Name: isolation, expansion, and differentiation of mesenchymal stem cells from the infrapatellar fat pad of the goat stifle joint
Uploaded: 2022-08-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Expansion, and Differentiation of Mesenchymal Stem Cells from the Infrapatellar Fat Pad of the Goat Stifle Joint at JoVE.com

SH признает поддержку со стороны Института постдокторской стипендии IIT Kanpur и гранта SYST от DST (SEED Division) (SP/YO/618/2018). AM выражает признательность Индийскому технологическому институту Канпура (IIT-Kanpur) за стипендию Института. DSK признает Гириша Джанкината профессором кафедры и кафедры биотехнологии, Индия, для финансирования (BT/PR22445/MED/32/571/2016). AM, SH и DSK благодарят Семейный центр инженерии в медицине Мехта в IIT-Kanpur за их щедрую поддержку.

Протокол основан на выделении IFP-MSC от коз. Козий ИФП и кровь были собраны с местной скотобойни. Поскольку такие коллекции тканей не входят в компетенцию Институционального комитета по этике животных, этическое одобрение не требовалось.
1. Выделение ИФП-МСК из бедренно-...

В настоящем протоколе предусмотрен простой, надежный и воспроизводимый метод выделения МСК из козьей ИФП. Клетки, выделенные с помощью этого метода, были успешно использованы в наших предыдущих исследованиях для регенерации тканей in vitro. Было отмечено, что изолированные клетки бы?...

Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) являются привлекательным кандидатом для клеточной терапии в регенеративной медицине 1,2. Они могут быть собраны из различных тканевых источников, таких как костный мозг, пуповина, плацента, пульпа зуба и подкожная жировая клетчатка3. Однако, поскольку доступность стволовых клеток у взрослых ограничена, а процедура их изоляции часто является инвазивной (что приводит к заболеваемости донорским участком), желательно иметь альтернативный источник стволовых клеток, который мог бы обойти эти проблемы.
Коленный сустав представляет собой депо различных типов клеток, таких как МСК, полученные из инфрапателлярной жировой прокладки, МСК, полученные из синовиальной мембраны, МСК, полученные из синовиальной жидкости, фибробласты связок, суставные хондроциты и т. Д. 4,5,6. Эти клетки имеют потенциал для широкого изучения в исследованиях на основе инженерии костно-мышечной ткани. Таким образом, коленный сустав может быть возможным и надежным источником нескольких типов МСК. Жировое депо, расположенное в коленном суставе, известное как инфрапателларная жировая подушка (IFP) или жировая подушка Хоффы, является перспективным и альтернативным выбором депо MSC. IFP является относительно легкодоступным и клинически доступным источником МСК, поскольку он обычно резецируется и выбрасывается как хирургические отходы во время артроскопии коленного сустава или открытой хирургии коленного сустава. Удаление IFP связано с минимальной заболеваемостью донорским участком, что также делает его привлекательным источником тканей. Имея аналогичный фенотипический профиль, МСК из IFP (IFP-MSC) обладают повышенным клоногенным потенциалом по сравнению с мезенхимальными стволовыми клетками, полученными из костного мозга (BM-MSC)6, и лучшей пролиферативной способностью по сравнению с подкожными стволовыми клетками, полученными из жировой клетчатки (ADSCs)7. Интересно, что по сравнению с МСК, полученными из синовиальной жидкости (SF-МСК), IFP-МСК не теряют свою пролиферативную способность при поздних проходах и не увеличивают время удвоения при поздних проходах. Это говорит о том, что во время клеточного расширения IFP-MSC могут достигать достаточно большого количества клеток для применения в тканевой инженерии in vitro без ущерба для скорости их пролиферации8. Недавние исследования также показали, что IFP-МСК обладают превосходным хондрогенным потенциалом дифференцировки по сравнению с МСК, полученными из костного мозга (BMSCs) и МСК, полученными из жировой ткани (ADSCs), вероятно, из-за их анатомической близости к суставному хрящу, что указывает на их пригодность для инженерии хрящевой ткани 6,7,9,10. Кроме того, они также обладают возрастно-независимым остеогенным потенциалом дифференциации11. Было показано, что внутрисуставная инъекция IFP-MSC уменьшает боль и улучшает функции коленного сустава у пациентов с остеоартритом (ОА)12,13. Кроме того, также сообщалось о сильных иммуносупрессивных реакциях и улучшенных иммуномодулирующих свойствах IFP-MSC в присутствии воспалительных цитокинов во время патологических состояний6.
IFP-MSC являются многообещающим и альтернативным источником МСК; однако их терапевтическая польза в тканевой инженерии и регенеративной медицине относительно менее изучена. В существующих исследованиях IFP-MSC в основном использовались клетки человеческих доноров. Среди них в нескольких недавних исследованиях изучались IFP-МСК от здоровых доноров человека (пациенты без артрита, в возрасте 17-60 лет) 6,14, тогда как в большинстве исследований использовались IFP-MSC от пожилых пациентов, перенесших операцию по полной замене коленного сустава (больные пациенты в возрасте 70-80 лет). Поскольку известно, что как возраст, так и болезнь изменяют нормальное функционирование стволовых клеток (уменьшение количества и потеря функционального потенциала), это потенциально может привести к несоответствиям в результатах исследований на основе MSC 7,15,16,17. Кроме того, использование IFP-МСК у пациентов с патофизиологическими состояниями (например, артритом и ожирением) также создает трудности для понимания основных характеристик здоровых клеток in vitro, тем самым выступая в качестве ограничивающего фактора в разработке терапии на основе МСК. Для преодоления этих проблем жизненно важно использование IFP-MSC от здоровых доноров. Поскольку доступ к здоровому человеческому донору является сложной задачей, животные модели могут быть лучшей альтернативой. В связи с этим есть несколько исследований, в которых IFP был выделен от мышей18. Однако из-за небольшого размера жировой подушки у нормальных мышей жировые ткани нескольких животных были объединены, чтобы получить достаточное количество ткани для выполнения сложных экспериментальных процедур19. Следовательно, существует потребность в большой животной модели, которая могла бы удовлетворить требование к большему количеству клеток и одновременно соответствовать принципам 3R (уточнение, замена и уменьшение) в исследованиях на животных20. Использование крупных животных имеет значительные последствия в трансляционных исследованиях. В частности, в области тканевой инженерии опорно-двигательного аппарата был исследован ряд крупных животных, таких как собаки, свиньи, овцы, козы и лошади21. Коза (Capra aegagrus hircus) является отличным выбором крупного животного, так как ее удушающий сустав имеет самую близкую анатомию к коленному суставу человека 22,23,24. Субхондральная костная трабекулярная структура и толщина субхондральной кости коз аналогичны человеческим, а соотношение хряща к кости также, как сообщается, близко к человеческому21. Кроме того, козы были широко одомашнены по всему миру, что делает их легко доступными, когда они скелетно зрелые. Кроме того, низкие затраты на техническое обслуживание и простота в обращении сделали их привлекательной моделью животных для исследования22.
В настоящем исследовании продемонстрирован простой протокол выделения ИФП-МСК из удушающего сустава Capra aegagrus hircus (козы) и условия культивирования in vitro для их расширения и дифференциации. Изолированные клетки являются адгезивными, имеют MSC-подобную морфологию, образуют колонии КОЕ-F (колониеобразующие единицы-фибробласты) и обладают адипогенным, хондрогенным и остеогенным дифференцировочным потенциалом. Таким образом, IFP-MSC демонстрируют потенциал в качестве альтернативного источника МСК для биомедицинских применений.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#946;-glycerophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9422-10G</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin- 0.02% EDTA</td>
			<td>Hi-Media</td>
			<td>TCL049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15-mL centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>49752-10G</td>
			<td>50 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TCL021-50ml</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50-mL centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian Blue</td>
			<td>Hi-Media</td>
			<td>RM471</td>
			<td>For sufated gycosaminoglycans staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alizarin Red S</td>
			<td>S D Fine-Chem Limited</td>
			<td>26048-25G</td>
			<td>For calcium deposition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>A011</td>
			<td>2.5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic fibroblast growth factor (bFGF)</td>
			<td>Sino Biologicals</td>
			<td>10014-HNAE</td>
			<td>5 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCIP/NBT ALP Substrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B5655-5TAB</td>
			<td>For ALP staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>MB-083</td>
			<td>Long name: Bovine Serum Albumin (1.25 mg/mL )</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TCP-182</td>
			<td>70 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>REMI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin</td>
			<td>RANBAXY LAB. Limited</td>
			<td>B17407T1</td>
			<td>2.5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Violet</td>
			<td>S D Fine-Chem Limited</td>
			<td>42555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.94925.0521</td>
			<td>25 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2915</td>
			<td>1 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM LG</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D5523</td>
			<td>Long name: Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Media Low Glucose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270</td>
			<td>Long name: Fetal Bovine Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution 37%-41%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>61780805001730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indomethacin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7378</td>
			<td>100 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I9278</td>
			<td>10 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon Eclipse TS 100</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS + 1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2521-5mL</td>
			<td>Long name: insulin, transferrin, sodium selenite + linoleic-BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Proline</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TO-109-25G</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>61751605001730</td>
			<td>For lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Meck</td>
			<td>1.07018.2521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes and sterile tips (20 &#181;L, 200 &#181;L, 1000 &#181;L)</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MUSE Cell analyser</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td></td>
			<td>For cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT compound</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>4583</td>
			<td>Long name: Optimal Cutting Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red O dye</td>
			<td>S D Fine-Chem Limited</td>
			<td>54304</td>
			<td>For lipid vacuole staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>A007</td>
			<td>100 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (150 mm and 90 mm)</td>
			<td>NEST</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safranin O</td>
			<td>S D Fine-Chem Limited</td>
			<td>50240</td>
			<td>For sufated gycosaminoglycans staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3434</td>
			<td>3.4 % (w/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile scissors, forceps and scalpels</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For isolation of IFP-MSC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.94953.0521</td>
			<td>35 % (w/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF-&#946;1</td>
			<td>Sino Biologicals</td>
			<td></td>
			<td>Long name: Transforming growth factor- &#946;1 (10 ng/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture incubator 37 &#176;C, 5% CO2</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris buffer</td>
			<td>Merck</td>
			<td>61771405001730</td>
			<td>For lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>S D Fine-Chem Limited</td>
			<td>40632</td>
			<td>For lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type II collagenase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17101015</td>
			<td>1.5 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin D3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9756-1G</td>
			<td>10 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Well plates (6 -WP and 24-WP)</td>
			<td>NEST</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, expansion, and differentiation of mesenchymal stem cells from the infrapatellar fat pad of the goat stifle joint

IFP, присутствующий в коленном суставе, служит перспективным источником МСК. IFP является легкодоступной тканью, поскольку она обычно резецируется и выбрасывается во время артроскопических процедур и операций по замене коленного сустава. Кроме того, его удаление связано с минимальной заболеваемостью донорским участком. Недавние исследования показали, что IFP-МСК не теряют своей способности к пролиферации во время расширения in vitro и обладают независимым от возраста остеогенным дифференцировочным потенциалом. IFP-MSC обладают превосходным хондрогенным дифференцировочным потенциалом по сравнению с МСК, полученными из костного мозга (BMSCs) и стволовыми клетками, полученными из жировой ткани (ADSCs). Хотя эти клетки легко доступны от пожилых и больных пациентов, их эффективность ограничена. Следовательно, использование IFP-MSC от здоровых доноров важно для определения их эффективности в биомедицинских приложениях. Поскольку доступ к здоровому человеческому донору является сложной задачей, животные модели могут стать лучшей альтернативой для обеспечения фундаментального понимания. Крупные животные, такие как собаки, лошади, овцы и козы, играют решающую роль в трансляционных исследованиях. Среди них коза может быть предпочтительной моделью, поскольку удушающий сустав козы имеет наиболее близкую анатомию к коленному суставу человека. Кроме того, коза-IFP может выполнять более высокие показатели MSC, необходимые для применения регенерации тканей. Кроме того, низкая стоимость, доступность и соответствие принципам 3R для исследований на животных делают их привлекательной моделью. Данное исследование демонстрирует простой протокол выделения IFP-МСК из удушающего сустава коз и условий культивирования in vitro для их расширения и дифференцировки. Асептически изолированный ИФП от козы промывали, измельчали и переваривали ферментативно. После фильтрации и центрифугирования собранные клетки культивировали. Эти клетки были адгезивными, имели морфологию, подобную МСК, и демонстрировали замечательную клоногенную способность. Кроме того, они дифференцировались на адипогенные, хондрогенные и остеогенные линии, демонстрируя свою мультипотентность. В заключение, исследование демонстрирует выделение и расширение МСК, которые показывают потенциал в тканевой инженерии и регенеративной медицине.

Выделение ИФП-МСК из бедренно-сустава козы Этапы, связанные с изоляцией IFP-MSC от удушающего сустава козы, изображены на рисунке 1. Жировая подушка, присутствующая во внутренней нешарниринговой поверхности надколенника, удалялась, измельчалась и ферментативно ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Expansion, and Differentiation of Mesenchymal Stem Cells from the Infrapatellar Fat Pad of the Goat Stifle Joint at JoVE.com

Isolation, Expansion, and Differentiation of Mesenchymal Stem Cells from the Infrapatellar Fat Pad of the Goat Stifle Joint

Инфрапателлярные жировые мезенхимальные стволовые клетки (IFP-MSCs) могут быть легко выделены из инфрапателлярной жировой подушки коленного сустава. Они хорошо размножаются in vitro, образуют колонии КОЕ-F и дифференцируются на адипогенные, хондрогенные и остеогенные линии. Здесь приведена методология выделения, расширения и дифференциации ИФП-МСК от козьего удушающего сустава.

Выделение, расширение и дифференцировка мезенхимальных стволовых клеток из инфрапателлярной жировой подушки козьего удушающего сустава

The IFP, present in the knee joint, serves as a promising source of MSCs. The IFP is an easily accessible tissue as it is routinely resected and discarded ...

Инфрапателларные жировые мезенхимальные стволовые клетки, или, короче говоря, IFP-MSC, являются относительно менее изученным типом стволовых клеток. Этот протокол является простым, надежным и воспроизводимым методом, демонстрирующим изоляцию IFP-MSC от козьего удушающего сустава. Основным преимуществом методики является то, что можно получить большое количество высококачественных IFP-МСК.Изолированные IFP-МСК могут дифференцироваться в несколько линий и обладать обширным регенеративным потенциалом. Из-за своего анатомического расположения IFP-MSC заинтересовались восстановлением дефектов хряща и облегчением деградации хряща при остеоартрите. Метод имеет значение для клеточной терапии в области тканевой инженерии и регенеративной медицины.Процедуру выделения, расширения и дифференциации IFP-MSC продемонстрируют д-р Сугата Хазра и г-н Аман Махаджан. Чтобы начать выделение инфрапателлярных жировых мезенхимальных стволовых клеток, или IFP-MSC, соберите козьи бедренные суставы, охватывающие около 15 сантиметров бедренной и большеберцовой областей задних конечностей в стерилизованном ящике для отбора проб. Храните образец при четырех градусах Цельсия для транспортировки в лабораторию для дальнейшей обработки.Поместите образец на 150-миллиметровую чашку Петри и обеспечьте асептическую обработку образца и шкаф биобезопасности на протяжении всей процедуры. Тщательно промойте его автоклавным PBS, дополненным антибиотиками. Держите образец гидратированным с помощью PBS.Внимательно изучите анатомические области образца. Для легкого доступа удалите лишние ткани из обеих длинных костей полностью, удерживая торцевую поверхность бедренной кости одной рукой и разрезая ее продольно по направлению к суставу острыми ножницами. Затем, не нарушая ткани, окружающие суставную капсулу, удалите мышцы и жировую ткань из кости.Аналогично сделайте еще один разрез на большеберцовом конце образца и удалите мышцы и жировую ткань из большеберцовой кости. Убедитесь, что обе длинные кости полностью обнажены и что суставная капсула видна. Затем сделайте разрез с обеих сторон синовиальной мембраны, чтобы разрезать сустав.Отрежьте надколенник от синовиальной оболочки и надколенников с помощью свежих стерилизованных ножниц и щипцов. Немедленно поместите отделенную коленную чашечку в чашку Петри, содержащую PBS. Из отделенной надколенника удалите всю жировую подушку, присутствующую на внутренней поверхности, ножницами и щипцами.Соберите его в другую свежую чашку Петри и измельчите с помощью скальпеля. Включите другие хирургические инструменты для получения небольших жировых сегментов около двух-трех миллиметров. Используйте шпатель, чтобы перенести измельченную ткань в 50-миллилитровую центрифужную трубку и трижды промыть ее PBS, дополненной антибиотиками, в течение 15 минут при комнатной температуре с помощью смесителя пробирки.Для ферментативного пищеварения инкубируйте около пяти граммов измельченной ткани в модифицированной среде Dulbecco, или DMEM, среде с низким содержанием глюкозы, содержащей 1,5 миллиграмма на миллилитр коллагеназы типа II и 2% FBS при 37 градусах Цельсия в течение 12-16 часов. Осторожно аспирируйте переваренную ткань и фильтруйте ее через 70-микронный клеточный ситечко, чтобы удалить любую непереваренную часть. Центрифугируйте фильтрат в 15-миллилитровой центрифужной трубке в 150 раз г в течение пяти минут.Удалите супернатант перед промывкой клеточной гранулы с низким содержанием глюкозы DMEM дважды. Повторно суспендируйте гранулы в полном DMEM, также известном как расширительная среда. Посейте клетки на 150-миллиметровую чашку Петри и культивируйте их в расширительной среде, дополненной пятью нанограммами на миллилитр основного фактора роста фибробластов, или BFGF, и 50 микрограммами на миллилитр 2-фосфо-L-аскорбиновой кислоты тринатриевой соли.Инкубируйте клетки при 37 градусах Цельсия в инкубаторе 5% углекислого газа, чтобы позволить клеткам прилипать и размножаться. Ежедневно контролируйте прикрепление и рост клеток. Для надлежащего обслуживания и расширения IFP-MSC, меняйте носитель каждые три дня.При смене среды добавьте свежие пять нанограммов на миллилитр BFGF и 50 мкг на миллиметр 2-фосфо-L-аскорбиновой кислоты тринатриевой соли непосредственно в чашку Петри. Как только клетки становятся сливающимися на 80-90%, субкультурируют их, удаляя расширительные среды из чашки Петри и промывая клетки 1X PBS. Затем добавьте в чашку четыре миллилитра 0,25% трипсина-ЭДТА и инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в инкубаторе с 5% углекислым газом.Через четыре минуты постучите по пластине на боку, чтобы выбить клетки. Подтвердите полное отсоединение всех клеток под микроскопом. После подтверждения добавьте равный объем расширительной среды, чтобы нейтрализовать трипсин.Используйте пипетку, чтобы собрать эти диссоциированные клетки в свежую 15-миллилитровую полипропиленовую трубку и центрифугировать их в 150 раз в г в течение пяти минут при комнатной температуре. Выбросьте супернатант и повторно суспендируйте гранулу в нужном объеме расширительной среды. Подсчитывают клетки с помощью стандартного метода подсчета клеток и субкультурируют их для дальнейшего расширения при плотности посева 10 000 клеток на квадратный сантиметр в 150-миллилитровой чашке Петри.Для всех анализов используют сливающийся монослой клеток прохода с номерами от Р2 до Р5. Когда расширенные клетки достигнут 80-90% конфлюзии, диссоциируют клетки с помощью раствора Трипсина-ЭДТА, прежде чем гранулировать их вниз в 15-миллилитровой центрифужной трубке в 150 раз г в течение пяти минут. Затем повторно суспендируют гранулу в плазме козы при плотности 2 миллиона клеток на 50 микролитров. Добавьте 50 микролитров плазмы, содержащей клетки, на стерилизованную 90-миллиметровую чашку Петри с последующим добавлением хлорида кальция в конечной концентрации 0,3% Хорошо перемешайте для изготовления сшитого гидрогеля плазмы.После инкубации изготовленного гидрогеля при 37 градусах Цельсия в течение 40 минут переложите гидрогели на 24-луночные пластины культуры тканей, содержащие хондрогенные среды. Меняйте медиа каждые три дня в течение 14 дней. Гидрогели, культивируемые в полной среде DMEM без TGF-beta 1, считаются неиндуцированными контрольными группами.После 14 дней хондрогенной дифференцировки клеток в гидрогеле плазмы трижды промыть гидрогели PBS в течение пяти минут каждый, и зафиксировать образцы в нейтральном буферизованном формалине в течение трех часов. Изолированные IFP-МСК были гомогенно адгезивными и достигали удлиненной морфологии в течение 24 часов после культивирования in vitro. Клетки эффективно размножались от 80% до 90% слияния в течение шести дней после расширения и демонстрировали клоногенную способность, что указывает на эффективные пролиферативные и самообновляющиеся способности.При лечении для дифференцировки в адипогенную линию изолированные клетки продуцировали липидные капли, что было подтверждено окрашиванием Oil Red O на 14 и 21 день. Такие капли масла не были видны в клетках без адипогенных индуцирующих факторов. Выделенные клетки, инкапсулированные в гидрогель плазмы, показали образование белой и глянцевой неоткани через 14 дней, в индуцированной группе проявился хондрогенный потенциал.Неиндуцированная группа имела бледно-белую ткань с пониженной глянцевостью. Кроме того, положительное гистологическое окрашивание для Alcian Blue и Safranin O в индуцированной группе показало, что клетки могут секретировать сульфатированные гликозаминогликаны, один из основных компонентов хрящевой матрицы. Напротив, участки гидрогеля из неиндуцированных групп были отрицательными для окрашивания Сафранином О и Альциановым синим, подтверждая хондрогенный дифференцировочный потенциал мезенхимальных стволовых клеток только в присутствии хондрогенных стимулов.Изолированные клетки, индуцированные остеогенными средами, показали положительное окрашивание щелочной фосфатазы, подтверждая минерализацию в конце 14 дней. После 28 дней остеогенной индукции наблюдались кальцинированные отложения с окрашиванием Alizarin Red S. Результаты подчеркнули дифференцировочный потенциал индуцированных клеток в адипогенные, хондрогенные и остеогенные линии.Важно обрабатывать образец в асептических условиях, чтобы избежать загрязнения. Также важно определить правильное расположение надколенника. Эта процедура открывает возможности для выделения различных типов клеток, таких как суставные хондроциты, фибробласты связок и стволовые клетки из синовиальной и синовиальной жидкости, имеющих широкое применение в регенеративной медицине.После выделения IFP-МСК с использованием этого метода его эффективность была особенно исследована для регенерации костно-мышечных тканей, таких как хрящи, кости и связки, с использованием подходов без каркаса и каркаса.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

Альгината микрокапсулы в качестве 3D-платформа для распространения и дифференциации эмбриональных стволовых клеток человека (чЭСК) для разных линий

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

Развитие, расширение и<em&gt; В естественных условиях</em&gt; Контроль за соблюдением NK-клетки из человеческих эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) и и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on Poly(&#949;-caprolactone) Electrospun Yarns

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on PolyÃƒÅ½Ã‚Âµ-caprolactone Electrospun Yarns

Оптимизация пристрастие к мезенхимальных стволовых клеток человека на поли (ε-капролактон) Electrospun пряжи

Research into biomaterials and tissue engineering often includes cell-based in vitro investigations, which require initial knowledge of the starting cell ...

Scaffold-supported Transplantation of Islets in the Epididymal Fat Pad of Diabetic Mice

Подмороженная трансплантация островков в эпидидимальной жировой клетке диабетических мышей

Islet transplantation has been clinically proven to be effective at treating type 1 diabetes. However, the current intrahepatic transplantation strategy ...

Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells

Изоляция мезенхимальных стволовых клеток человека надкостницей альвеолярного и эффекты витамина d на Остеогенные активность клеток, надкостницы, полученных

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the ...

Exploring the Potential of Mesenchymal Stem Cell Sheet on The Development of Hepatocellular Carcinoma In Vivo

Exploring the Potential of Mesenchymal Stem Cell Sheet on The Development of Hepatocellular Carcinoma In Vivo

Изучение потенциала мезенхимальных стволовых клеток листа на развитие гепатоцеллюлярной карциномы In Vivo

An in vivo animal model that mimics human cancer could have various applications that deliver significant clinical information. The currently used ...

Construction and Use of an Electrical Stimulation Chamber for Enhancing Osteogenic Differentiation in Mesenchymal Stem/Stromal Cells In Vitro

Строительство и использование электрической стимуляции камеры для укрепления Остеогенные дифференцирования мезенхимальных стволовых стромальных клеток In Vitro

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) have been used extensively to promote bone healing in tissue engineering approaches. Electrical stimulation (EStim) ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Измерение потенциала оптического действия одной клетки в кардиомиоцитах, полученных из человеческих плюрипотентных стволовых клеток

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Generation of Human Blood Vessel Organoids from Pluripotent Stem Cells

Генерация органоидов кровеносных сосудов человека из плюрипотентных стволовых клеток

An organoid is defined as an engineered multicellular in vitro tissue that mimics its corresponding in vivo organ such that it can be used to study ...

Creation of a Knee Joint-on-a-Chip for Modeling Joint Diseases and Testing Drugs

Создание коленного сустава-на-чипе для моделирования заболеваний суставов и тестирования лекарств

The high prevalence of debilitating joint diseases like osteoarthritis (OA) poses a high socioeconomic burden. Currently, the available drugs that target ...