tratadas para se diferenciar em linhagem adipogênica, as células isoladas produziram gotículas lipídicas, o que foi confirmado pela coloração Oil Red O nos dias 14 e 21. Tais gotículas de óleo não eram visíveis nas células sem fatores indutores adipogênicos. As células isoladas encapsuladas em hidrogel plasmático apresentaram a formação de neotecido branco e brilhante após 14 dias no grupo induzido apresentaram potencial condrogênico.O grupo não induzido tinha tecido branco pálido com brilho reduzido. Além disso, a coloração histológica positiva para Alcian Blue e Safranin O no grupo induzido indicou que as células poderiam secretar glicosaminoglicanos sulfatados, um dos principais componentes da matriz cartilaginosa. Em contraste, as seções de hidrogel dos grupos não induzidos foram negativas para coloração Safranin O e Alcian Blue, confirmando o potencial de diferenciação condrogênica das células-tronco mesenquimais apenas na presença de estímulos condrogênicos.As células isoladas induzidas com meio osteogênico apresentaram coloração positiva para fosfatase alcalina, confirmando a mineralização ao final de 14 dias. Após 28 dias de indução osteogênica, as deposições calcificadas foram observadas com coloração S Vermelha de Alizarina. Os resultados ressaltaram o potencial de diferenciação das células induzidas em linhagens adipogênicas, condrogênicas e osteogênicas.É essencial processar a amostra em condições assépticas para evitar a contaminação. Também é importante identificar a localização correta da patela. Este procedimento abre caminho para isolar vários tipos de células, como condrócitos articulares, fibroblastos ligamentares e células-tronco da sinóvia e do líquido sinovial, tendo amplas aplicações na medicina regenerativa.Após o isolamento de IFP-MSCs usando essa técnica, sua eficácia foi particularmente investigada para a regeneração de tecidos musculoesqueléticos, como cartilagem, osso e ligamento, usando abordagens livres de andaimes e andaimes.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

Microcápsulas de alginato como uma plataforma 3D para Propagação e Diferenciação de Células-Tronco Embrionárias (hESC) para diferentes linhagens

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Bioengenharia

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

Desenvolvimento, expansão e<em&gt; In vivo</em&gt; Monitorização das células NK humanas de células estaminais embrionárias humanas (hESCs) e e induziu células-tronco pluripotentes (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on Poly(&#949;-caprolactone) Electrospun Yarns

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on PolyÃƒÅ½Ã‚Âµ-caprolactone Electrospun Yarns

Otimizando Penhora de mesenquimais humanas Células-Tronco em Poly (ε-caprolactona) electrospun Yarns

Research into biomaterials and tissue engineering often includes cell-based in vitro investigations, which require initial knowledge of the starting cell ...

Scaffold-supported Transplantation of Islets in the Epididymal Fat Pad of Diabetic Mice

Transplante de islotes apoiado em andaimes na almofada de gordura epidídmica de ratos diabéticos

Islet transplantation has been clinically proven to be effective at treating type 1 diabetes. However, the current intrahepatic transplantation strategy ...

Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells

Isolamento de células-tronco mesenquimais do periósteo Alveolar humano e efeitos da vitamina D na atividade osteogênica do periósteo-derivado de células

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the ...

Exploring the Potential of Mesenchymal Stem Cell Sheet on The Development of Hepatocellular Carcinoma In Vivo

Exploring the Potential of Mesenchymal Stem Cell Sheet on The Development of Hepatocellular Carcinoma In Vivo

Explorando o potencial das células-tronco mesenquimais folha sobre o desenvolvimento do Carcinoma hepatocelular na Vivo

An in vivo animal model that mimics human cancer could have various applications that deliver significant clinical information. The currently used ...

Construction and Use of an Electrical Stimulation Chamber for Enhancing Osteogenic Differentiation in Mesenchymal Stem/Stromal Cells In Vitro

Construção e utilização de uma câmara de estimulação elétrica para reforçar a diferenciação osteogênica em células estromais/tronco mesenquimais em Vitro

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) have been used extensively to promote bone healing in tissue engineering approaches. Electrical stimulation (EStim) ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Medição potencial de ação óptica unicelular em cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Generation of Human Blood Vessel Organoids from Pluripotent Stem Cells

Geração de Organoides de Vasos Sanguíneos Humanos a partir de Células-Tronco Pluripotentes

An organoid is defined as an engineered multicellular in vitro tissue that mimics its corresponding in vivo organ such that it can be used to study ...

Creation of a Knee Joint-on-a-Chip for Modeling Joint Diseases and Testing Drugs

Criação de uma articulação do joelho em um chip para modelagem de doenças articulares e testes de medicamentos

The high prevalence of debilitating joint diseases like osteoarthritis (OA) poses a high socioeconomic burden. Currently, the available drugs that target ...