Name: isolation of micrornas from tick ex vivo salivary gland cultures and extracellular vesicles
Uploaded: 2022-04-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles at JoVE.com

Vi er meget taknemmelige for hjælpen fra Cattle Fever Tick Laboratory i Edinburg, Texas. Vi vil gerne takke Michael Moses, Jason Tidwell, James Hellums, Cesario Agado og Homer Vasquez. Vi vil også gerne anerkende hjælpen fra Sarah Sharpton, Elizabeth Lohstroh, Amy Filip, Kelsey Johnson, Kelli Kochcan, Andrew Hillhouse, Charluz Arocho Rosario og Stephanie Guzman Valencia gennem hele projektet. Vi vil gerne takke Texas A&M Aggie Women in Entomology (AWE) Writing Group for deres hjælp og råd under skrivningen af dette manuskript. Følgende reagenser blev leveret af Centers for Disease Control and Prevention til distribution af BEI Resources, NIAID, NIH: Ixodes scapularis Adult (Live), NR-42510. Kvindelige I. scapularis flåter blev også modtaget fra Tick Rearing Facility ved Oklahoma State University. Dette projekt blev finansieret af Texas A&M University T3: triads for transformationstilskud og samarbejdsaftalen #58-3094-1-003 af USDA-ARS til AOC.

Alle dyreforsøg blev udført efter dyrebrugsprotokol (AUP # 2020-0026) godkendt af den institutionelle dyrepleje- og brugskomité (AICUC) ved Texas A&M University. Flåtarterne Ixodes scapularis og Rhipicephalus (Boophilus) microplus og newzealandske hvide hankaniner, 42-72 dage gamle, blev brugt til denne undersøgelse. I. scapularis blev modtaget fra Center for Disease Control (CDC) og Oklahoma State University, certificeret som patogenfri. R. microplus blev opdrættet på Cattle F...

Den nuværende protokol giver en detaljeret metode til ekstraktion af miRNA fra spytkirtler og elbiler. Der er dog vigtige overvejelser, som alle er beskrevet i noterne for hvert afsnit i denne protokol. Kapslen og netmaskernet skal sikres under krydsfodring for at forhindre flåter i at slippe ud. Kapselpræparatet og placeringen er beskrevet i Koga et al.40. Flere replikater af flåtdissektionerne skal udføres, hvis en uegnet prøve kasseres. Derudover kan flere udfordringer være til stede, n?...

Flåter er ektoparasitter, der vektor mange patogener til dyreliv, husdyr, mennesker og deres kæledyr 1,2. Tick fodring resulterer i betydelige økonomiske tab ved at forårsage skade at skjule, reducere vægt og mælkeproduktion på grund af alvorlig anæmi og overførsel af potentielt dødelige sygdomsfremkaldende patogener 1,3,4,5. Den nuværende kontrolpraksis til forvaltning af flåtpopulationer er fokuseret på brugen af acaricider. Ikke desto mindre har den kontinuerlige fremkomst af acaricidresistens i flåter, der parasiterer husdyr 5,6, den øgede forekomst af flåtbid7 og patogenoverførsel inden for boligområder 8,9, ført til et behov for unikke krydskontrolalternativer.
Flåten spytkirtler er vigtige organer, der sikrer en flåts biologiske succes. De er dannet af forskellige acinustyper (I, II, III og IV) med forskellige fysiologiske funktioner. Spytkirtlerne er ansvarlige for osmoregulering, både fra og på værten, ved at returnere vandoverskud og jernindhold til værten via salivation 2,10. Type I acini er også involveret i optagelsen af vand fra atmosfæren ved udskillelse af hygroskopisk spyt10,11. Spyteffektorproteiner, såsom cement og cystatiner, produceres i sekretoriske celler i type II og III acini10,12. Type I acini påvirker ikke flåtfodring, hvilket indikerer, at blodmelsindtaget ikke udløser morfologiske og fysiologiske ændringer i disse acini type13,14. På den anden side aktiveres Acini type II og III under fodring og præsenterer meget lidt aktivitet forud for fastgørelse. Fodring er således nødvendig for at udløse udvidelsen af sekretoriske celler inden for type II acini og produktionen af bioaktive forbindelser. Type III acini reduceres i størrelse under fodring på grund af sekretionen i sekretoriske granuler12.
Spytkirtlerne er også stedet for patogeninfektion i tæsken og transmissionsvejen. Under fodring udskiller flåter flere forbindelser med farmaceutiske virkninger, der er nødvendige for en vellykket gennemførelse afblodmelet 10,15,16. Disse forbindelser har antiinflammatoriske, immunosuppressive og vasodilatoriske egenskaber 10,15,17. Nylige undersøgelser har vist, at ekstracellulære vesikler (EV'er) afledt af flåtspytkirtler har flere af disse forbindelser, hvilket inducerer antiinflammatoriske og immunmodulerende virkninger 18,19,20. "Ekstracellulære vesikler" er et paraplyudtryk, der bruges til at beskrive vesikler klassificeret som exosomer og mikrovesikler baseret på deres størrelse og biogenese. Samlet set er elbiler lipidblebs med dobbeltlagsmembraner, der er ~ 40 nm-1 μm i størrelse21; generelt beskrives exosomer som værende 40-150 nm i størrelse, mens mikrovesiler er mellem 150 nm-1 μm i størrelse 21,22,23. Størrelsen er dog ikke vejledende for elbilernes biogenesevej22.
Biogenesen af exosomer starter med den sekventielle invagination af plasmamembranen. Denne invagination fører til dannelse af multivesikulære legemer og resulterer endelig i deformation af vesikulærmembranen ved virkningen af ESCRT-komplekser eller sphingomyelinases (sMases)24,25. Exosomerne kan enten lyses i lysosomerne for at opretholde cellulær homeostase eller udgang via vesikulær fusion til plasmamembranen for at levere cellulære bestanddele til modtagercellerne21,24. På den anden side dannes mikrovesikler ved virkningen af flopasser og flipasses, hvilket ændrer konformationen af lipider i plasmamembranen26. Elbiler er afgørende for celle-til-celle-kommunikation, der fungerer som et transportsystem til intracellulær last, såsom lipider, proteiner, nukleinsyrer og mikroRNA'er (miRNA'er)21,27,28. Når de er transporteret, leverer disse vesikler deres last ind i cytoplasmaet i modtagercellerne og genererer fænotypiske ændringer i modtagercellen22,29. På grund af betydningen af ekstracellulære vesikler i krydsfodring og manipulation af værtsimmun- og sårhelingsrespons18,20 præsenterer lasten inden for ekstracellulære vesikler potentielle mål for udviklingen af anti-tick-terapi og en unik mekanisme til at forstyrre krydsfodring. Dette omfatter miRNA'er inden for flåtspytkirtler og spytkirtelafledte ekstracellulære vesikler.
miRNA'er er korte ikke-kodende sekvenser, ~ 18-22 nukleotid (nt) i længden, der efter transkriptionelt kan regulere, nedbryde eller tavse mRNA-sekvenser30,31. Under transkription spaltes pri-miRNA'erne af Dicer (RNA-polymerase III) for at danne en karakteristisk hårnållignende struktur, der bliver et præ-miRNA. Pre-miRNA'et skæres igen af Drosha (RNA-polymerase III) for at danne en moden miRNA-duplex. Den modne sekvens bliver integreret i det RNA-inducerede hæmningskompleks (RISC) komplementært til mRNA-sekvensen, hvilket forårsager translationsundertrykkelse eller mRNA-nedbrydning 28,30,32. Under værtsfodring kan miRNA'er i flåtspytmodulere værtsgenekspression for at undertrykke immunresponser og forbedre patogenoverførsel 33,34,35,36,37. Selvom der findes omfattende undersøgelser af elbiler og miRNA'er, er deres roller under fodring på tick-host-grænsefladen stadig dårligt forstået. Optimering af protokoller, der let kan resultere i isolering og rensning af miRNA'er af høj kvalitet, er afgørende for at fremme vores viden om disse emner.
Flere muligheder kan bruges til at isolere elbiler, såsom ultracentrifugering, exosomudfældning, polymerudfældning, immunoaffinitetskromatografi og størrelsesbaserede udelukkelsesteknikker38. Disse teknikker kan imidlertid ikke skelne mellem exosomer eller mikrovesikler. Som tidligere nævnt bruges ev således som en paraplybetegnelse, når elbiler isoleres fra forskellige prøver. Vesikler isoleret i de eksperimenter, der er beskrevet heri, repræsenterer en blanding af vesikler afledt af forskellige biogeneseveje. Yderligere oprensning af en specifik population af ekstracellulære vesikler kan opnås ved immunprecipitation ved anvendelse af perler belagt med antistoffer mod markører (dvs. exosomale markører, tumormarkører), der er unikke for vesikelpopulationen af interesse39,40. miRNA'er kan også udvindes via forskellige kommercielt tilgængelige isolationssæt 7,41,42.
Formålet med dette projekt var at udvikle en protokol, der kombinerer almindeligt anvendte metoder til at isolere elbiler og udtrække miRNA fra både elbiler og fodrede spytkirtler. Fordi udskillelsen af bioaktive forbindelser aktiveres ved fodring af12, bør flåter have lov til at fodre for at identificere miRNA'er, der kan være vigtige for at manipulere værtsimmun- og sårhelingsresponser. Den nuværende protokol kræver et lille antal flåter (20 flåter) for at isolere elbiler og deres respektive miRNA'er sammenlignet med andre tidligere beskrevne undersøgelser, der krævede 2000 flåter43. Desuden undgår det forurening af spytsekretioner med pilocarpin44, hvilket kan påvirke eksperimenter, der studerer effekten af elbiler og deres miRNA'er på værtsceller.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m syringe filter</td>
			<td>GenClone</td>
			<td>25-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 &#181;m nylon syringe filter</td>
			<td>Tisch Scientific</td>
			<td>283129028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 inch black adhesive</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B00FQ937NM</td>
			<td>Capsule</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL needeless syringe</td>
			<td>Exelint</td>
			<td>26265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#39; and 5&#39; Adapters</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 mm vannas scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.1523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>337922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-003-CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beads</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5425</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Macron</td>
			<td>UN1888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyverse Discovery Enviornment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://cyverse.org/discovery-environment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sideded carpet tape</td>
			<td>amazon</td>
			<td>&#8206;286373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Tubes, 50 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>FBS-02-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fine forceps</td>
			<td>Excelta</td>
			<td>5-S-SE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foamies, 2 mm</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B004M5QGBQ</td>
			<td>Capsule</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Phoenix Pharmaceuticals manfactured</td>
			<td>193.33165.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ixodes scaplaris</td>
			<td>CDC, Oklahoma State University</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L15C300 medium</td>
			<td>In-lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lipoprotein-cholesterol concentrate</td>
			<td>MPI</td>
			<td>02191476-CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10118-596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRDeep2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/rajewsky-lab/mirdeep2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-MuLV Reverse Transcriptase</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>molecular grade ethanol</td>
			<td>Fischer Bioreagents</td>
			<td>UN1170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multi-well 24 well tissue culture treated plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanopaticle Tracking Analyzer machine</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosep with 300K Omega filter</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>OD3003C33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit v3</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq 500/550 High Output Kit (75 cycles)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XPN 90 Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>Thermofischer Scientific</td>
			<td>ICN19453780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pippettes</td>
			<td>Ependorff</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polycarbonate centrifuge bottle</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen miRNeasy kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAzol lysis reagent</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>Q32880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit kit</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>Q10212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbits</td>
			<td>Charles River</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Universal Primer</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhipicephalus microplus</td>
			<td>Cattle Fever Tick Research Labratoty</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Fischer Bioreagents</td>
			<td>215544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>833280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse free tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse inhibitor</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>11111729</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse/DNAse free water</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Minelute spin column</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217084</td>
			<td>Qiagen miRNeasy kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPE Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217084</td>
			<td>Qiagen miRNeasy kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT Buffer</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-seq kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT Forward Primer</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-seq kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTE Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217084</td>
			<td>Qiagen miRNeasy kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6014-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall ST16</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>75004380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized Gauze sponges</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>2187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized PBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>RNBK0694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>streptomycin</td>
			<td>thermofischer Scientific</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TapeStation</td>
			<td>Aligent</td>
			<td>G2991BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tear Mender Instant Fabric and Leather Adhesive</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>7.42836E+11</td>
			<td>Capsule</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Adhesive</td>
			<td>3M VetBond</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triple Antibiotics</td>
			<td>dechra</td>
			<td>17033-122-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptose phosphate broth</td>
			<td>BD</td>
			<td>BD 260300</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of micrornas from tick ex vivo salivary gland cultures and extracellular vesicles

Flåter er vigtige ektoparasitter, der kan vektor flere patogener. Spytkirtlerne i flåter er afgørende for fodring, da deres spyt indeholder mange effektorer med farmaceutiske egenskaber, der kan mindske værtsimmunrespons og forbedre patogenoverførsel. En gruppe af sådanne effektorer er mikroRNA'er (miRNA'er). miRNA'er er korte ikke-kodende sekvenser, der regulerer værtsgenekspression ved tick-host-grænsefladen og i flåtens organer. Disse små RNA'er transporteres i flåtspyt via ekstracellulære vesikler (EV'er), som tjener inter- og intracellulær kommunikation. Vesikler indeholdende miRNA'er er blevet identificeret i spyt af flåter. Imidlertid er der lidt kendt om roller og profiler af miRNA'erne i kryds spytvesikler og kirtler. Desuden kræver undersøgelsen af vesikler og miRNA'er i krydsspyt kedelige procedurer for at indsamle flåtspyt. Denne protokol har til formål at udvikle og validere en metode til isolering af miRNA'er fra rensede ekstracellulære vesikler produceret af ex vivo-organkulturer . De materialer og metoder, der er nødvendige for at udtrække miRNA'er fra ekstracellulære vesikler og flåtspytkirtler, er beskrevet heri.

Den nuværende protokol giver en detaljeret metode til at udtrække miRNA'er fra spytkirtler og elbiler. Ifølge resultaterne er denne protokol effektiv til isolering af miRNA fra voksne af to forskellige flåtarter, I. scapularis og R. microplus, og kan potentielt også anvendes i andre flåtarter. Ev'ernes koncentration (partikler/ml) blev målt via NTA. For R. microplus indeholdt hvert køn og livsstadium tre biologiske replikater målt i tre tekniske replikater. Prøverne blev adsk...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles at JoVE.com

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

Den nuværende protokol beskriver isoleringen af mikroRNA'er fra flåtspytkirtler og rensede ekstracellulære vesikler. Dette er en universel procedure, der kombinerer almindeligt anvendte reagenser og forsyninger. Metoden tillader også brugen af et lille antal flåter, hvilket resulterer i mikroRNA'er af høj kvalitet, der let kan sekventeres.

Isolering af mikroRNA'er fra Tick Ex Vivo spytkirtelkulturer og ekstracellulære vesikler

Ticks are important ectoparasites that can vector multiple pathogens. The salivary glands of ticks are essential for feeding as their saliva contains many ...

Denne protokol giver os mulighed for at bruge et reduceret antal flåter, hvilket reducerer omkostningerne ved kolonivedligeholdelse og reducerer antallet af hvirvler, der er nødvendige til flåtfodring. Denne protokol kræver ca. 20 flåter. Den største fordel bortset fra at bruge en lille prøvestørrelse er imidlertid, at denne protokol kan anvendes på flere flåtarter og forskellige livsstadier.Bortset fra flåtdissektioner eller anvendelse mod værts-parasit-interaktioner, effekten af patogeninfektion på mikroRNA-sekretion og effekten af fysiologiske ændringer på mikroRNA udskilt af flåter. Til at begynde med skal du forberede vesikelfrie medier ved at tilføje føtalt bovint serum, tryptosephosphat bouillon, 10% lipoproteinkolesterolkoncentrat, 5% natriumbicarbonat, HEPES og L15C300 medium i en 26,3 milliliter polycarbonatcentrifugeflaske og justere lydstyrken efter behov. Nu ultracentrifuge mediet ved 100.000 gange G ved fire grader Celsius i 18 timer.Fjern forsigtigt supernatanten uden at forstyrre pelleten, og overfør supernatanten til et frisk centrifugerør. Ultracentrifuge røret igen. Tag supernatanten og før den gennem et 0,22 mikrometer filter for at fjerne forurenende stoffer.Supernatanten pipetteres i et 50 ml centrifugerør, og opbevar den ved minus 20 grader Celsius, indtil det er nødvendigt eller op til tre år. Tilsæt en passende mængde antibiotika til 500 mikroliter af det vesikelfrie medium i hver brønd på en 24-brønds kulturplade. Tilføj nu PBS med rifampicin til de brønde, der ikke indeholder vesikelfrit medium for at forhindre bakterievækst.Placer flåterne på et glasglas med dobbeltsidet tæppebånd under et dissekerende mikroskop. Før dissektion tilsættes PBS indeholdende rifampicin til flåten og ved hjælp af fire millimeter Vannas saks, lav et snit på cirka en millimeter på siden af hver kvinde. Fjern nu flåtens dorsale side og spytkirtler, og sæt derefter 20 til 40 flåtspytkirtler i 500 mikroliter vesikelfrit medium tilsat til en enkelt brønd i en 24-brønds vævskulturbehandlet plade.Inkuber spytkirtelprøverne ved 32 grader Celsius i 24 timer for at tillade udskillelse af de ekstracellulære vesikler. Ved afslutningen af inkubationen pipetteres hele mediet indeholdende spytkirtlerne i et 1,5 ml mikrocentrifugerør og centrifuge ved 300 gange G ved fire grader Celsius i 10 minutter. Overfør supernatanten til et nyt 1,5 ml mikrocentrifugerør.Resuspender pelleten indeholdende spytkirtlerne i RNA senere og opbevares ved minus 80 grader Celsius, indtil den er brugt eller på ubestemt tid. Fjern nu celleaffaldet ved at centrifugere supernatanten ved 2.000 gange G ved fire grader Celsius i 10 minutter og pipettere supernatanten til et nyt 1,5 milliliter mikrocentrifugerør. Derefter centrifugeres ved 10.000 gange G i 30 minutter ved fire grader Celsius for at fjerne apoptotiske legemer og større ekstracellulære vesikler og overføre supernatanten til et frisk 1,5 milliliter mikrocentrifugerør.Saml derefter et enmikrometer nylonsprøjtefilter på en 10 milliliter sprøjte og hold det på et ultracentrifugerør. Derefter tilsættes prøven og fyld sprøjten med 10 ml PBS. Før supernatanten gennem filteret ind i røret.Efter filtrering og afbalancering af rørene skal du placere dem i en 70 Ti-rotor og ultracentrifuge rørene ved 100.000 gange G i 18 timer ved fire grader Celsius. De koncentrerede ekstracellulære vesikler danner en pellet efter ultracentrifugering. Supernatanten fjernes uden at forstyrre pelleten, og pelleten genoptages i PBS.Pipetter 500 mikroliter af den ekstracellulære vesikel i et 300 K centrifugalfilter og centrifuge ved 8.000 gange G i 10 minutter ved omgivelsestemperatur, og gentag denne procedure, indtil alle ekstracellulære vesikler er filtreret. Til sidst tilsættes 400 mikroliter steriliseret PBS til søjlen og blandes grundigt for at fjerne ekstracellulære vesikler fastgjort til membranen. Derefter sættes prøven i et 1,5 milliliter DNAase RNAse-frit rør.Koncentrationen og størrelsen af ekstracellulære vesikler varierede afhængigt af køn og livsstadiet af flåterne mellem de biologiske replikater for kvinder, mænd og nymfer. For alle kombinerede biologiske replikater blev der observeret lignende resultater. Analyse af små RNA'er isoleret fra spytkirtlen viste bånd svarende til ribosomalt RNA og mikroRNA'er.Imidlertid var de ribosomale RNA'er fraværende i vesiklerne isoleret fra spytkirtlerne, og mikroRNA-prøver oprenset fra ekstracellulære vesikler viste mere nedbrydning. Efter berigelse viste mikroRNA-prøverne oprenset fra elbiler minimal nedbrydning og tilstrækkelig mikroRNA-koncentration til cDNA-bibliotekssyntese. Den forventede båndstørrelse på ca. 150 basepar efter cDNA-biblioteksforberedelse blev opnået, betyder små RNA cDNA-biblioteker.Under vesikelfri forberedelse skal du sørge for at følge trinene for at forhindre ekstern vesikelforurening. Under brøndpladeforberedelse skal du sørge for at tilføje antibiotika for at forhindre bakteriel forurening fra flåtmikrobiomet. De mikroRNA'er, der ekstraheres ved hjælp af denne protokol, kan bruges til profilering og funktionelle eksperimenter til at validere mikroRNA-roller såsom forudsigelse af mikroRNA-vejmål, hæmning og efterligningseksperimenter.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of ...

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

The genetically tractable model organism C. elegans has provided insights into a myriad of biological questions, enabled by its short generation time, ...

Isolation of Basal Cells and Submucosal Gland Duct Cells from Mouse Trachea

Isolering af basale celler og submucosal Gland Duct celler fra mus Luftrøret

The large airways are directly in contact with the environment and therefore susceptible to injury from toxins and infectious agents that we breath in 1. ...

Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures

Genetisk modifikation og Rekombination af spytkirtel organkulturer

Branching  morphogenesis occurs during the development of many organs, and the embryonic  mouse submandibular gland (SMG) is a classical model for the ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

Naive voksne stamceller Isolering fra primære humane fibroblastkulturer

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Isolation of Intact, Whole Mouse Mammary Glands for Analysis of Extracellular Matrix Expression and Gland Morphology

Isolering af intakt, hele musen mælkekirtlerne for analyse af ekstracellulære Matrix udtryk og morfologi, kirtel

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal ...

Isolation of Retinal Arterioles for Ex Vivo Cell Physiology Studies

Isolation of Retinal Arterioles for Ex Vivo Cell Physiology Studies

Isolering af retinale arterioler for Ex Vivo celle fysiologi undersøgelser

The retina is a highly metabolically active tissue that requires a substantial blood supply. The retinal circulation supports the inner retina, while the ...

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

Flow Cytometric analyse af ekstracellulære vesikler fra celle-aircondition medier

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Rensning og analyse af Caenorhabditis elegans Ekstracellulære Vesicles

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Skalerbar isolering og oprensning af ekstracellulære vesikler fra Escherichia coli og andre bakterier

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...