Name: isolation, expansion, and differentiation of mesenchymal stem cells from the infrapatellar fat pad of the goat stifle joint
Uploaded: 2022-08-02T13:00:00
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SH agradece el apoyo de la beca postdoctoral del Instituto de IIT Kanpur y la subvención SYST de DST (División SEED) (SP/YO/618/2018). AM reconoce al Instituto Indio de Tecnología-Kanpur (IIT-Kanpur) por una beca del Instituto. DSK reconoce a Gireesh Jankinath Chair Professorship y Department of Biotechnology, India, por su financiación (BT/PR22445/MED/32/571/2016). AM, SH y DSK agradecen al Centro Familiar Mehta de Ingeniería en Medicina en IIT-Kanpur por su generoso apoyo.

El protocolo se basa en el aislamiento de IFP-MSCs de cabras. Se recogieron IFP de cabra y sangre de un matadero local. Dado que tales colecciones de tejidos están fuera del ámbito de un Comité Institucional de Ética Animal, no se requería aprobación ética.
1. Aislamiento de IFP-MSCs de la articulación femorotibial de la rodilla de cabra
<ol><li>Recolectar la articulación femorotibial de cabra (muestra) que abarca ~ 15 cm cada una de las regiones femoral y tibial de...

En el presente protocolo, se ha proporcionado un método simple, confiable y reproducible para el aislamiento de MSC de IFP de cabra. Las células aisladas utilizando este método se han utilizado con éxito en nuestros estudios previos para la regeneración de tejidos in vitro. Se observó que las células aisladas eran proliferativas, respondían a diversos factores de crecimiento y conservaban su actividad biológica cuando se sembraban en fibras electrohiladas y andamios25,26</su...

Las células madre mesenquimales (CMM) son un candidato atractivo para las terapias basadas en células en medicina regenerativa 1,2. Se pueden recolectar de una variedad de fuentes de tejidos como médula ósea, cordón umbilical, placenta, pulpa dental y tejido adiposo subcutáneo3. Sin embargo, como la disponibilidad de células madre en adultos es limitada y su procedimiento de aislamiento es a menudo invasivo (lo que resulta en morbilidad en el sitio donante), es deseable tener una fuente alternativa de células madre que pueda eludir estos desafíos.
La articulación de la rodilla es un depósito de varios tipos de células, como las MSC derivadas de almohadillas de grasa infrapatelar, las MSC derivadas de la membrana sinovial, las MSC derivadas del líquido sinovial, los fibroblastos de ligamentos, los condrocitos articulares, etc. 4,5,6. Estas células tienen el potencial de ser ampliamente exploradas en la investigación basada en la ingeniería de tejidos musculoesqueléticos. Por lo tanto, la articulación de la rodilla podría ser una fuente posible y confiable de múltiples tipos de MSC. El depósito adiposo ubicado en la articulación de la rodilla, conocido como almohadilla de grasa infrapatelar (IFP) o almohadilla de grasa de Hoffa, es una opción prometedora y alternativa de depósito de MSC. El IFP es una fuente de MSC de acceso relativamente fácil y clínicamente obtenible, ya que se reseca y descarta rutinariamente como desechos quirúrgicos durante la artroscopia de rodilla o la cirugía abierta de rodilla. La eliminación del IFP se asocia con una morbilidad mínima en el sitio donante, lo que también lo convierte en una fuente de tejido atractiva. A pesar de tener un perfil fenotípico similar, las MSC de IFP (IFP-MSCs) tienen un mayor potencial clonogénico en comparación con las células madre mesenquimales derivadas de médula ósea (BM-MSCs)6 y una mejor capacidad proliferativa en comparación con las células madre derivadas de tejido adiposo subcutáneo (ADSC)7. Curiosamente, en comparación con las MSC derivadas del líquido sinovial (SF-MSC), las IFP-MSC no pierden su capacidad proliferativa en los pasajes tardíos, ni el tiempo de duplicación aumenta en los pasajes tardíos. Esto sugiere que, durante la expansión celular, las IFP-MSC pueden lograr un número suficientemente grande de células para aplicaciones de ingeniería de tejidos in vitro sin comprometer su tasa de proliferación8. Estudios recientes también han sugerido que las IFP-MSCs poseen un potencial de diferenciación condrogénica superior en comparación con las MSCs derivadas de médula ósea (BMSC) y las MSCs derivadas de tejido adiposo (ADSC), probablemente debido a su proximidad anatómica al cartílago articular, indicando su idoneidad para la ingeniería tisular del cartílago 6,7,9,10. Además, también poseen un potencial de diferenciación osteogénica independiente de la edad11. Se ha demostrado que la inyección intraarticular de IFP-MSCs reduce el dolor y mejora las funciones articulares de la rodilla en pacientes con osteoartritis (OA)12,13. Además, también se han descrito fuertes respuestas inmunosupresoras y mejores propiedades inmunomoduladoras de IFP-MSCs en presencia de citoquinas inflamatorias durante condiciones patológicas6.
Los IFP-MSC son una fuente prometedora y alternativa de MSC; Sin embargo, su beneficio terapéutico en ingeniería de tejidos y medicina regenerativa es relativamente menos explorado. Los estudios existentes sobre IFP-MSC han utilizado principalmente células de donantes humanos. Entre estos, algunos estudios recientes han investigado IFP-MSC de donantes humanos sanos (pacientes no artríticos, de 17 a 60 años)6,14, mientras que la mayoría de los estudios han utilizado IFP-MSC de pacientes de edad avanzada sometidos a cirugía de reemplazo total de rodilla (pacientes enfermos, de 70 a 80 años). Como se sabe que tanto la edad como la enfermedad alteran el funcionamiento normal de las células madre (número reducido y pérdida de potencial funcional), esto podría conducir a inconsistencias en el resultado de los estudios basados en MSC 7,15,16,17. Además de eso, el uso de IFP-MSC de pacientes con condiciones fisiopatológicas (por ejemplo, artritis y obesidad) también plantea dificultades para comprender las características básicas de las células sanas in vitro, actuando así como un factor limitante en el desarrollo de terapias basadas en MSC. Para superar estos problemas, el uso de IFP-MSC de donantes sanos es vital. Como el acceso a un donante humano sano es un desafío, los modelos animales podrían ser una mejor alternativa. En este sentido, hay algunos estudios en los que se ha aislado IFP de ratones18. Sin embargo, debido al pequeño tamaño de la almohadilla de grasa en ratones normales, los tejidos grasos de múltiples animales se han combinado para obtener suficiente tejido para ejecutar procedimientos experimentales elaborados19. Por lo tanto, existe la necesidad de un modelo animal grande, que podría cumplir con el requisito de mayor número de células y simultáneamente cumplir con los principios de las 3R (refinar, reemplazar y reducir) en la investigación con animales20. El uso de animales grandes tiene implicaciones significativas en la investigación traslacional. Específicamente, en la ingeniería de tejidos musculoesqueléticos, se ha investigado una variedad de animales grandes como perros, cerdos, ovejas, cabras y caballos21. La cabra (Capra aegagrus hircus) es una excelente opción de animal grande ya que su articulación sofocante tiene la anatomía más cercana a la articulación de la rodilla humana22,23,24. La estructura trabecular del hueso subcondral y el grosor del hueso subcondral de las cabras son similares a los humanos, y la proporción del cartílago al hueso también se informa que es cercana a la de los humanos21. Además, las cabras han sido ampliamente domesticadas en todo el mundo, haciéndolas fácilmente disponibles cuando están esqueléticamente maduras. Además, los bajos costos de mantenimiento y el fácil manejo los han convertido en un modelo animal atractivo para la investigación22.
En el presente estudio, se demuestra un protocolo simple para el aislamiento de IFP-MSCs de la articulación sofocante de Capra aegagrus hircus (cabra) y condiciones de cultivo in vitro para su expansión y diferenciación. Las células aisladas son adherentes, tienen morfología similar a MSC, forman colonias de CFU-F (unidad formadora de colonias-fibroblastos) y poseen potencial de diferenciación adipogénica, condrogénica y osteogénica. Por lo tanto, los IFP-MSC muestran potencial como una fuente alternativa de MSC para aplicaciones biomédicas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#946;-glycerophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9422-10G</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin- 0.02% EDTA</td>
			<td>Hi-Media</td>
			<td>TCL049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15-mL centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>49752-10G</td>
			<td>50 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TCL021-50ml</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50-mL centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian Blue</td>
			<td>Hi-Media</td>
			<td>RM471</td>
			<td>For sufated gycosaminoglycans staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alizarin Red S</td>
			<td>S D Fine-Chem Limited</td>
			<td>26048-25G</td>
			<td>For calcium deposition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>A011</td>
			<td>2.5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic fibroblast growth factor (bFGF)</td>
			<td>Sino Biologicals</td>
			<td>10014-HNAE</td>
			<td>5 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCIP/NBT ALP Substrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B5655-5TAB</td>
			<td>For ALP staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>MB-083</td>
			<td>Long name: Bovine Serum Albumin (1.25 mg/mL )</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TCP-182</td>
			<td>70 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>REMI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin</td>
			<td>RANBAXY LAB. Limited</td>
			<td>B17407T1</td>
			<td>2.5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Violet</td>
			<td>S D Fine-Chem Limited</td>
			<td>42555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.94925.0521</td>
			<td>25 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2915</td>
			<td>1 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM LG</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D5523</td>
			<td>Long name: Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Media Low Glucose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270</td>
			<td>Long name: Fetal Bovine Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution 37%-41%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>61780805001730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indomethacin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7378</td>
			<td>100 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I9278</td>
			<td>10 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon Eclipse TS 100</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS + 1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2521-5mL</td>
			<td>Long name: insulin, transferrin, sodium selenite + linoleic-BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Proline</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TO-109-25G</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>61751605001730</td>
			<td>For lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Meck</td>
			<td>1.07018.2521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes and sterile tips (20 &#181;L, 200 &#181;L, 1000 &#181;L)</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MUSE Cell analyser</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td></td>
			<td>For cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT compound</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>4583</td>
			<td>Long name: Optimal Cutting Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red O dye</td>
			<td>S D Fine-Chem Limited</td>
			<td>54304</td>
			<td>For lipid vacuole staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>A007</td>
			<td>100 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (150 mm and 90 mm)</td>
			<td>NEST</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safranin O</td>
			<td>S D Fine-Chem Limited</td>
			<td>50240</td>
			<td>For sufated gycosaminoglycans staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3434</td>
			<td>3.4 % (w/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile scissors, forceps and scalpels</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For isolation of IFP-MSC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.94953.0521</td>
			<td>35 % (w/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF-&#946;1</td>
			<td>Sino Biologicals</td>
			<td></td>
			<td>Long name: Transforming growth factor- &#946;1 (10 ng/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture incubator 37 &#176;C, 5% CO2</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris buffer</td>
			<td>Merck</td>
			<td>61771405001730</td>
			<td>For lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>S D Fine-Chem Limited</td>
			<td>40632</td>
			<td>For lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type II collagenase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17101015</td>
			<td>1.5 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin D3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9756-1G</td>
			<td>10 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Well plates (6 -WP and 24-WP)</td>
			<td>NEST</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, expansion, and differentiation of mesenchymal stem cells from the infrapatellar fat pad of the goat stifle joint

El IFP, presente en la articulación de la rodilla, sirve como una fuente prometedora de MSC. El IFP es un tejido de fácil acceso, ya que se reseca y descarta rutinariamente durante los procedimientos artroscópicos y las cirugías de reemplazo de rodilla. Además, su eliminación se asocia con una morbilidad mínima en el sitio donante. Estudios recientes han demostrado que los IFP-MSC no pierden su capacidad de proliferación durante la expansión in vitro y tienen un potencial de diferenciación osteogénica independiente de la edad. Las IFP-MSC poseen un potencial de diferenciación condrogénica superior en comparación con las MSC derivadas de la médula ósea (BMSC) y las células madre derivadas de tejido adiposo (ADSC). Aunque estas células se pueden obtener fácilmente de pacientes ancianos y enfermos, su efectividad es limitada. Por lo tanto, el uso de IFP-MSC de donantes sanos es importante para determinar su eficacia en aplicaciones biomédicas. Como el acceso a un donante humano sano es un desafío, los modelos animales podrían ser una mejor alternativa para permitir la comprensión fundamental. Los animales grandes como perros, caballos, ovejas y cabras juegan un papel crucial en la investigación traslacional. Entre estos, la cabra podría ser un modelo preferido ya que la articulación sofocante de la cabra tiene la anatomía más cercana a la articulación de la rodilla humana. Además, el IFP de cabra puede cumplir con los números más altos de MSC necesarios para aplicaciones de regeneración de tejidos. Además, el bajo costo, la disponibilidad y el cumplimiento de los principios de las 3R para la investigación con animales los convierten en un modelo atractivo. Este estudio demuestra un protocolo simple para aislar IFP-MSC de la articulación sofocante de cabras y condiciones de cultivo in vitro para su expansión y diferenciación. El IFP asépticamente aislado de la cabra fue lavado, picado y digerido enzimáticamente. Después de la filtración y centrifugación, las células recolectadas fueron cultivadas. Estas células eran adherentes, tenían una morfología similar a las MSC y demostraron una notable capacidad clonogénica. Además, se diferenciaron en linajes adipogénicos, condrogénicos y osteogénicos, lo que demuestra su multipotencia. En conclusión, el estudio demuestra el aislamiento y la expansión de las MSC, que muestran potencial en aplicaciones de ingeniería de tejidos y medicina regenerativa.

Aislamiento de IFP-MSCs de la articulación femorotibial de cabra Los pasos involucrados en el aislamiento de IFP-MSC de la articulación sofocante de una cabra se representan en la Figura 1. La almohadilla de grasa presente en la superficie interna no articulada de la rótula se eliminó, se picó y se digirió enzimáticamente. Los IFP-MSCs fueron aislados con éxito y cultivados in vitro (Figura 2A).
<s...

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Isolation, Expansion, and Differentiation of Mesenchymal Stem Cells from the Infrapatellar Fat Pad of the Goat Stifle Joint

Las células madre mesenquimales de la almohadilla de grasa infrapatelar (IFP-MSC) se pueden aislar fácilmente de la almohadilla de grasa infrapatelar de la articulación de la rodilla. Proliferan bien in vitro, forman colonias de UFC-F y se diferencian en linajes adipogénicos, condrogénicos y osteogénicos. En este documento, se proporciona la metodología para el aislamiento, expansión y diferenciación de IFP-MSC de la articulación sofocante de cabra.

Aislamiento, expansión y diferenciación de células madre mesenquimales de la almohadilla de grasa infrapatelar de la articulación sofocante de cabra

The IFP, present in the knee joint, serves as a promising source of MSCs. The IFP is an easily accessible tissue as it is routinely resected and discarded ...

Las células madre mesenquimales derivadas de la almohadilla de grasa infrapatelar, o en resumen, IFP-MSC, son un tipo de células madre relativamente menos estudiado. Este protocolo es un método simple, confiable y reproducible que demuestra el aislamiento de IFP-MSC de la articulación de sofocación de cabra. La principal ventaja de la técnica es que se puede obtener una gran cantidad de IFP-MSC de alta calidad.Los IFP-MSC aislados pueden diferenciarse en múltiples linajes y poseen un amplio potencial regenerativo. Debido a su ubicación anatómica, los IFP-MSC han ganado interés en reparar defectos del cartílago y aliviar la degradación del cartílago en la osteoartritis. El método tiene implicaciones para la terapia basada en células en el campo de la ingeniería de tejidos y la medicina regenerativa.El procedimiento para el aislamiento, expansión y diferenciación de IFP-MSC será demostrado por el Dr. Sugata Hazra y el Sr. Aman Mahajan. Para comenzar el aislamiento de las células madre mesenquimales de la almohadilla de grasa infrapatelar, o IFP-MSC, recolecte las articulaciones femorotibiales de cabra que abarcan alrededor de 15 centímetros de las regiones femoral y tibial de las extremidades posteriores en una caja de muestras de recolección esterilizada. Almacene la muestra a cuatro grados centígrados para transportarla al laboratorio para su posterior procesamiento.Coloque la muestra en una placa de Petri de 150 milímetros y asegúrese de procesar la muestra asépticamente y en un gabinete de bioseguridad durante todo el procedimiento. Enjuáguelo bien con PBS esterilizado en autoclave complementado con antibióticos. Mantenga la muestra hidratada usando PBS.Examine cuidadosamente las regiones anatómicas de la muestra. Para facilitar el acceso, retire los tejidos adicionales de ambos huesos largos por completo sosteniendo la superficie final del hueso del fémur con una mano y cortándola longitudinalmente hacia la articulación con tijeras afiladas. Luego, sin alterar el tejido que rodea la cápsula articular, retire los músculos y el tejido adiposo del hueso.Del mismo modo, haga otra incisión en el extremo tibial de la muestra y retire los músculos y el tejido adiposo del hueso tibial. Asegúrese de que ambos huesos largos estén completamente expuestos y que la cápsula articular sea visible. Luego, haga una incisión desde cada lado de la membrana sinovial para abrir la articulación articulada.Cortar la rótula de la membrana sinovial y los ligamentos rotulianos con tijeras y fórceps recién esterilizados. Coloque inmediatamente la rótula separada en una placa de Petri que contenga PBS. De la rótula separada, retire toda la almohadilla de grasa presente en la superficie interna con tijeras y pinzas.Recógelo en otra placa de Petri fresca y picócalo con un bisturí. Incluye otras herramientas quirúrgicas para obtener los pequeños segmentos de grasa de alrededor de dos a tres milímetros. Use una espátula para transferir el tejido picado a un tubo de centrífuga de 50 mililitros y lávelo tres veces con PBS suplementado con antibióticos durante 15 minutos a temperatura ambiente usando un mezclador de tubo de ensayo.Para la digestión enzimática, incubar alrededor de cinco gramos del tejido picado en Dulbecco's Modified Eagle Media, o DMEM, medios bajos en glucosa que contienen 1,5 miligramos por mililitro de colagenasa tipo II y 2% FBS a 37 grados centígrados durante 12 a 16 horas. Aspire cuidadosamente el tejido digerido y fílelo a través de un colador de células de 70 micras para eliminar cualquier parte no digerida. Centrifugar el filtrado en un tubo de centrífuga de 15 mililitros a 150 veces g durante cinco minutos.Retire el sobrenadante antes de lavar el pellet celular con DMEM bajo en glucosa dos veces. Vuelva a suspender el pellet en DMEM completo, también conocido como medio de expansión. Sembrar las células en una placa de Petri de 150 milímetros y cultivarlas en los medios de expansión suplementados con cinco nanogramos por mililitro de factor de crecimiento de fibroblastos básico, o BFGF, y 50 microgramos por mililitro de sal trisódica de ácido 2-fosfo-L-ascórbico.Incubar las células a 37 grados centígrados en una incubadora de dióxido de carbono al 5% para permitir que las células se adhieran y proliferen. Controle la unión y el crecimiento de las células diariamente. Para un correcto mantenimiento y expansión de los IFP-MSCs, cambie los medios cada tres días.Mientras cambia el medio, agregue cinco nanogramos por mililitro BFGF y 50 microgramos por milímetro de sal trisódica de ácido 2-Phospho-L-ascórbico directamente a la placa de Petri. Una vez que las células se vuelven 80% a 90% confluentes, subcultivarlas eliminando los medios de expansión de la placa de Petri y lavando las células con 1X PBS. Luego agregue cuatro mililitros de 0.25% de tripsina-EDTA al plato e incube las células a 37 grados centígrados en una incubadora de dióxido de carbono al 5%.Después de cuatro minutos, golpee la placa de lado para desalojar las celdas. Confirme el desprendimiento completo de todas las células bajo un microscopio. Una vez confirmado, agregue un volumen igual de medios de expansión para neutralizar la tripsina.Use una pipeta para recoger estas células disociadas en un tubo fresco de polipropileno de 15 mililitros y centrifugarlas a 150 veces g durante cinco minutos a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en el volumen deseado de medios de expansión. Cuente las células utilizando el método estándar de conteo de células y subcultive para una mayor expansión a una densidad de siembra de 10, 000 células por centímetro cuadrado en una placa de Petri de 150 mililitros.Para todos los ensayos, utilice una monocapa confluente de células de paso número P2 a P5. Cuando las células expandidas alcancen una confluencia del 80% al 90%, disocie las células usando solución de tripsina-EDTA antes de peletizarlas en un tubo de centrífuga de 15 mililitros a 150 veces g durante cinco minutos. Luego resuspender el pellet en plasma de cabra a una densidad de 2 millones de células por 50 microlitros. Agregue 50 microlitros de plasma que contengan las células en una placa de Petri esterilizada de 90 milímetros, seguida de la adición de cloruro de calcio a una concentración final de 0.3%Mezcle bien para fabricar hidrogel de plasma reticulado.Después de incubar el hidrogel fabricado a 37 grados centígrados durante 40 minutos, transfiera los hidrogeles a placas de cultivo de tejido de 24 pocillos que contengan medios condrogénicos. Cambie los medios cada tres días durante 14 días. Los hidrogeles cultivados en medios DMEM completos sin TGF-beta 1 se consideran controles no inducidos.Después de 14 días de diferenciación condrogénica de células en hidrogel plasmático, lave los hidrogeles tres veces con PBS durante cinco minutos cada uno y fije las muestras en formalina tamponada neutra durante tres horas. Las IFP-MSC aisladas fueron homogéneamente adherentes y alcanzaron una morfología alargada dentro de las 24 horas del cultivo in vitro. Las células proliferaron eficientemente entre el 80% y el 90% de confluencia dentro de los seis días de expansión y mostraron capacidad clonogénica, lo que indica capacidades proliferativas y de autorenovación eficientes.Cuando se trataron para diferenciarse en linaje adipogénico, las células aisladas produjeron gotas de lípidos, lo que se confirmó mediante la tinción Oil Red O en los días 14 y 21. Tales gotas de aceite no eran visibles en las células sin factores inductores adipogénicos. Las células aisladas encapsuladas en hidrogel plasmático mostraron que la formación de neotejido blanco y brillante después de 14 días en el grupo inducido mostró el potencial condrogénico.El grupo no inducido tenía tejido blanco pálido con brillo reducido. Además, la tinción histológica positiva para el azul de Alcian y la safranina O en el grupo inducido indicó que las células podrían secretar glicosaminoglicanos sulfatados, uno de los principales componentes de la matriz del cartílago. En contraste, las secciones de hidrogel de los grupos no inducidos fueron negativas para la tinción de Safranina O y Azul de Alciano, confirmando el potencial de diferenciación condrogénica de las células madre mesenquimales solo en presencia de estímulos condrogénicos.Las células aisladas inducidas con medios osteogénicos mostraron tinción positiva para fosfatasa alcalina, confirmando la mineralización al final de 14 días. Después de 28 días de inducción osteogénica, se observaron las deposiciones calcificadas con tinción Alizarin Red S. Los resultados subrayaron el potencial de diferenciación de las células inducidas en linajes adipogénicos, condrogénicos y osteogénicos.Es esencial procesar la muestra en condiciones asépticas para evitar la contaminación. También es importante identificar la ubicación correcta de la rótula. Este procedimiento abre la vía para aislar varios tipos de células, como condrocitos articulares, fibroblastos de ligamentos y células madre de membrana sinovial y líquido sinovial, teniendo amplias aplicaciones en medicina regenerativa.Después del aislamiento de IFP-MSC utilizando esta técnica, su efectividad se investigó particularmente para la regeneración de tejidos musculoesqueléticos, como cartílago, hueso y ligamento utilizando enfoques sin andamios y andamios.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

Microcápsulas de alginato como una plataforma 3D para la propagación y diferenciación de las células estaminales embrionarias humanas (CMEH) para los diferentes linajes

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Investigación

Bioingeniería

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

Desarrollo, la expansión y<em&gt; En vivo</em&gt; Monitoreo de las células NK humanas a partir de células madre embrionarias humanas (hESCs) y y células madre pluripotentes inducidas (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on Poly(&#949;-caprolactone) Electrospun Yarns

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on PolyÃƒÅ½Ã‚Âµ-caprolactone Electrospun Yarns

Optimización de unión de las células madre mesenquimales humanas en poli (ε-caprolactona) electrohiladas Hilos

Research into biomaterials and tissue engineering often includes cell-based in vitro investigations, which require initial knowledge of the starting cell ...

Scaffold-supported Transplantation of Islets in the Epididymal Fat Pad of Diabetic Mice

Transplante de islotes en el cojín de grasa epididimal de ratones diabéticos

Islet transplantation has been clinically proven to be effective at treating type 1 diabetes. However, the current intrahepatic transplantation strategy ...

Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells

Aislamiento de células madre mesenquimatosas del periostio Alveolar humano y efectos de la vitamina D en la actividad osteogénica de células derivadas del periostio

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the ...

Exploring the Potential of Mesenchymal Stem Cell Sheet on The Development of Hepatocellular Carcinoma In Vivo

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Explorar el potencial de la hoja de células madre mesenquimales en el desarrollo de Carcinoma Hepatocelular en Vivo

An in vivo animal model that mimics human cancer could have various applications that deliver significant clinical information. The currently used ...

Construction and Use of an Electrical Stimulation Chamber for Enhancing Osteogenic Differentiation in Mesenchymal Stem/Stromal Cells In Vitro

Construcción y uso de una cámara de estimulación eléctrica para mejorar la diferenciación osteogénica de células madre mesenquimales, estromales In Vitro

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) have been used extensively to promote bone healing in tissue engineering approaches. Electrical stimulation (EStim) ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Medición del potencial de acción óptica unicelular en cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Generation of Human Blood Vessel Organoids from Pluripotent Stem Cells

Generación de organoides de vasos sanguíneos humanos a partir de células madre pluripotentes

An organoid is defined as an engineered multicellular in vitro tissue that mimics its corresponding in vivo organ such that it can be used to study ...

Creation of a Knee Joint-on-a-Chip for Modeling Joint Diseases and Testing Drugs

Creación de una articulación de rodilla en un chip para modelar enfermedades articulares y probar medicamentos

The high prevalence of debilitating joint diseases like osteoarthritis (OA) poses a high socioeconomic burden. Currently, the available drugs that target ...