Name: isolation, expansion, and differentiation of mesenchymal stem cells from the infrapatellar fat pad of the goat stifle joint
Uploaded: 2022-08-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Expansion, and Differentiation of Mesenchymal Stem Cells from the Infrapatellar Fat Pad of the Goat Stifle Joint at JoVE.com

SH erkänner stöd från Institute Post-Doctoral Fellowship of IIT Kanpur och SYST-bidrag från DST (SEED Division) (SP/YO/618/2018). AM erkänner Indian Institute of Technology-Kanpur (IIT-Kanpur) för ett institutstipendium. DSK erkänner Gireesh Jankinaths professur och institutionen för bioteknik, Indien, för finansiering (BT/PR22445/MED/32/571/2016). AM, SH och DSK tackar Mehta Family Center for Engineering in Medicine vid IIT-Kanpur för deras generösa stöd.

Protokollet är baserat på isolering av IFP-MSC från getter. Get IFP och blod samlades in från ett lokalt slakteri. Eftersom sådana vävnadssamlingar ligger utanför en institutionell djurförsöksetisk kommittés ansvarsområde krävdes inget etiskt godkännande.
1. Isolering av IFP-MSC från den femorotibiala leden i getknäet
<ol><li>Samla get femorotibial led (prov) som omfattar ~ 15 cm var och en av lårbens- och tibialregionerna i bakbenen. Lägg omedelbart provet ...

I detta protokoll har en enkel, pålitlig och reproducerbar metod för isolering av MSC från get-IFP tillhandahållits. Celler isolerade med denna metod har framgångsrikt använts i våra tidigare studier för vävnadsregenerering in vitro. Det observerades att de isolerade cellerna var proliferativa, reagerade på olika tillväxtfaktorer och behöll sin biologiska aktivitet när de såddes på elektrospunfibrer och byggnadsställningar25,26. Dessutom ...

Mesenkymala stamceller (MSC) är en attraktiv kandidat för cellbaserade terapier inom regenerativ medicin 1,2. De kan skördas från en mängd olika vävnadskällor såsom benmärg, navelsträng, placenta, tandmassa och subkutan fettvävnad3. Eftersom tillgången på stamceller hos vuxna är begränsad och deras isoleringsförfarande ofta är invasivt (vilket resulterar i sjuklighet på donatorstället) är det önskvärt att ha en alternativ stamcellskälla som kan kringgå dessa utmaningar.
Knäleden är en depå av olika celltyper, såsom infrapatellar fettkudde-härledda MSC, synovialmembran-härledda MSC, synovialvätske-härledda MSC, ligamentfibroblaster, ledade kondrocyter, etc 4,5,6. Dessa celler har potential att utforskas i stor utsträckning inom muskuloskeletal vävnadsteknikbaserad forskning. Därför kan knäleden vara en möjlig och pålitlig källa till flera typer av MSC: er. Fettdepå i knäleden, känd som infrapatellär fettkudde (IFP) eller Hoffas fettkudde, är ett lovande och alternativt val av MSC-depå. IFP är en relativt lättillgänglig och kliniskt erhållbar källa till MSC, eftersom den rutinmässigt resekteras och kasseras som kirurgiskt avfall under knäartroskopi eller öppen knäkirurgi. Avlägsnande av IFP är förknippat med minimal sjuklighet på donatorplatsen, vilket också gör det till en attraktiv vävnadskälla. Även om MSC från IFP (IFP-MSC) har en liknande fenotypisk profil har de förbättrad klonogen potential jämfört med benmärgshärledda mesenkymala stamceller (BM-MSC)6 och bättre proliferativ kapacitet jämfört med subkutana fett-härledda stamceller (ADSC)7. Intressant nog, jämfört med synovialvätske-härledda MSC (SF-MSC), förlorar IFP-MSC inte sin proliferativa kapacitet vid sena passager, och fördubblingstiden ökar inte heller vid sena passager. Detta tyder på att IFP-MSC under cellutvidgning kan uppnå ett tillräckligt stort antal celler för in vitro-vävnadstekniska tillämpningar utan att kompromissa med deras spridningshastighet8. Nya studier har också föreslagit att IFP-MSC har överlägsen kondrogen differentieringspotential jämfört med benmärgshärledda MSC (BMSC) och fett-härledda MSC (ADSC), troligen på grund av deras anatomiska närhet till ledbrosk, vilket indikerar deras lämplighet för broskvävnadsteknik 6,7,9,10. Dessutom har de också åldersoberoende osteogen differentieringspotential11. Intraartikulär injektion av IFP-MSC har visat sig minska smärta och förbättra knäledsfunktioner hos patienter med artros (OA)12,13. Vidare har starka immunsuppressiva svar och förbättrade immunmodulerande egenskaper hos IFP-MSC i närvaro av inflammatoriska cytokiner under patologiska tillstånd också rapporterats6.
IFP-MSC är en lovande och alternativ källa till MSC; emellertid är deras terapeutiska fördel inom vävnadsteknik och regenerativ medicin relativt mindre utforskad. De befintliga studierna på IFP-MSC har i stor utsträckning använt celler från mänskliga givare. Bland dessa har några nyligen genomförda studier undersökt IFP-MSC från friska mänskliga givare (icke-artritiska patienter, i åldern 17-60 år)6,14, medan de flesta studierna har använt IFP-MSC från åldrade patienter som genomgår total knäbyteskirurgi (sjuka patienter, ålder 70-80 år). Eftersom både ålder och sjukdom är kända för att förändra stamcellernas normala funktion (minskat antal och förlust av funktionell potential) kan detta potentiellt leda till inkonsekvenser i resultatet av de MSC-baserade studierna 7,15,16,17. Utöver detta utgör användningen av IFP-MSC från patienter med patofysiologiska tillstånd (t.ex. artrit och fetma) också svårigheter att förstå de grundläggande egenskaperna hos friska celler in vitro och fungerar därmed som en begränsande faktor i utvecklingen av MSC-baserade terapier. För att övervinna dessa problem är användningen av IFP-MSC från friska givare avgörande. Eftersom tillgången till en frisk mänsklig donator är utmanande kan djurmodeller vara ett bättre alternativ. I detta avseende finns det några studier där IFP har isolerats från möss18. På grund av fettkuddens lilla storlek hos normala möss har dock fettvävnader från flera djur kombinerats för att få tillräckligt med vävnad för att utföra detaljerade experimentella procedurer19. Därför finns det ett behov av en stor djurmodell, som kan uppfylla kravet på det högre antalet celler och samtidigt följa 3R-principerna (förfina, ersätta och minska) i djurförsök20. Användningen av stora djur har betydande konsekvenser i translationell forskning. Specifikt, inom muskuloskeletal vävnadsteknik, har en rad stora djur som hundar, grisar, får, getter och hästar undersökts21. Get (Capra aegagrus hircus) är ett utmärkt val av stora djur eftersom dess kvävningsled har den närmaste anatomin till den mänskliga knäleden22,23,24. Den subkondrala bentrabekulära strukturen och subkondrala bentjockleken hos getter liknar människor, och andelen brosk till ben rapporteras också vara nära människor21. Dessutom har getter tämjts i stor utsträckning över hela världen, vilket gör dem lättillgängliga när de är skelettmogna. Vidare har låga underhållskostnader och enkel hantering gjort dem till en attraktiv djurmodell för forskning22.
I denna studie demonstreras ett enkelt protokoll för isolering av IFP-MSC från kvävningsleden av Capra aegagrus hircus (get) och in vitro-odlingsförhållanden för deras expansion och differentiering. De isolerade cellerna är vidhäftande, har MSC-liknande morfologi, bildar CFU-F-kolonier (kolonibildande enhetsfibroblast) och har adilogen, kondrogen och osteogen differentieringspotential. Därför visar IFP-MSC potential som en alternativ källa till MSC för biomedicinska applikationer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#946;-glycerophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9422-10G</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin- 0.02% EDTA</td>
			<td>Hi-Media</td>
			<td>TCL049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15-mL centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>49752-10G</td>
			<td>50 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TCL021-50ml</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50-mL centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian Blue</td>
			<td>Hi-Media</td>
			<td>RM471</td>
			<td>For sufated gycosaminoglycans staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alizarin Red S</td>
			<td>S D Fine-Chem Limited</td>
			<td>26048-25G</td>
			<td>For calcium deposition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>A011</td>
			<td>2.5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic fibroblast growth factor (bFGF)</td>
			<td>Sino Biologicals</td>
			<td>10014-HNAE</td>
			<td>5 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCIP/NBT ALP Substrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B5655-5TAB</td>
			<td>For ALP staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>MB-083</td>
			<td>Long name: Bovine Serum Albumin (1.25 mg/mL )</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TCP-182</td>
			<td>70 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>REMI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin</td>
			<td>RANBAXY LAB. Limited</td>
			<td>B17407T1</td>
			<td>2.5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Violet</td>
			<td>S D Fine-Chem Limited</td>
			<td>42555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.94925.0521</td>
			<td>25 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2915</td>
			<td>1 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM LG</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D5523</td>
			<td>Long name: Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Media Low Glucose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270</td>
			<td>Long name: Fetal Bovine Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution 37%-41%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>61780805001730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indomethacin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7378</td>
			<td>100 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I9278</td>
			<td>10 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon Eclipse TS 100</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS + 1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2521-5mL</td>
			<td>Long name: insulin, transferrin, sodium selenite + linoleic-BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Proline</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TO-109-25G</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>61751605001730</td>
			<td>For lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Meck</td>
			<td>1.07018.2521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes and sterile tips (20 &#181;L, 200 &#181;L, 1000 &#181;L)</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MUSE Cell analyser</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td></td>
			<td>For cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT compound</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>4583</td>
			<td>Long name: Optimal Cutting Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red O dye</td>
			<td>S D Fine-Chem Limited</td>
			<td>54304</td>
			<td>For lipid vacuole staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>A007</td>
			<td>100 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (150 mm and 90 mm)</td>
			<td>NEST</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safranin O</td>
			<td>S D Fine-Chem Limited</td>
			<td>50240</td>
			<td>For sufated gycosaminoglycans staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3434</td>
			<td>3.4 % (w/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile scissors, forceps and scalpels</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For isolation of IFP-MSC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.94953.0521</td>
			<td>35 % (w/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF-&#946;1</td>
			<td>Sino Biologicals</td>
			<td></td>
			<td>Long name: Transforming growth factor- &#946;1 (10 ng/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture incubator 37 &#176;C, 5% CO2</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris buffer</td>
			<td>Merck</td>
			<td>61771405001730</td>
			<td>For lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>S D Fine-Chem Limited</td>
			<td>40632</td>
			<td>For lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type II collagenase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17101015</td>
			<td>1.5 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin D3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9756-1G</td>
			<td>10 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Well plates (6 -WP and 24-WP)</td>
			<td>NEST</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, expansion, and differentiation of mesenchymal stem cells from the infrapatellar fat pad of the goat stifle joint

IFP, som finns i knäleden, fungerar som en lovande källa till MSC. IFP är en lättillgänglig vävnad eftersom den rutinmässigt resekteras och kasseras under artroskopiska procedurer och knäbytesoperationer. Dessutom är dess borttagning förknippad med minimal sjuklighet på givarplatsen. Nya studier har visat att IFP-MSC inte förlorar sin spridningskapacitet under in vitro-expansion och har åldersoberoende osteogen differentieringspotential. IFP-MSC har överlägsen kondrogen differentieringspotential jämfört med benmärgshärledda MSC (BMSC) och fett-härledda stamceller (ADSC). Även om dessa celler lätt kan erhållas från åldrade och sjuka patienter, är deras effektivitet begränsad. Därför är det viktigt att använda IFP-MSC från friska givare för att bestämma deras effektivitet i biomedicinska applikationer. Eftersom tillgången till en frisk mänsklig donator är utmanande kan djurmodeller vara ett bättre alternativ för att möjliggöra grundläggande förståelse. Stora djur som hundar, hästar, får och getter spelar en avgörande roll i translationell forskning. Bland dessa kan geten vara en föredragen modell eftersom getens kvävningsled har den närmaste anatomin till den mänskliga knäleden. Dessutom kan get-IFP uppfylla de högre MSC-nummer som behövs för vävnadsregenereringsapplikationer. Dessutom gör låg kostnad, tillgänglighet och efterlevnad av 3R-principerna för djurförsök dem till en attraktiv modell. Denna studie visar ett enkelt protokoll för att isolera IFP-MSC från kvävningsfogen av getter och in vitro-odlingsförhållanden för deras expansion och differentiering. Den aseptiskt isolerade IFP från geten tvättades, maledes och smältes enzymatiskt. Efter filtrering och centrifugering odlades de uppsamlade cellerna. Dessa celler var vidhäftande, hade MSC-liknande morfologi och visade anmärkningsvärd klonogen förmåga. Vidare differentierade de sig till adipogena, kondrogeniska och osteogena släktlinjer, vilket visade deras multipotens. Sammanfattningsvis visar studien isolering och expansion av MSC, som visar potential inom vävnadsteknik och regenerativ medicin.

Isolering av IFP-MSC från getens femorotibiala led Stegen som är involverade i isoleringen av IFP-MSC från kvävningsleden hos en get visas i figur 1. Fettkudden som finns i den inre icke-artikulerande ytan av patella avlägsnades, maledes och smältes enzymatiskt. IFP-MSC:erna isolerades framgångsrikt och odlades in vitro (figur 2A).
Expansion och klonogen förmåga hos IFP-MSC De ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Expansion, and Differentiation of Mesenchymal Stem Cells from the Infrapatellar Fat Pad of the Goat Stifle Joint at JoVE.com

Isolation, Expansion, and Differentiation of Mesenchymal Stem Cells from the Infrapatellar Fat Pad of the Goat Stifle Joint

Infrapatellar fettkudde mesenkymala stamceller (IFP-MSC) kan enkelt isoleras från knäledens infrapatellära fettkudde. De sprider sig väl in vitro, bildar CFU-F-kolonier och differentierar till adilogen, kondrogen och osteogen härstamning. Häri tillhandahålls metoden för isolering, expansion och differentiering av IFP-MSC från getkvävningsled.

Isolering, expansion och differentiering av mesenkymala stamceller från den infrapatellära fettkudden i getkvävningsleden

The IFP, present in the knee joint, serves as a promising source of MSCs. The IFP is an easily accessible tissue as it is routinely resected and discarded ...

Infrapatellar Fat Pad-härledda mesenkymala stamceller, eller kort sagt, IFP-MSC, är en relativt mindre studerad stamcellstyp. Detta protokoll är en enkel, pålitlig och reproducerbar metod som visar isoleringen av IFP-MSC från getkvävningsled. Den största fördelen med tekniken är att ett stort antal högkvalitativa IFP-MSC kan erhållas.Isolerade IFP-MSC kan differentieras till flera linjer och ha omfattande regenerativ potential. På grund av deras anatomiska läge har IFP-MSC fått intresse för att reparera broskdefekter och lindra brosknedbrytning vid artros. Metoden har implikationer för cellbaserad terapi inom vävnadsteknik och regenerativ medicin.Förfarandet för isolering, expansion och differentiering av IFP-MSC kommer att demonstreras av Dr.Sugata Hazra och Mr.Aman Mahajan. För att påbörja isoleringen av Infrapatellar Fat Pad Mesenchymal Stem Cells, eller IFP-MSCs, samla getfemorotibiala leder som omfattar cirka 15 centimeter av lårbens- och tibialregionerna i bakbenen i en steriliserad uppsamlingsprovlåda. Förvara provet vid fyra grader Celsius för transport till laboratoriet för vidare bearbetning.Placera provet på en 150 millimeter petriskål och se till att bearbeta provet aseptiskt och ett biosäkerhetsskåp under hela proceduren. Skölj det noggrant med autoklaverad PBS kompletterad med antibiotika. Håll provet hydratiserat med PBS.Undersök noggrant de anatomiska regionerna i provet. För enkel åtkomst, ta bort de extra vävnaderna från båda de långa benen helt genom att hålla lårbenets ändyta med ena handen och skära den i längdriktningen mot leden med en skarp sax. Sedan, utan att störa vävnaden som omger ledkapseln, ta bort musklerna och fettvävnaden från benet.På samma sätt gör du ett annat snitt vid tibialänden av provet och tar bort musklerna och fettvävnaden från tibialbenet. Se till att båda de långa benen är helt exponerade och att ledkapseln är synlig. Gör sedan ett snitt från vardera sidan av synovialmembranet för att skära upp ledleden.Skär loss patella från synovialmembranet och patellarbanden med färska steriliserade saxar och pincett. Placera omedelbart den separerade patellaen i en petriskål som innehåller PBS. Från den separerade patellaen, ta bort hela fettkudden som finns på den inre ytan med sax och pincett.Samla den i en annan färsk petriskål och hacka den med en skalpell. Inkludera andra kirurgiska verktyg för att få de små fettsegmenten på cirka två till tre millimeter. Använd en spatel för att överföra malet vävnad till ett 50-ml centrifugrör och tvätta det tre gånger med PBS kompletterat med antibiotika i 15 minuter vid rumstemperatur med en provrörsblandare.För enzymatisk matsmältning, inkubera cirka fem gram av malet vävnad i Dulbeccos Modified Eagle Media, eller DMEM, lågglukosmedium som innehåller 1.5 milligram per milliliter typ II kollagenas och 2% FBS vid 37 grader Celsius i 12 till 16 timmar. Aspirera försiktigt den smälta vävnaden och filtrera den genom en 70-mikron cellsil för att ta bort alla osmälta delar. Centrifugera filtratet i ett 15-milliliters centrifugrör vid 150 gånger g i fem minuter.Ta bort supernatanten innan du tvättar cellpelleten med DMEM-låg glukoshalt två gånger. Stäng av pelleten i komplett DMEM, även känd som expansionsmedia. Frö cellerna på en 150-millimeter petriskål och odla dem i expansionsmediet kompletterat med fem nanogram per milliliter Basic Fibroblast Growth Factor, eller BFGF, och 50 mikrogram per milliliter 2-fosfo-L-askorbinsyra trinatriumsalt.Inkubera cellerna vid 37 grader Celsius i en 5% koldioxidinkubator så att cellerna kan fästa och sprida sig. Övervaka cellernas bilaga och tillväxt dagligen. För korrekt underhåll och expansion av IFP-MSC: erna, byt media var tredje dag.När du byter media, tillsätt färska fem nanogram per milliliter BFGF och 50 mikrogram per millimeter 2-fosfo-L-askorbinsyra trinatriumsalt direkt till petriskålen. När cellerna blir 80% till 90% sammanflytande, subkulturera dem genom att ta bort expansionsmediet från petriskålen och tvätta cellerna med 1X PBS. Tillsätt sedan fyra milliliter 0,25% Trypsin-EDTA till skålen och inkubera cellerna vid 37 grader Celsius i en 5% koldioxidinkubator.Efter fyra minuter trycker du på plattan på sidan för att lossa cellerna. Bekräfta fullständig frigöring av alla celler under ett mikroskop. När det har bekräftats lägger du till en lika stor volym expansionsmedia för att neutralisera trypsinet.Använd en pipett för att samla dessa dissocierade celler i ett nytt 15-milliliter polypropenrör och centrifugera dem vid 150 gånger g i fem minuter vid rumstemperatur. Kassera supernatanten och återsuspendera pelleten i önskad volym expansionsmedia. Räkna cellerna med hjälp av standardcellräkningsmetoden och subkulturera dem för vidare expansion vid en sådddensitet på 10 000 celler per kvadratcentimeter i en 150-milliliters petriskål.För alla analyser, använd ett sammanflytande monolager av celler med passagenummer P2 till P5. När de expanderade cellerna når 80% till 90% sammanflöde, dissociera cellerna med Trypsin-EDTA-lösning innan du pelleterar dem ner i ett 15-milliliters centrifugrör vid 150 gånger g i fem minuter. Återsuspendera sedan pelleten i getplasma med en densitet av 2 miljoner celler per 50 mikroliter. Tillsätt 50 mikroliter plasma som innehåller cellerna på en steriliserad 90-millimeter petriskål, följt av tillsats av kalciumklorid i en slutlig koncentration av 0,3%Blanda väl för att tillverka tvärbunden plasmahydrogel.Efter inkubation av den tillverkade hydrogelen vid 37 grader Celsius i 40 minuter, överför hydrogelerna till 24-brunns vävnadsodlingsplattor innehållande kondrogena medier. Byt media var tredje dag i 14 dagar. Hydrogelerna odlade i kompletta DMEM-medier utan TGF-beta 1 anses vara oinducerade kontroller.Efter 14 dagars kondrogen differentiering av celler i plasmahydrogel, tvätta hydrogelerna tre gånger med PBS i fem minuter vardera och fixera proverna i neutralt buffrat formalin i tre timmar. Isolerade IFP-MSC var homogent vidhäftande och uppnådde långsträckt morfologi inom 24 timmar efter in vitro-odling. Cellerna prolifererade effektivt 80% till 90% sammanflöde inom sex dagar efter expansion och visade klonogen kapacitet, vilket indikerar effektiv proliferativ och självförnyelseförmåga.När de behandlades för att differentiera till adipogen härstamning producerade de isolerade cellerna lipiddroppar, vilket bekräftades av Oil Red O-färgning på dag 14 och 21. Sådana oljedroppar var inte synliga i cellerna utan adipogenic inducerande faktorer. De isolerade cellerna inkapslade i plasmahydrogel visade bildandet av vit och blank neo-vävnad efter 14 dagar i den inducerade gruppen visade den kondrogena potentialen.Den oinducerade gruppen hade blek vit vävnad med minskad glans. Dessutom indikerade positiv histologisk färgning för Alcian Blue och Safranin O i den inducerade gruppen att cellerna kunde utsöndra sulfaterade glykosaminoglykaner, en av huvudkomponenterna i broskmatrisen. Däremot var hydrogelsektionerna från de oinducerade grupperna negativa för Safranin O och Alcian Blue-färgning, vilket bekräftade den kondrogena differentieringspotentialen hos de mesenkymala stamcellerna endast i närvaro av kondrogena stimuli.De isolerade cellerna inducerade med osteogena medier visade positiv färgning för alkaliskt fosfatas, vilket bekräftade mineralisering i slutet av 14 dagar. Efter 28 dagars osteogen induktion observerades de förkalkade avsättningarna med Alizarin Red S-färgning. Resultaten underströk differentieringspotentialen hos inducerade celler till adiloga, kondrogena och osteogena släktlinjer.Det är viktigt att bearbeta provet under aseptiska förhållanden för att undvika kontaminering. Det är också viktigt att identifiera den korrekta platsen för patella. Denna procedur öppnar vägen för att isolera olika celltyper, såsom ledkondrocyter, ligamentfibroblaster och stamceller från synovium och synovialvätska, med breda tillämpningar inom regenerativ medicin.Efter isolering av IFP-MSC med hjälp av denna teknik undersöktes dess effektivitet särskilt för regenerering av muskuloskeletala vävnader, såsom brosk, ben och ligament med hjälp av byggnadsställningar och ställningsfria metoder.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

Alginat mikrokapselkomposition som en 3D-plattform för förökning och differentiering av mänskliga embryonala stamceller (hESC) till olika linjer

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

Utveckling, expansion och<em&gt; In vivo</em&gt; Övervakning av humana NK celler från mänskliga embryonala stamceller (hESCs) och och inducerad pluripotenta stamceller (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on Poly(&#949;-caprolactone) Electrospun Yarns

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on PolyÃƒÅ½Ã‚Âµ-caprolactone Electrospun Yarns

Optimera Utmätning av Human mesenkymala stamceller på Poly (ε-kaprolakton) Electrospun Garner

Research into biomaterials and tissue engineering often includes cell-based in vitro investigations, which require initial knowledge of the starting cell ...

Scaffold-supported Transplantation of Islets in the Epididymal Fat Pad of Diabetic Mice

Byggnadsstödd transplantation av islen i epididymisk fettmatta av diabetiska möss

Islet transplantation has been clinically proven to be effective at treating type 1 diabetes. However, the current intrahepatic transplantation strategy ...

Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells

Isolering av mesenkymala stamceller från mänskliga alveolära periostet och effekter av D-Vitamin på osteogent aktivitet av periostet-derived celler

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the ...

Exploring the Potential of Mesenchymal Stem Cell Sheet on The Development of Hepatocellular Carcinoma In Vivo

Exploring the Potential of Mesenchymal Stem Cell Sheet on The Development of Hepatocellular Carcinoma In Vivo

Utforska potentialen i mesenkymala stamceller ark på utveckling av Hepatocellulär cancer In Vivo

An in vivo animal model that mimics human cancer could have various applications that deliver significant clinical information. The currently used ...

Construction and Use of an Electrical Stimulation Chamber for Enhancing Osteogenic Differentiation in Mesenchymal Stem/Stromal Cells In Vitro

Konstruktion och användning av en elektrisk stimulering kammare för att förbättra osteogent differentiering i mesenkymala stamceller/stromaceller In Vitro

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) have been used extensively to promote bone healing in tissue engineering approaches. Electrical stimulation (EStim) ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Encellig optisk åtgärd potentiell mätning hos mänskliga inducerade pluripotenta stamcellsbaserade kardiomyocyter

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Generation of Human Blood Vessel Organoids from Pluripotent Stem Cells

Generering av humana blodkärlsorganoider från pluripotenta stamceller

An organoid is defined as an engineered multicellular in vitro tissue that mimics its corresponding in vivo organ such that it can be used to study ...

Creation of a Knee Joint-on-a-Chip for Modeling Joint Diseases and Testing Drugs

Skapande av en knäled-på-ett-chip för modellering av ledsjukdomar och testning av läkemedel

The high prevalence of debilitating joint diseases like osteoarthritis (OA) poses a high socioeconomic burden. Currently, the available drugs that target ...