Name: isolation, expansion, and differentiation of mesenchymal stem cells from the infrapatellar fat pad of the goat stifle joint
Uploaded: 2022-08-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Expansion, and Differentiation of Mesenchymal Stem Cells from the Infrapatellar Fat Pad of the Goat Stifle Joint at JoVE.com

SH, IIT Kanpur Enstitüsü Doktora Sonrası Bursu ve DST'den (SEED Bölümü) SYST hibesinin desteğini kabul etmektedir (SP / YO / 618 / 2018). , Hindistan Teknoloji Enstitüsü-Kanpur'u (IIT-Kanpur) bir Enstitü bursu için kabul eder. DSK, Gireesh Jankinath Başkan Profesörlüğünü ve Hindistan Biyoteknoloji Bölümü'nü finansman için kabul etti (BT/PR22445/MED/32/571/2016). , SH ve DSK, IIT-Kanpur'daki Mehta Tıp Mühendisliği Aile Merkezi'ne cömert destekleri için teşekkür eder.

Protokol, IFP-MSC'lerin keçilerden izole edilmesine dayanmaktadır. Keçi IFP ve kanı yerel bir mezbahadan toplandı. Bu tür doku koleksiyonları Kurumsal Hayvan Etiği Kurulu'nun görev alanı dışında olduğundan, etik onay gerekmemiştir.
1. IFP-MSC'lerin keçi dizinin femorotibial ekleminden izolasyonu
<ol><li>Arka bacakların femoral ve tibial bölgelerinin her birini ~ 15 cm kapsayan keçi femorotibial eklemini (örnek) toplayın. Numuneyi derhal sterilize edilmi?...

Mevcut protokolde, MSC'lerin keçi IFP'den izolasyonu için basit, güvenilir ve tekrarlanabilir bir yöntem sağlanmıştır. Bu yöntemle izole edilen hücreler, in vitro doku rejenerasyonu için önceki çalışmalarımızda başarıyla kullanılmıştır. İzole edilen hücrelerin proliferatif oldukları, çeşitli büyüme faktörlerine yanıt verdikleri ve elektrospun lifleri ve iskeleler üzerine tohumlandıklarında biyolojik aktivitelerini korudukları gözlenmiştir25,26</s...

Mezenkimal kök hücreler (MSC'ler) rejeneratif tıpta hücre bazlı tedaviler için cazip bir adaydır 1,2. Kemik iliği, göbek kordonu, plasenta, diş pulpası ve deri altı yağ dokusu gibi çeşitli doku kaynaklarından toplanabilirler3. Bununla birlikte, yetişkinlerde kök hücrelerin mevcudiyeti sınırlı olduğundan ve izolasyon prosedürleri genellikle invaziv olduğundan (donör bölge morbiditesine neden olduğundan), bu zorlukları aşabilecek alternatif bir kök hücre kaynağına sahip olmak arzu edilir.
Diz eklemi, infrapatellar yağ yastığı kaynaklı MSC'ler, sinovyal membran kaynaklı MSC'ler, sinovyal sıvı kaynaklı MSC'ler, ligament fibroblastları, eklem kondrositleri vb. 4,5,6 gibi çeşitli hücre tiplerinin bir deposudur. Bu hücreler, kas-iskelet sistemi doku mühendisliğine dayalı araştırmalarda yaygın olarak araştırılma potansiyeline sahiptir. Bu nedenle, diz eklemi birden fazla MSC tipinin olası ve güvenilir bir kaynağı olabilir. İnfrapatellar yağ yastığı (IFP) veya Hoffa'nın yağ yastığı olarak bilinen diz ekleminde bulunan yağ deposu, MSC deposunun umut verici ve alternatif bir seçimidir. IFP, diz artroskopisi veya açık diz cerrahisi sırasında rutin olarak rezeke edildiği ve cerrahi atık olarak atıldığı için nispeten kolay erişilebilir ve klinik olarak elde edilebilir bir MSC kaynağıdır. IFP'nin çıkarılması minimal donör bölgesi morbiditesi ile ilişkilidir ve bu da onu çekici bir doku kaynağı haline getirir. Benzer bir fenotipik profile sahip olmakla birlikte, IFP'den (IFP-MSC'ler) MSC'ler, kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücrelerle (BM-MSC'ler)6 karşılaştırıldığında klonojenik potansiyeli arttırmış ve deri altı adipoz türevi kök hücrelere (ADSC'ler)7 kıyasla daha iyi proliferatif kapasiteye sahiptir. İlginç bir şekilde, sinovyal sıvı kaynaklı MSC'lerle (SF-MSC'ler) karşılaştırıldığında, IFP-MSC'ler geç pasajlarda proliferatif kapasitelerini kaybetmez ve geç pasajlarda iki katına çıkma süresi artmaz. Bu, hücre genişlemesi sırasında, IFP-MSC'lerin proliferasyon hızlarından ödün vermeden in vitro doku mühendisliği uygulamaları için yeterince fazla sayıda hücre elde edebileceğini düşündürmektedir8. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, IFP-MSC'lerin, kemik iliği kaynaklı MSC'lere (BMSC'ler) ve adipoz kaynaklı MSC'lere (ADSC'ler) kıyasla, muhtemelen eklem kıkırdağına anatomik yakınlıklarından dolayı, kıkırdak doku mühendisliği için uygunluklarını gösteren 6,7,9,10 ile karşılaştırıldığında üstün kondrojenik farklılaşma potansiyeline sahip olduklarını ileri sürmüştür. Ayrıca, yaştan bağımsız osteojenik farklılaşma potansiyeline de sahiptirler11. IFP-MSC'lerin eklem içi enjeksiyonunun osteoartritli (OA) hastalarda ağrıyı azalttığı ve diz eklemi fonksiyonlarını iyileştirdiği gösterilmiştir 12,13. Ayrıca, patolojik durumlar sırasında inflamatuar sitokinlerin varlığında IFP-MSC'lerin güçlü immünosupresif yanıtları ve gelişmiş immünomodülatör özellikleri de bildirilmiştir6.
IFP-MSC'ler, MSC'lerin umut verici ve alternatif bir kaynağıdır; Bununla birlikte, doku mühendisliği ve rejeneratif tıptaki terapötik yararları nispeten daha az araştırılmıştır. IFP-MSC'ler üzerine yapılan mevcut çalışmalar, insan donörlerinden gelen hücreleri büyük ölçüde kullanmıştır. Bunlar arasında, yakın zamanda yapılan birkaç çalışma, IFP-MSC'leri sağlıklı insan donörlerinden (artritik olmayan hastalar, 17-60 yaş arası)6,14 araştırırken, çalışmaların çoğunda IFP-MSC'ler total diz protezi ameliyatı geçiren yaşlı hastalardan (hastalıklı hastalar, 70-80 yaş) kullanılmıştır. Hem yaşın hem de hastalığın kök hücrelerin normal işleyişini değiştirdiği bilindiğinden (azalmış sayı ve fonksiyonel potansiyel kaybı), bu potansiyel olarak MSC tabanlı çalışmaların sonucunda tutarsızlıklara yol açabilir 7,15,16,17. Buna ek olarak, patofizyolojik koşulları olan hastalardan (örneğin, artrit ve obezite) IFP-MSC'lerin kullanımı da in vitro sağlıklı hücrelerin temel özelliklerini anlamada zorluk çekmekte ve böylece MSC'lere dayalı tedavilerin geliştirilmesinde sınırlayıcı bir faktör olarak işlev görmektedir. Bu sorunların üstesinden gelmek için, IFP-MSC'lerin sağlıklı donörlerden kullanılması hayati önem taşımaktadır. Sağlıklı bir insan donörüne erişim zor olduğundan, hayvan modelleri daha iyi bir alternatif olabilir. Bu bağlamda, IFP'nin farelerden izole edildiği birkaç çalışma vardır18. Bununla birlikte, normal farelerde yağ yastığının küçük boyutu nedeniyle, ayrıntılı deneysel prosedürleri uygulamak için yeterli doku elde etmek için birden fazla hayvandan elde edilen yağ dokuları birleştirilmiştir19. Bu nedenle, daha fazla sayıda hücre gereksinimini karşılayabilecek ve aynı zamanda hayvan araştırmalarında 3R ilkelerine (rafine etme, değiştirme ve azaltma) uyabilecek büyük bir hayvan modeline ihtiyaç vardır20. Büyük hayvanların kullanımı, translasyonel araştırmalarda önemli etkilere sahiptir. Spesifik olarak, kas-iskelet sistemi doku mühendisliğinde, köpekler, domuzlar, koyunlar, keçiler ve atlar gibi bir dizi büyük hayvan araştırılmıştır21. Keçi (Capra aegagrus hircus), boğucu eklemi insan diz eklemine en yakın anatomiye sahip olduğundan büyük hayvanların mükemmel bir seçimidir22,23,24. Keçilerin subkondral kemik trabeküler yapısı ve subkondral kemik kalınlığı insanlara benzer, kıkırdağın kemiğe oranının da insanlara yakın olduğu bildirilmektedir21. Ek olarak, keçiler dünya çapında yaygın olarak evcilleştirilmiştir, bu da iskeletsel olarak olgunlaştıklarında kolayca kullanılabilir hale getirilmiştir. Ayrıca, düşük bakım maliyetleri ve kolay kullanım, onları araştırma için çekici bir hayvan modeli haline getirmiştir22.
Bu çalışmada, IFP-MSC'lerin Capra aegagrus hircus'un (keçi) boğucu ekleminden izolasyonu ve in vitro kültür koşullarının genişlemesi ve farklılaşması için basit bir protokol gösterilmiştir. İzole hücreler yapışıktır, MSC benzeri morfolojiye sahiptir, CFU-F (koloni oluşturan birim-fibroblast) kolonileri oluşturur ve adipojenik, kondrojenik ve osteojenik farklılaşma potansiyeline sahiptir. Bu nedenle, IFP-MSC'ler biyomedikal uygulamalar için alternatif bir MSC kaynağı olarak potansiyel göstermektedir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#946;-glycerophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9422-10G</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin- 0.02% EDTA</td>
			<td>Hi-Media</td>
			<td>TCL049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15-mL centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>49752-10G</td>
			<td>50 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TCL021-50ml</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50-mL centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian Blue</td>
			<td>Hi-Media</td>
			<td>RM471</td>
			<td>For sufated gycosaminoglycans staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alizarin Red S</td>
			<td>S D Fine-Chem Limited</td>
			<td>26048-25G</td>
			<td>For calcium deposition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>A011</td>
			<td>2.5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic fibroblast growth factor (bFGF)</td>
			<td>Sino Biologicals</td>
			<td>10014-HNAE</td>
			<td>5 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCIP/NBT ALP Substrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B5655-5TAB</td>
			<td>For ALP staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>MB-083</td>
			<td>Long name: Bovine Serum Albumin (1.25 mg/mL )</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TCP-182</td>
			<td>70 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>REMI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin</td>
			<td>RANBAXY LAB. Limited</td>
			<td>B17407T1</td>
			<td>2.5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Violet</td>
			<td>S D Fine-Chem Limited</td>
			<td>42555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.94925.0521</td>
			<td>25 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2915</td>
			<td>1 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM LG</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D5523</td>
			<td>Long name: Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Media Low Glucose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270</td>
			<td>Long name: Fetal Bovine Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution 37%-41%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>61780805001730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indomethacin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7378</td>
			<td>100 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I9278</td>
			<td>10 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon Eclipse TS 100</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS + 1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2521-5mL</td>
			<td>Long name: insulin, transferrin, sodium selenite + linoleic-BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Proline</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TO-109-25G</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>61751605001730</td>
			<td>For lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Meck</td>
			<td>1.07018.2521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes and sterile tips (20 &#181;L, 200 &#181;L, 1000 &#181;L)</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MUSE Cell analyser</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td></td>
			<td>For cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT compound</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>4583</td>
			<td>Long name: Optimal Cutting Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red O dye</td>
			<td>S D Fine-Chem Limited</td>
			<td>54304</td>
			<td>For lipid vacuole staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>A007</td>
			<td>100 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (150 mm and 90 mm)</td>
			<td>NEST</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safranin O</td>
			<td>S D Fine-Chem Limited</td>
			<td>50240</td>
			<td>For sufated gycosaminoglycans staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3434</td>
			<td>3.4 % (w/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile scissors, forceps and scalpels</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For isolation of IFP-MSC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.94953.0521</td>
			<td>35 % (w/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF-&#946;1</td>
			<td>Sino Biologicals</td>
			<td></td>
			<td>Long name: Transforming growth factor- &#946;1 (10 ng/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture incubator 37 &#176;C, 5% CO2</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris buffer</td>
			<td>Merck</td>
			<td>61771405001730</td>
			<td>For lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>S D Fine-Chem Limited</td>
			<td>40632</td>
			<td>For lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type II collagenase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17101015</td>
			<td>1.5 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin D3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9756-1G</td>
			<td>10 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Well plates (6 -WP and 24-WP)</td>
			<td>NEST</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, expansion, and differentiation of mesenchymal stem cells from the infrapatellar fat pad of the goat stifle joint

Diz ekleminde bulunan IFP, umut verici bir MSC kaynağı olarak hizmet eder. IFP, artroskopik prosedürler ve diz protezi ameliyatları sırasında rutin olarak rezeke edildiği ve atıldığı için kolay erişilebilir bir dokudur. Ek olarak, çıkarılması minimal donör bölge morbiditesi ile ilişkilidir. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, IFP-MSC'lerin in vitro genişleme sırasında proliferasyon kapasitelerini kaybetmediklerini ve yaştan bağımsız osteojenik farklılaşma potansiyeline sahip olduklarını göstermiştir. IFP-MSC'ler, kemik iliği kaynaklı MSC'lere (BMSC'ler) ve adipoz kaynaklı kök hücrelere (ADSC'ler) kıyasla üstün kondrojenik farklılaşma potansiyeline sahiptir. Bu hücreler yaşlı ve hastalıklı hastalardan kolayca elde edilebilse de, etkinlikleri sınırlıdır. Bu nedenle, sağlıklı donörlerden IFP-MSC'lerin kullanılması, biyomedikal uygulamalardaki etkinliklerini belirlemek için önemlidir. Sağlıklı bir insan donörüne erişim zor olduğundan, hayvan modelleri temel anlayışı sağlamak için daha iyi bir alternatif olabilir. Köpekler, atlar, koyunlar ve keçiler gibi büyük hayvanlar çeviri araştırmalarında çok önemli bir rol oynamaktadır. Bunlar arasında, keçinin boğucu eklemi insan diz eklemine en yakın anatomiye sahip olduğu için keçi tercih edilen bir model olabilir. Dahası, keçi-IFP, doku rejenerasyon uygulamaları için gereken daha yüksek MSC sayılarını karşılayabilir. Ayrıca, düşük maliyet, kullanılabilirlik ve hayvan araştırmaları için 3R ilkelerine uygunluk, onları çekici bir model haline getirmektedir. Bu çalışma, IFP-MSC'leri keçilerin boğucu ekleminden ve in vitro kültür koşullarından genişlemeleri ve farklılaşmaları için izole etmek için basit bir protokol göstermektedir. Keçiden aseptik olarak izole edilmiş IFP yıkandı, kıyıldı ve enzimatik olarak sindirildi. Filtrasyon ve santrifüjlemeden sonra, toplanan hücreler kültürlendi. Bu hücreler yapışıktı, MSC benzeri morfolojiye sahipti ve olağanüstü klonojenik yetenek gösterdi. Ayrıca, adipojenik, kondrojenik ve osteojenik soylara farklılaştılar ve çok etkili olduklarını gösterdiler. Sonuç olarak, çalışma, doku mühendisliği ve rejeneratif tıp uygulamalarında potansiyel gösteren MSC'lerin izolasyonunu ve genişlemesini göstermektedir.

IFP-MSC'lerin keçinin femorotibial ekleminden izolasyonu IFP-MSC'lerin bir keçinin boğucu ekleminden izole edilmesinde yer alan adımlar Şekil 1'de gösterilmiştir. Patellanın iç eklemlenmeyen yüzeyinde bulunan yağ yastığı çıkarıldı, kıyıldı ve enzimatik olarak sindirildi. IFP-MSC'ler in vitro olarak başarılı bir şekilde izole edildi ve kültürlendi (Şekil 2A).
IFP-MSC'leri...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Expansion, and Differentiation of Mesenchymal Stem Cells from the Infrapatellar Fat Pad of the Goat Stifle Joint at JoVE.com

Isolation, Expansion, and Differentiation of Mesenchymal Stem Cells from the Infrapatellar Fat Pad of the Goat Stifle Joint

İnfrapatellar yağ yastığı mezenkimal kök hücreleri (IFP-MSC'ler) diz ekleminin infrapatellar yağ pedinden kolayca izole edilebilir. İn vitro olarak iyi çoğalırlar, CFU-F kolonileri oluştururlar ve adipojenik, kondrojenik ve osteojenik soylara farklılaşırlar. Burada, IFP-MSC'lerin keçi boğucu ekleminden izolasyonu, genişlemesi ve farklılaşması için metodoloji sağlanmaktadır.

Mezenkimal Kök Hücrelerin Keçi Stifle Ekleminin İnfrapatellar Yağ Pedinden İzolasyonu, Genleşmesi ve Farklılaşması

The IFP, present in the knee joint, serves as a promising source of MSCs. The IFP is an easily accessible tissue as it is routinely resected and discarded ...

İnfrapatellar Yağ Pedi kaynaklı Mezenkimal Kök Hücreler veya kısaca IFP-MSC'ler, nispeten daha az çalışılmış bir kök hücre türüdür. Bu protokol, IFP-MSC'lerin keçi boğucu ekleminden izolasyonunu gösteren basit, güvenilir ve tekrarlanabilir bir yöntemdir. Tekniğin temel avantajı, çok sayıda yüksek kaliteli IFP-MSC'nin elde edilebilmesidir.İzole IFP-MSC'ler birden fazla soya farklılaşabilir ve geniş rejeneratif potansiyele sahiptir. Anatomik konumları nedeniyle, IFP-MSC'ler osteoartritte kıkırdak defektlerini onarmaya ve kıkırdak yıkımını hafifletmeye ilgi duymuşlardır. Yöntemin doku mühendisliği ve rejeneratif tıp alanında hücre bazlı tedavi için etkileri vardır.IFP-MSC'lerin izolasyonu, genişletilmesi ve farklılaştırılması prosedürü Dr. Sugata Hazra ve Bay Aman Mahajan tarafından gösterilecektir. Infrapatellar Yağ Pedi Mezenkimal Kök Hücrelerinin veya IFP-MSC'lerin izolasyonuna başlamak için, sterilize edilmiş bir toplama numune kutusunda arka bacakların femoral ve tibial bölgelerinin yaklaşık 15 santimetresini kapsayan keçi femorotibial eklemlerini toplayın. Daha fazla işlem için laboratuvara nakledilmek üzere numuneyi dört santigrat derecede saklayın.Numuneyi 150 milimetrelik bir Petri kabına yerleştirin ve numunenin aseptik olarak ve prosedür boyunca bir biyo-güvenlik kabini olarak işlendiğinden emin olun. Antibiyotiklerle desteklenmiş otoklavlanmış PBS ile iyice durulayın. PBS kullanarak numuneyi hidratlı tutun.Numunenin anatomik bölgelerini dikkatlice inceleyin. Kolay erişim için, femur kemiğinin uç yüzeyini bir elinizle tutarak ve keskin makas kullanarak eklem yönünde uzunlamasına keserek her iki uzun kemikten ekstra dokuları tamamen çıkarın. Daha sonra, eklem kapsülünü çevreleyen dokuyu rahatsız etmeden, kasları ve yağ dokusunu kemikten çıkarın.Benzer şekilde, numunenin tibial ucunda başka bir kesi yapın ve kasları ve yağ dokusunu tibial kemikten çıkarın. Hem uzun kemiklerin tamamen açığa çıktığından hem de eklem kapsülünün görünür olduğundan emin olun. Daha sonra, eklemli eklemi kesmek için sinovyal zarın her iki tarafından bir kesi yapın.Patellayı sinovyal membrandan ve patellar bağlardan taze sterilize edilmiş makas ve forseps kullanarak kesin. Ayrılmış patellayı hemen PBS içeren bir Petri kabına yerleştirin. Ayrılmış patelladan, makas ve forseps kullanarak iç yüzeyde bulunan tüm yağ yastığını çıkarın.Başka bir taze Petri kabında toplayın ve bir neşter kullanarak kıyın. Yaklaşık iki ila üç milimetrelik küçük yağ segmentlerini elde etmek için diğer cerrahi aletleri dahil edin. Kıyılmış dokuyu 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarmak için bir spatula kullanın ve bir test tüpü karıştırıcısı kullanarak oda sıcaklığında 15 dakika boyunca antibiyotiklerle desteklenmiş PBS ile üç kez yıkayın.Enzimatik sindirim için, kıyılmış dokunun yaklaşık beş gramını Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamında veya DMEM'de, mililitre başına 1.5 miligram Tip II kollajenaz ve% 2 FBS'yi 12 ila 16 saat boyunca 37 santigrat derecede %2 FBS içeren düşük glikozlu ortamlarda inkübe edin. Sindirilmiş dokuyu dikkatlice aspire edin ve sindirilmemiş herhangi bir parçayı çıkarmak için 70 mikronluk bir hücre süzgecinden süzün. Filtrazı 15 mililitrelik bir santrifüj tüpünde beş dakika boyunca 150 kez g'de santrifüj yapın.Hücre peletini DMEM düşük glikoz ile iki kez yıkamadan önce süpernatantı çıkarın. Pelet, genleşme ortamı olarak da bilinen tam DMEM'de yeniden askıya alın. Hücreleri 150 milimetrelik bir Petri kabına tohumlayın ve mililitre başına beş nanogram Temel Fibroblast Büyüme Faktörü veya BFGF ve mililitre başına 50 mikrogram 2-Fosfo-L-askorbik asit trisodyum tuzu ile desteklenen genleşme ortamında kültürleyin.Hücrelerin yapışmasını ve çoğalmasını sağlamak için% 5'lik bir karbondioksit inkübatöründe hücreleri 37 santigrat derecede inkübe edin. Hücrelerin günlük olarak bağlanmasını ve büyümesini izleyin. IFP-MSC'lerin uygun bakımı ve genişletilmesi için, ortamı her üç günde bir değiştirin.Ortamı değiştirirken, mililitre BFGF başına taze beş nanogram ve milimetre başına 50 mikrogram 2-Fosfo-L-askorbik asit trisodyum tuzunu doğrudan Petri kabına ekleyin. Hücreler% 80 ila% 90 oranında birleştiğinde, Petri kabından genleşme ortamını çıkararak ve hücreleri 1X PBS ile yıkayarak onları alt kültüre alın. Daha sonra yemeğe dört mililitre% 0.25 Tripsin-EDTA ekleyin ve% 5'lik bir karbondioksit inkübatöründe hücreleri 37 santigrat derecede inkübe edin.Dört dakika sonra, hücreleri yerinden çıkarmak için yan tarafındaki plakaya dokunun. Tüm hücrelerin mikroskop altında tamamen ayrıldığını onaylayın. Onaylandıktan sonra, tripsini nötralize etmek için eşit miktarda genişletme ortamı ekleyin.Bu ayrışmış hücreleri taze bir 15 mililitrelik polipropilen tüpte toplamak için bir pipet kullanın ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca 150 kez g'de santrifüj yapın. Süpernatantı atın ve peleti istenen genleşme ortamı hacminde yeniden askıya alın. Standart hücre sayma yöntemini kullanarak hücreleri sayın ve 150 mililitrelik bir Petri kabında santimetre kare başına 10.000 hücrelik bir tohumlama yoğunluğunda daha fazla genişleme için alt kültüre alın.Tüm tahliller için, P2 ila P5 geçiş numarasına sahip hücrelerin birleştirilmiş bir tek katmanını kullanın. Genişlemiş hücreler% 80 ila% 90 akıcılığa ulaştığında, hücreleri beş dakika boyunca 150 kez g'de 15 mililitrelik bir santrifüj tüpünde peletlemeden önce Tripsin-EDTA çözeltisini kullanarak ayrıştırın. Daha sonra peleti keçi plazmasında 50 mikrolitre başına 2 milyon hücre yoğunluğunda yeniden askıya alın. Hücreleri içeren 50 mikrolitre plazmayı sterilize edilmiş 90 milimetrelik bir Petri kabına ekleyin, ardından% 0.3'lük son konsantrasyonda kalsiyum klorür ilavesi Çapraz bağlı plazma hidrojeli üretmek için iyice karıştırın.Fabrikasyon hidrojeli 40 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe ettikten sonra, hidrojelleri kondrojenik ortam içeren 24 delikli doku kültürü plakalarına aktarın. Medyayı 14 gün boyunca her üç günde bir değiştirin. TGF-beta 1 olmadan tam DMEM ortamında kültürlenen hidrojeller, indüklenmemiş kontroller olarak kabul edilir.Plazma hidrojelindeki hücrelerin 14 günlük kondrojenik farklılaşmasından sonra, hidrojelleri PBS ile her biri beş dakika boyunca üç kez yıkayın ve numuneleri üç saat boyunca nötr tamponlu formalin içinde sabitleyin. İzole IFP-MSC'ler homojen olarak yapışıktı ve in vitro kültürden sonraki 24 saat içinde uzatılmış morfolojiye ulaştı. Hücreler, genişlemeden sonraki altı gün içinde% 80 ila% 90 oranında etkili bir şekilde çoğaldı ve etkili proliferatif ve kendini yenileme yeteneklerini gösteren klonojenik kapasite gösterdi.Adipojenik soya farklılaşmak için tedavi edildiğinde, izole hücreler, 14. ve 21. günlerde Yağ Kırmızı O boyaması ile doğrulanan lipit damlacıkları üretti. Bu tür yağ damlacıkları, adipojenik indükleyici faktörler olmadan hücrelerde görülmüyordu. Plazma hidrojeli içinde kapsüllenen izole hücreler, indüklenen grupta 14 gün sonra beyaz ve parlak neo-doku oluşumunu gösterdi ve kondrojenik potansiyeli gösterdi.İndüklenmemiş grup, parlaklığı azalmış soluk beyaz dokuya sahipti. Ek olarak, indüklenen gruptaki Alcian Blue ve Safranin O için pozitif histolojik boyama, hücrelerin kıkırdak matrisinin ana bileşenlerinden biri olan sülfatlanmış glikozaminoglikanları salgılayabileceğini göstermiştir. Buna karşılık, indüklenmemiş gruplardan gelen hidrojel kesitleri Safranin O ve Alcian Blue boyama için negatifti ve mezenkimal kök hücrelerin kondrojenik farklılaşma potansiyelini sadece kondrojenik uyaranların varlığında doğruladı.Osteojenik medya ile indüklenen izole hücreler, alkali fosfataz için pozitif boyanma gösterdi ve 14 günün sonunda mineralizasyonu doğruladı. 28 günlük osteojenik indüksiyondan sonra, Alizarin Red S boyaması ile kalsifiye birikimler gözlendi. Sonuçlar, indüklenen hücrelerin adipojenik, kondrojenik ve osteojenik soylara farklılaşma potansiyelinin altını çizdi.Kontaminasyonu önlemek için numunenin aseptik koşullar altında işlenmesi esastır. Patellanın doğru yerini belirlemek de önemlidir. Bu prosedür, eklem kondrositleri, ligament fibroblastları ve kök hücreler gibi çeşitli hücre tiplerini sinovyum ve sinovyal sıvıdan izole etmek için yolu açar ve rejeneratif tıpta geniş uygulamalara sahiptir.IFP-MSC'lerin bu teknik kullanılarak izole edilmesinden sonra, etkinliği özellikle kıkırdak, kemik ve ligament gibi kas-iskelet sistemi dokularının iskele ve iskelesiz yaklaşımlar kullanılarak yenilenmesi için araştırılmıştır.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

Farklı soy İnsan Embriyonik Kök Hücreleri (hESC) Yayılması ve Farklılaşma için 3D Platformu olarak aljinat Mikrokapsül

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

Geliştirme, Genişleme ve<em&gt; In vivo</em&gt; İnsan Embriyonik Kök Hücreleri (hESC) den İnsan NK Hücrelerinin İzleme ve ve Bağlı Pluripotent Kök Hücre (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on Poly(&#949;-caprolactone) Electrospun Yarns

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on PolyÃƒÅ½Ã‚Âµ-caprolactone Electrospun Yarns

Poli (ε-kaprolakton) electrospun İplik İnsan Mezenkimal Kök Hücre Ek Optimize

Research into biomaterials and tissue engineering often includes cell-based in vitro investigations, which require initial knowledge of the starting cell ...

Scaffold-supported Transplantation of Islets in the Epididymal Fat Pad of Diabetic Mice

Diyabetik Farenin Epididimal Yağ Tabağında Iskelelerin İskele Destekli Nakli

Islet transplantation has been clinically proven to be effective at treating type 1 diabetes. However, the current intrahepatic transplantation strategy ...

Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells

Yalıtım insan alveoler kapaklarini ve Osteojenik etkinlik kapaklarini türetilmiş hücre D vitamini etkileri Mezenkimal kök hücrelerin

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the ...

Exploring the Potential of Mesenchymal Stem Cell Sheet on The Development of Hepatocellular Carcinoma In Vivo

Exploring the Potential of Mesenchymal Stem Cell Sheet on The Development of Hepatocellular Carcinoma In Vivo

Hepatosellüler karsinom Vivo içinde geliştirilmesi üzerinde mezenkimal kök hücre sayfası potansiyelini keşfetmek

An in vivo animal model that mimics human cancer could have various applications that deliver significant clinical information. The currently used ...

Construction and Use of an Electrical Stimulation Chamber for Enhancing Osteogenic Differentiation in Mesenchymal Stem/Stromal Cells In Vitro

İnşaat ve in Vitro mezenkimal kök/Stromal hücrelerdeki Osteojenik farklılaşma güçlendirmeye yönelik bir elektriksel stimülasyon odası kullanımı

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) have been used extensively to promote bone healing in tissue engineering approaches. Electrical stimulation (EStim) ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

İnsan kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Türevli Kardiyomiyositlerde Tek Hücreli Optik Eylem Potansiyeli Ölçümü

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Generation of Human Blood Vessel Organoids from Pluripotent Stem Cells

Pluripotent Kök Hücrelerden İnsan Kan Damarı Organoidlerinin Üretimi

An organoid is defined as an engineered multicellular in vitro tissue that mimics its corresponding in vivo organ such that it can be used to study ...

Creation of a Knee Joint-on-a-Chip for Modeling Joint Diseases and Testing Drugs

Eklem hastalıklarını modellemek ve ilaçları test etmek için çip üzerinde diz eklemi oluşturulması

The high prevalence of debilitating joint diseases like osteoarthritis (OA) poses a high socioeconomic burden. Currently, the available drugs that target ...