Name: isolation of micrornas from tick ex vivo salivary gland cultures and extracellular vesicles
Uploaded: 2022-04-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles at JoVE.com

نحن ممتنون للغاية للمساعدة المقدمة من مختبر قراد حمى الماشية في إدينبورغ ، تكساس. نود أن نشكر مايكل موسى وجيسون تيدويل وجيمس هيلومز وسيزاريو أغادو وهوميروس فاسكيز. نود أيضا أن نعرب عن تقديرنا للمساعدة التي قدمتها سارة شاربتون وإليزابيث لوهستروه وإيمي فيليب وكيلسي جونسون وكيلي كوشكان وأندرو هيلهاوس وشارلوز أروتشو روزاريو وستيفاني غوزمان فالنسيا طوال المشروع. نود أن نشكر مجموعة تكساس إيه آند إم آجي للنساء في علم الحشرات (AWE) على مساعدتهم ونصائحهم أثناء كتابة هذه المخطوطة. تم توفير الكواشف التالية من قبل مراكز السيطرة على الأمراض والوقاية منها لتوزيعها من قبل BEI Resources و NIAID و NIH: Ixodes scapularis Adult (Live) ، NR-42510. كما تم استلام القراد الكتف I . الإناث من مرفق تربية القراد في جامعة ولاية أوكلاهوما. تم تمويل هذا المشروع من قبل جامعة تكساس إيه آند إم T3: ثالوث لمنحة التحول والاتفاقية التعاونية #58-3094-1-003 من قبل وزارة الزراعة الأمريكية-ARS إلى AOC.

تم إجراء جميع التجارب على الحيوانات وفقا لبروتوكول استخدام الحيوانات (AUP # 2020-0026) المعتمد من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (AICUC) في جامعة تكساس إيه آند إم. تم استخدام أنواع القراد ، Ixodes scapularis و Rhipicephalus (Boophilus) microplus ، والأرانب البيضاء الذكور النيوزيلندية ، 42-72 يوما م...

يوفر البروتوكول الحالي منهجية مفصلة لاستخراج miRNA من الغدد اللعابية والمركبات الكهربائية. ومع ذلك، هناك اعتبارات هامة، وكلها مفصلة في الملاحظات الخاصة بكل قسم من أقسام هذا البروتوكول. يجب تأمين الكبسولة والمعاوضة الشبكية أثناء تغذية القراد لمنع القراد من الهروب. يتم وصف إعداد الكبسولة وو...

القراد هي طفيليات خارجية تنقل العديد من مسببات الأمراض إلى الحياة البرية والماشية والبشر وحيواناتهم الأليفة 1,2. تؤدي تغذية القراد إلى خسارة اقتصادية كبيرة من خلال التسبب في تلف الاختباء ، وتقليل الوزن وإنتاج الحليب بسبب فقر الدم الشديد ، وانتقال مسببات الأمراض التي يحتمل أن تكون قاتلة مسببة للأمراض1،3،4،5. وتركز ممارسات المكافحة الحالية لإدارة مجموعات القراد على استخدام مبيدات القراد. ومع ذلك، فإن الظهور المستمر لمقاومة مبيدات الآفات في القراد المتطفل على الماشية5,6، وزيادة حدوث لدغات القراد7، وانتقال مسببات الأمراض داخل المناطق السكنية 8,9، أدت إلى الحاجة إلى بدائل فريدة لمكافحة القراد.
الغدد اللعابية القراد هي أعضاء أساسية تضمن النجاح البيولوجي للقراد. يتم تشكيلها من قبل أنواع مختلفة من الأسينوس (الأول والثاني والثالث والرابع) مع وظائف فسيولوجية مختلفة. الغدد اللعابية هي المسؤولة عن التنظيم الأسموزي ، سواء خارج أو على المضيف ، عن طريق إعادة فائض الماء ومحتوى الحديد إلى المضيف عن طريق إفراز اللعاب 2,10. وتشارك أيضا من النوع الأول من الأسيني في امتصاص الماء من الغلاف الجوي عن طريق إفراز اللعاب استرطابي10,11. يتم إنتاج البروتينات المستجيبة للعاب ، مثل الأسمنت والسيستاتين ، داخل الخلايا الإفرازية في النوع الثاني والثالث من الأسيني10,12. لا يؤثر النوع الأول من الأسيني على تغذية القراد ، مما يشير إلى أن تناول دقيق الدم لا يؤدي إلى تغيرات مورفولوجية وفسيولوجية في هذا النوع من الأسيني13,14. من ناحية أخرى ، يتم تنشيط Acini من النوع الثاني والثالث أثناء التغذية ويقدم القليل جدا من النشاط قبل التعلق. وبالتالي ، فإن التغذية ضرورية لتحفيز تضخم الخلايا الإفرازية داخل النوع الثاني من الأسيني وإنتاج المركبات النشطة بيولوجيا. يتم تقليل حجم الأسيني من النوع الثالث أثناء التغذية بسبب الإفراز داخل الحبيبات الإفرازية12.
الغدد اللعابية هي أيضا موقع العدوى المسببة للأمراض في القراد وطريق الانتقال. أثناء التغذية ، تفرز القراد العديد من المركبات ذات التأثيرات الصيدلانية اللازمة لإكمال دقيق الدمبنجاح 10،15،16. هذه المركبات لها خصائص مضادة للالتهابات ومثبطة للمناعة وموسعة للأوعيةالدموية 10،15،17. وقد أظهرت الدراسات الحديثة أن الحويصلات خارج الخلية (EVs) المشتقة من الغدد اللعابية القراد تؤوي العديد من هذه المركبات ، مما يؤدي إلى تأثيرات مضادة للالتهابات ومناعية18،19،20. "الحويصلات خارج الخلية" هو مصطلح شامل يستخدم لوصف الحويصلات المصنفة على أنها إكسوسومات وحويصلات دقيقة بناء على حجمها ونشأتها الحيوية. بشكل عام ، EVs هي بقع دهنية ذات أغشية ثنائية الطبقة تبلغ ~ 40 نانومتر - 1 ميكرومتر في الحجم21 ؛ بشكل عام ، توصف الإكسوسومات بأنها بحجم 40-150 نانومتر ، في حين أن الحويصلات الدقيقة تتراوح بين 150 نانومتر - 1 ميكرومتر في الحجم21،22،23. ومع ذلك ، فإن الحجم لا يدل على مسار التكوين الحيوي للمركبات الكهربائية22.
يبدأ التكوين الحيوي للإكسوسومات بالغزو المتسلسل لغشاء البلازما. يؤدي هذا الغزو إلى تكوين أجسام متعددة الحويصلات ويؤدي في النهاية إلى تشوه الغشاء الحويصلي بفعل مجمعات ESCRT أو sphingomyelinases (sMases)24,25. يمكن إما تحليل الإكسوسومات داخل الليزوسومات للحفاظ على التوازن الخلوي أو الخروج عن طريق الاندماج الحويصلي إلى غشاء البلازما لتوصيل المكونات الخلوية إلى الخلايا المتلقية21,24. من ناحية أخرى ، تتشكل الحويصلات الدقيقة من خلال عمل flopass و flipassess ، مما يغير تشكيل الدهون في غشاء البلازما26. المركبات الكهربائية ضرورية للاتصال من خلية إلى خلية ، وتعمل كنظام نقل للبضائع داخل الخلايا ، مثل الدهون والبروتينات والأحماض النووية والحمض النووي الريبي الميكروي (miRNAs) 21،27،28. بمجرد نقلها ، تقوم هذه الحويصلات بتوصيل حمولتها إلى سيتوبلازم الخلايا المتلقية ، مما يولد تغيرات في النمط الظاهري في الخلية المستقبلة22,29. نظرا لأهمية الحويصلات خارج الخلية في تغذية القراد والتلاعب باستجابات المناعة المضيف والتئام الجروح18,20 ، فإن الشحنة داخل الحويصلات خارج الخلية تمثل أهدافا محتملة لتطوير علاجات مضادة للقراد وآلية فريدة لتعطيل تغذية القراد. وهذا يشمل miRNAs داخل الغدد اللعابية القراد والحويصلات خارج الخلية المشتقة من الغدة اللعابية.
miRNAs هي تسلسلات قصيرة غير مشفرة ، ~ 18-22 نيوكليوتيد (nt) في الطول ، والتي يمكن أن تنظم بعد النسخ أو تحلل أو تسكت تسلسلات mRNA30,31. أثناء النسخ ، يتم شق pri-miRNAs بواسطة Dicer (RNA polymerase III) لتشكيل بنية مميزة تشبه دبوس الشعر ، لتصبح ما قبل miRNA. يتم قطع الحمض النووي الريبوزي المرسال المسبق مرة أخرى بواسطة دروشا (RNA polymerase III) لتشكيل دوبلكس miRNA ناضج. يصبح التسلسل الناضج مدمجا في مجمع إسكات الحمض النووي الريبي الناجم عن الحمض النووي الريبي الريبي (RISC) المكمل لتسلسل الحمض النووي الريبوزي المرسال ، مما يتسبب في قمع الترجمة أو تدهور الحمض النووي الريبي المرسال28،30،32. أثناء تغذية المضيف ، يمكن ل miRNAs داخل لعاب القراد تعديل التعبير الجيني للمضيف لقمع الاستجابات المناعية وتعزيز انتقال مسببات الأمراض33،34،35،36،37. على الرغم من وجود دراسات مكثفة حول المركبات الكهربائية والحمض النووي الريبوزي المرسال ، إلا أن أدوارها أثناء التغذية في واجهة مضيف القراد لا تزال غير مفهومة بشكل جيد. يعد تحسين البروتوكولات التي يمكن أن تؤدي بسهولة إلى عزل وتنقية الحمض النووي الريبوزي المرسال عالي الجودة أمرا بالغ الأهمية لتعزيز معرفتنا حول هذه المواضيع.
يمكن استخدام خيارات متعددة لعزل المركبات الكهربائية ، مثل الطرد المركزي الفائق ، وهطول الأمطار الخارجية ، وهطول الأمطار البوليمر ، وكروماتوغرافيا التقارب المناعي ، وتقنيات الاستبعاد القائمة على الحجم38. ومع ذلك ، لا يمكن لهذه التقنيات التمييز بين الإكسوسومات أو الحويصلات الدقيقة. وبالتالي ، كما ذكرنا سابقا ، يتم استخدام EV كمصطلح شامل عند عزل EVs من عينات مختلفة. تمثل الحويصلات المعزولة في التجارب الموصوفة هنا خليطا من الحويصلات المشتقة من مسارات التخلق الحيوي المختلفة. يمكن تحقيق مزيد من التنقية لمجموعة محددة من الحويصلات خارج الخلية عن طريق الترسيب المناعي باستخدام الخرز المطلي بالأجسام المضادة ضد العلامات (أي العلامات الخارجية ، علامات الورم) الفريدة من نوعها لمجموعة الحويصلات ذات الأهمية39,40. يمكن أيضا استخراج miRNAs عبر مجموعات عزل مختلفة متاحة تجاريا 7,41,42.
كان الهدف من هذا المشروع هو تطوير بروتوكول يجمع بين الطرق المطبقة بشكل شائع لعزل المركبات الكهربائية واستخراج miRNA من كل من EVs والغدد اللعابية المغذية. نظرا لأن إفراز المركبات النشطة بيولوجيا يتم تنشيطه عن طريق تغذية12 ، يجب السماح للقراد بالتغذية لتحديد miRNAs التي قد تكون مهمة للتلاعب باستجابات المناعة والتئام الجروح للمضيف. يتطلب البروتوكول الحالي عددا صغيرا من القراد (20 علامة) لعزل المركبات الكهربائية والحمض النووي الريبوزي المرسال الخاص بها ، مقارنة بالدراسات الأخرى الموصوفة سابقا التي تطلبت 2000 علامة43. علاوة على ذلك ، فإنه يتجنب تلوث إفرازات اللعاب بالبيلوكاربين44 ، مما قد يؤثر على التجارب التي تدرس تأثير EVs و miRNAs على الخلايا المضيفة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m syringe filter</td>
			<td>GenClone</td>
			<td>25-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 &#181;m nylon syringe filter</td>
			<td>Tisch Scientific</td>
			<td>283129028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 inch black adhesive</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B00FQ937NM</td>
			<td>Capsule</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL needeless syringe</td>
			<td>Exelint</td>
			<td>26265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#39; and 5&#39; Adapters</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 mm vannas scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.1523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>337922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-003-CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beads</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5425</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Macron</td>
			<td>UN1888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyverse Discovery Enviornment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://cyverse.org/discovery-environment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sideded carpet tape</td>
			<td>amazon</td>
			<td>&#8206;286373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Tubes, 50 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>FBS-02-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fine forceps</td>
			<td>Excelta</td>
			<td>5-S-SE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foamies, 2 mm</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B004M5QGBQ</td>
			<td>Capsule</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Phoenix Pharmaceuticals manfactured</td>
			<td>193.33165.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ixodes scaplaris</td>
			<td>CDC, Oklahoma State University</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L15C300 medium</td>
			<td>In-lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lipoprotein-cholesterol concentrate</td>
			<td>MPI</td>
			<td>02191476-CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10118-596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRDeep2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/rajewsky-lab/mirdeep2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-MuLV Reverse Transcriptase</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>molecular grade ethanol</td>
			<td>Fischer Bioreagents</td>
			<td>UN1170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multi-well 24 well tissue culture treated plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanopaticle Tracking Analyzer machine</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosep with 300K Omega filter</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>OD3003C33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit v3</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq 500/550 High Output Kit (75 cycles)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XPN 90 Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>Thermofischer Scientific</td>
			<td>ICN19453780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pippettes</td>
			<td>Ependorff</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polycarbonate centrifuge bottle</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen miRNeasy kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAzol lysis reagent</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>Q32880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit kit</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>Q10212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbits</td>
			<td>Charles River</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Universal Primer</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhipicephalus microplus</td>
			<td>Cattle Fever Tick Research Labratoty</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Fischer Bioreagents</td>
			<td>215544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>833280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse free tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse inhibitor</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>11111729</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse/DNAse free water</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Minelute spin column</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217084</td>
			<td>Qiagen miRNeasy kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPE Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217084</td>
			<td>Qiagen miRNeasy kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT Buffer</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-seq kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT Forward Primer</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-seq kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTE Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217084</td>
			<td>Qiagen miRNeasy kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6014-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall ST16</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>75004380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized Gauze sponges</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>2187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized PBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>RNBK0694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>streptomycin</td>
			<td>thermofischer Scientific</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TapeStation</td>
			<td>Aligent</td>
			<td>G2991BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tear Mender Instant Fabric and Leather Adhesive</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>7.42836E+11</td>
			<td>Capsule</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Adhesive</td>
			<td>3M VetBond</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triple Antibiotics</td>
			<td>dechra</td>
			<td>17033-122-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptose phosphate broth</td>
			<td>BD</td>
			<td>BD 260300</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of micrornas from tick ex vivo salivary gland cultures and extracellular vesicles

القراد هي طفيليات خارجية مهمة يمكنها نقل مسببات الأمراض المتعددة. الغدد اللعابية للقراد ضرورية للتغذية لأن لعابها يحتوي على العديد من المؤثرات ذات الخصائص الصيدلانية التي يمكن أن تقلل من الاستجابات المناعية للمضيف وتعزز انتقال مسببات الأمراض. مجموعة واحدة من هذه المؤثرات هي microRNAs (miRNAs). miRNAs هي تسلسلات قصيرة غير مشفرة تنظم التعبير الجيني المضيف في واجهة القراد والمضيف وداخل أعضاء القراد. يتم نقل هذه الحمض النووي الريبي الصغير في لعاب القراد عبر الحويصلات خارج الخلية (EVs) ، والتي تخدم الاتصالات بين الخلايا وداخلها. تم تحديد الحويصلات التي تحتوي على miRNAs في لعاب القراد. ومع ذلك ، لا يعرف سوى القليل عن أدوار وملامح miRNAs في الحويصلات والغدد اللعابية القراد. علاوة على ذلك ، تتطلب دراسة الحويصلات و miRNAs في لعاب القراد إجراءات شاقة لجمع لعاب القراد. يهدف هذا البروتوكول إلى تطوير والتحقق من صحة طريقة لعزل miRNAs من الحويصلات خارج الخلية النقية التي تنتجها مزارع الأعضاء خارج الجسم الحي . يتم وصف المواد والمنهجية اللازمة لاستخراج miRNAs من الحويصلات خارج الخلية والغدد اللعابية القراد هنا.

يوفر هذا البروتوكول منهجية مفصلة لاستخراج miRNAs من الغدد اللعابية والمركبات الكهربائية. وفقا للنتائج ، فإن هذا البروتوكول فعال لعزل miRNA عن البالغين من نوعين مختلفين من القراد ، I. scapularis و R. microplus ، ويمكن استخدامه في أنواع القراد الأخرى أيضا. تم قياس تركيز المركبات الكهربائية (الجسيم...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles at JoVE.com

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

يصف هذا البروتوكول عزل الحمض النووي الريبي الميكروي عن الغدد اللعابية القراد والحويصلات خارج الخلية المنقاة. هذا إجراء عالمي يجمع بين الكواشف واللوازم شائعة الاستخدام. تسمح هذه الطريقة أيضا باستخدام عدد صغير من القراد ، مما يؤدي إلى microRNAs عالية الجودة التي يمكن تسلسلها بسهولة.

عزل الحمض النووي الريبي الميكروي عن ثقافات الغدد اللعابية خارج الجسم الحي والحويصلات خارج الخلية

Ticks are important ectoparasites that can vector multiple pathogens. The salivary glands of ticks are essential for feeding as their saliva contains many ...

يسمح لنا هذا البروتوكول باستخدام عدد أقل من القراد مما يقلل من تكلفة صيانة المستعمرة ويقلل من عدد الحيوانات الفقرية اللازمة لتغذية القراد. يتطلب هذا البروتوكول حوالي 20 علامة. ومع ذلك ، فإن الميزة الرئيسية بصرف النظر عن استخدام حجم عينة صغير هي أنه يمكن تطبيق هذا البروتوكول على أنواع متعددة من القراد ومراحل حياة مختلفة.بصرف النظر عن تشريح القراد أو التطبيق نحو التفاعلات بين المضيف والطفيلي ، فإن تأثير العدوى المسببة للأمراض على إفراز microRNA وتأثير التغيرات الفسيولوجية على microRNA التي تفرزها القراد. للبدء ، قم بإعداد وسائط خالية من الحويصلات عن طريق إضافة مصل البقر الجنيني ، ومرق فوسفات التربتوز ، وتركيز الكوليسترول في البروتين الدهني بنسبة 10٪ ، وبيكربونات الصوديوم بنسبة 5٪ ، و HEPES ، ووسط L15C300 إلى زجاجة طرد مركزي من البولي كربونات سعة 26.3 ملليلتر وضبط الحجم حسب الحاجة. الآن الطرد المركزي الفائق الوسط في 100،000 مرة G في أربع درجات مئوية لمدة 18 ساعة.قم بإزالة السوبرناتانت بعناية دون إزعاج الكريات ونقل السوبرناتانت إلى أنبوب طرد مركزي جديد. جهاز الطرد المركزي الفائق للأنبوب مرة أخرى. خذ السوبر نات ومرره عبر مرشح 0.22 ميكرومتر لإزالة الملوثات.قم بتقطيع المادة الفائقة في أنبوب طرد مركزي سعة 50 ملليلتر وتخزينها عند 20 درجة مئوية تحت الصفر حتى الحاجة أو حتى ثلاث سنوات. أضف كمية مناسبة من المضادات الحيوية إلى 500 ميكرولتر من الوسط الخالي من الحويصلات في كل بئر من صفيحة زراعة 24 بئرا. الآن ، أضف PBS مع ريفامبيسين إلى الآبار التي لا تحتوي على وسط خال من الحويصلة لمنع نمو البكتيريا.ضع القراد على شريحة زجاجية بشريط سجاد على الوجهين تحت مجهر تشريح. قبل التشريح ، أضف PBS الذي يحتوي على ريفامبيسين إلى القراد وباستخدام مقص Vannas بأربعة ملليمترات ، قم بعمل شق يبلغ حوالي ملليمتر واحد على جانب كل أنثى. الآن ، قم بإزالة الجانب الظهري للقراد والغدد اللعابية ، ثم ضع 20 إلى 40 غدة لعابية من القراد في 500 ميكرولتر من الوسط الخالي من الحويصلات المضافة إلى بئر واحد في لوحة معالجة بزراعة الأنسجة من 24 بئرا.احتضان عينات الغدة اللعابية عند 32 درجة مئوية لمدة 24 ساعة للسماح بإفراز الحويصلات خارج الخلية. في نهاية الحضانة ، ماصة جميع الوسائط التي تحتوي على الغدد اللعابية في أنبوب جهاز طرد مركزي دقيق 1.5 ملليلتر وأجهزة طرد مركزي عند 300 مرة G عند أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. انقل السوبرناتانت إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 ملليلتر.أعد تعليق الكريات التي تحتوي على الغدد اللعابية في الحمض النووي الريبي لاحقا وتخزينها عند 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى يتم استخدامها أو إلى أجل غير مسمى. الآن ، قم بإزالة الحطام الخلوي عن طريق الطرد المركزي للجهاز الفائق عند 2000 مرة G عند أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق وماصة السوبرنات في أنبوب جديد 1.5 ملليلتر من أجهزة الطرد المركزي الدقيقة. بعد ذلك ، جهاز طرد مركزي في 10،000 مرة G لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية لإزالة الأجسام الماصة والحويصلات الأكبر خارج الخلية ونقل supernatant إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد 1.5 ملليلتر.ثم قم بتجميع مرشح حقنة نايلون ميكرومتر واحد على حقنة 10 ملليلتر واحتفظ بها على أنبوب جهاز طرد مركزي فائق. ثم أضف العينة واملأ المحقنة ب 10 ملليلتر من PBS. مرر السوبرناتانت من خلال المرشح إلى الأنبوب.بعد تصفية الأنابيب وموازنتها ، ضعها في دوار 70 Ti وقم بطرد الأنابيب بسرعة 100،000 مرة G لمدة 18 ساعة عند أربع درجات مئوية. تشكل الحويصلات المركزة خارج الخلية حبيبة بعد الطرد المركزي الفائق. قم بإزالة supernatant دون إزعاج الكريات وإعادة تعليق الكريات في PBS.ماصة 500 ميكرولتر من الحويصلة خارج الخلية في مرشح طرد مركزي 300 K وأجهزة طرد مركزي في 8،000 مرة G لمدة 10 دقائق في درجة الحرارة المحيطة وكرر هذا الإجراء حتى يتم ترشيح جميع الحويصلات خارج الخلية. أخيرا ، أضف 400 ميكرولتر من PBS المعقم إلى العمود واخلطه جيدا لإزالة الحويصلات خارج الخلية المرتبطة بالغشاء. ثم ضع العينة في أنبوب خال من الحمض النووي الريبي 1.5 ملليلتر.اختلف تركيز وحجم الحويصلات خارج الخلية اعتمادا على الجنس ومرحلة حياة القراد بين النسخ المتماثلة البيولوجية للإناث والذكور والحوريات. بالنسبة لجميع النسخ المتماثلة البيولوجية مجتمعة ، لوحظت نتائج مماثلة. أظهر تحليل الحمض النووي الريبي الصغير المعزول من الغدة اللعابية نطاقات مقابلة للحمض النووي الريبوسومي والحمض النووي الريبوزومي الميكروي.ومع ذلك، كانت الحمض النووي الريبوسومي الريبوسومي غائبة في الحويصلات المعزولة من الغدد اللعابية، وأظهرت عينات الحمض النووي الريبوزي الميكروي التي تم تنقيتها من الحويصلات خارج الخلية المزيد من التدهور. بعد التخصيب، أظهرت عينات الحمض النووي الريبي الميكروي التي تم تنقيتها من المركبات الكهربائية الحد الأدنى من التحلل وتركيز الحمض النووي الريبي الميكروي الكافي لتخليق مكتبة cDNA. حجم النطاق المتوقع من حوالي 150 زوجا أساسيا بعد الحصول على إعداد مكتبة cDNA يدل على مكتبات cDNA صغيرة الحمض النووي الريبي.أثناء التحضير الخالي من الحويصلات ، تأكد من اتباع الخطوات لمنع تلوث الحويصلة الخارجية. أثناء إعداد لوحة جيدة ، تأكد من إضافة المضادات الحيوية لمنع التلوث البكتيري من ميكروبيوم القراد. يمكن استخدام الحمض النووي الريبي الميكروي المستخرج باستخدام هذا البروتوكول للتنميط والتجارب الوظيفية للتحقق من صحة أدوار الحمض النووي الريبي الميكروي مثل التنبؤ بأهداف مسار الحمض النووي الريبي الميكروي والتثبيط وتجارب المحاكاة.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells

عزل الخلايا الجذعية ماوس اللعابية الغدة

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of ...

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

مصاصة للدماء العزل من السائل خارج الخلية من<em&gt; Caenorhabditis ايليجانس</em

The genetically tractable model organism C. elegans has provided insights into a myriad of biological questions, enabled by its short generation time, ...

Isolation of Basal Cells and Submucosal Gland Duct Cells from Mouse Trachea

عزل الخلايا القاعدية والخلايا تحت المخاطية قناة الغدة من القصبة الهوائية ماوس

The large airways are directly in contact with the environment and therefore susceptible to injury from toxins and infectious agents that we breath in 1. ...

Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures

تعديل وإعادة التركيب الوراثي للاللعابية الثقافات الجهاز الغدة

Branching  morphogenesis occurs during the development of many organs, and the embryonic  mouse submandibular gland (SMG) is a classical model for the ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

السذاجة الكبار الخلايا الجذعية عزل من المرحلة الابتدائية الثقافات الخلايا الليفية الإنسان

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Isolation of Intact, Whole Mouse Mammary Glands for Analysis of Extracellular Matrix Expression and Gland Morphology

عزل الغدد الثديية الماوس سليمة، وكلها لتحليل التعبير المصفوفة خارج الخلية ومورفولوجية الغدة

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal ...

Isolation of Retinal Arterioles for Ex Vivo Cell Physiology Studies

Isolation of Retinal Arterioles for Ex Vivo Cell Physiology Studies

عزل الشرايين الشبكية للدراسات فيزيولوجيا الخلية السابقين فيفو

The retina is a highly metabolically active tissue that requires a substantial blood supply. The retinal circulation supports the inner retina, while the ...

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

تحليل سيتوميتريك من حويصلات خارج الخلية من خلية مكيفة وسائل الإعلام تدفق

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

تنقية وتحليل Caenorhabditis elegans خارج الخلية الحويصلات

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

عزل وتنقية الحويصلات خارج الخلية من الإشريكية القولونية والبكتيريا الأخرى قابلة للتطوير

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...