Name: isolation of micrornas from tick ex vivo salivary gland cultures and extracellular vesicles
Uploaded: 2022-04-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles at JoVE.com

We zijn zeer dankbaar voor de hulp van het Cattle Fever tick Laboratory in Edinburg, Texas. We willen Michael Moses, Jason Tidwell, James Hellums, Cesario Agado en Homer Vasquez bedanken. We willen ook de hulp van Sarah Sharpton, Elizabeth Lohstroh, Amy Filip, Kelsey Johnson, Kelli Kochcan, Andrew Hillhouse, Charluz Arocho Rosario en Stephanie Guzman Valencia tijdens het project bedanken. We willen de Texas A&M Aggie Women in Entomology (AWE) Writing Group bedanken voor hun hulp en advies tijdens het schrijven van dit manuscript. De volgende reagentia werden geleverd door Centers for Disease Control and Prevention voor distributie door BEI Resources, NIAID, NIH: Ixodes scapularis Adult (Live), NR-42510. Vrouwelijke I. scapularis-teken werden ook ontvangen van de Tick Rearing Facility aan de Oklahoma State University. Dit project werd gefinancierd door Texas A&M University T3: triades voor transformatiesubsidie en de samenwerkingsovereenkomst #58-3094-1-003 door de USDA-ARS aan AOC.

Alle dierproeven werden uitgevoerd volgens het dierlijke gebruiksprotocol (AUP # 2020-0026) goedgekeurd door de institutionele commissie voor dierenverzorging en -gebruik (AICUC) aan de Texas A &M University. De tekensoorten Ixodes scapularis en Rhipicephalus (Boophilus) microplus, en Nieuw-Zeelandse mannelijke witte konijnen, 42-72 dagen oud, werden gebruikt voor de huidige studie. I. scapularis werd ontvangen van het Center for Disease Control (CDC) en Oklahoma State University, gecertificeer...

Het huidige protocol biedt een gedetailleerde methodologie voor het extraheren van miRNA uit speekselklieren en EV's. Er zijn echter belangrijke overwegingen, die allemaal worden beschreven in de opmerkingen voor elke sectie van dit protocol. De capsule en het gaas moeten tijdens het voeren van de teken worden vastgezet om te voorkomen dat teken ontsnappen. De voorbereiding en plaatsing van de capsule worden beschreven in Koga et al.40. Verschillende replica's van de tekendissecties moeten worden ...

Teken zijn ectoparasieten die veel ziekteverwekkers overbrengen naar dieren in het wild, vee, mensen en hun huisdieren 1,2. Tekenvoeding resulteert in aanzienlijk economisch verlies door schade aan de huid te veroorzaken, het gewicht en de melkproductie te verminderen als gevolg van ernstige bloedarmoede en de overdracht van potentieel dodelijke ziekteverwekkende pathogenen 1,3,4,5. De huidige bestrijdingspraktijken voor het beheer van tekenpopulaties zijn gericht op het gebruik van acariciden. Niettemin hebben de voortdurende opkomst van acaricideresistentie bij teken die vee parasiteren 5,6, de verhoogde incidentie van tekenbeten7 en de overdracht van ziekteverwekkers binnen woonwijken 8,9, geleid tot een behoefte aan unieke tekenbestrijdingsalternatieven.
De speekselklieren zijn essentiële organen die zorgen voor het biologische succes van een teek. Ze worden gevormd door verschillende acinustypen (I, II, III en IV) met verschillende fysiologische functies. De speekselklieren zijn verantwoordelijk voor osmoregulatie, zowel uit als op de gastheer, door wateroverschot en ijzergehalte terug te geven aan de gastheer via speekselvloed 2,10. Type I acini zijn ook betrokken bij de opname van water uit de atmosfeer door de afscheiding van hygroscopisch speeksel10,11. Speekseleffectoreiwitten, zoals cement en cystatinen, worden geproduceerd in secretoire cellen in type II en III acini 10,12. Type I acini heeft geen invloed op de tekenvoeding, wat aangeeft dat de inname van bloedmeel geen morfologische en fysiologische veranderingen teweegbrengt bij deze acini type13,14. Aan de andere kant worden Acini type II en III geactiveerd tijdens het voeden en vertonen ze zeer weinig activiteit voorafgaand aan de hechting. Voeding is dus noodzakelijk om de vergroting van de secretoire cellen binnen type II acini en de productie van bioactieve stoffen te activeren. Type III acini worden tijdens het voeren verkleind als gevolg van de secretie in de secretoire korrels12.
De speekselklieren zijn ook de plaats van pathogene infectie in de teek en de transmissieroute. Tijdens het voeren scheiden teken verschillende verbindingen af met farmaceutische effecten die nodig zijn voor een succesvolle voltooiing van het bloedmeel 10,15,16. Deze verbindingen hebben ontstekingsremmende, immunosuppressieve en vaatverwijdende eigenschappen 10,15,17. Recente studies hebben aangetoond dat extracellulaire blaasjes (EV's) afgeleid van teken speekselklieren verschillende van deze verbindingen bevatten, waardoor ontstekingsremmende en immunomodulerende effecten worden opgewekt 18,19,20. "Extracellulaire blaasjes" is een overkoepelende term die wordt gebruikt om blaasjes te beschrijven die zijn geclassificeerd als exosomen en microvesicles op basis van hun grootte en biogenese. Over het algemeen zijn EV's lipide blebs met dubbellaagse membranen die ~ 40 nm-1 μm zijn in grootte21; over het algemeen worden exosomen beschreven als 40-150 nm groot, terwijl microvesicles tussen 150 nm-1 μm zijn in grootte 21,22,23. De grootte is echter niet indicatief voor de EVs biogenese route22.
De biogenese van exosomen begint met de sequentiële invaginatie van het plasmamembraan. Deze invaginatie leidt tot de vorming van multivesiculaire lichamen en resulteert uiteindelijk in de vervorming van het vesiculaire membraan door de werking van ESCRT-complexen of sfingomyelinases (sMases)24,25. De exosomen kunnen ofwel in de lysosomen worden gelyseerd om cellulaire homeostase te behouden of via vesiculaire fusie naar het plasmamembraan worden afgevoerd om cellulaire bestanddelen aan de ontvangende cellen te leveren21,24. Aan de andere kant worden microvesicles gevormd door de werking van flopasses en flipasses, waardoor de conformatie van lipiden in het plasmamembraan verandert26. EV's zijn essentieel voor cel-naar-cel communicatie en dienen als een transportsysteem voor intracellulaire lading, zoals lipiden, eiwitten, nucleïnezuren en microRNA's (miRNA's)21,27,28. Eenmaal vervoerd, leveren deze blaasjes hun lading af in het cytoplasma van de ontvangende cellen, waardoor fenotypische veranderingen in de ontvangende cel worden gegenereerd22,29. Vanwege het belang van extracellulaire blaasjes bij het voeren van teken en de manipulatie van immuun- en wondgenezingsreacties van de gastheer18,20, biedt de lading in extracellulaire blaasjes potentiële doelen voor de ontwikkeling van anti-tekentherapieën en een uniek mechanisme om tekenvoeding te verstoren. Dit omvat miRNA's in teken speekselklieren en speekselklier-afgeleide extracellulaire blaasjes.
miRNA's zijn korte niet-coderende sequenties, ~ 18-22 nucleotide (nt) lang, die post-transcriptioneel mRNA-sequenties kunnen reguleren, afbreken of dempen30,31. Tijdens transcriptie worden de pri-miRNA's gesplitst door Dicer (RNA polymerase III) om een onderscheidende haarspeldachtige structuur te vormen en een pre-miRNA te worden. Het pre-miRNA wordt opnieuw gesneden door Drosha (RNA polymerase III) om een volwassen miRNA duplex te vormen. De volwassen sequentie wordt geïntegreerd in het RNA-geïnduceerde silencing complex (RISC) complementair aan de mRNA-sequentie, waardoor translatierepressie of mRNA-afbraak 28,30,32 ontstaat. Tijdens het voeden van de gastheer kunnen miRNA's in het speeksel van de teek de genexpressie van de gastheer moduleren om immuunresponsen te onderdrukken en de overdracht van pathogenente verbeteren 33,34,35,36,37. Hoewel er uitgebreide studies over EV's en miRNA's bestaan, zijn hun rollen tijdens het voeden op de tick-host-interface nog steeds slecht begrepen. Het optimaliseren van protocollen die gemakkelijk kunnen resulteren in de isolatie en zuivering van hoogwaardige miRNA's is cruciaal voor het bevorderen van onze kennis over deze onderwerpen.
Meerdere opties kunnen worden gebruikt om EV's te isoleren, zoals ultracentrifugatie, exosoomprecipitatie, polymeerprecipitatie, immunoaffiniteitschromatografie en op grootte gebaseerde uitsluitingstechnieken38. Deze technieken kunnen echter geen onderscheid maken tussen exosomen of microvesicles. Dus, zoals eerder vermeld, wordt EV gebruikt als een overkoepelende term bij het isoleren van EV's uit verschillende monsters. De blaasjes die in de hierin beschreven experimenten worden geïsoleerd, vertegenwoordigen een mengsel van blaasjes die zijn afgeleid van verschillende biogeneseroutes. Verdere zuivering van een specifieke populatie van extracellulaire blaasjes kan worden bereikt door immunoprecipitatie met behulp van kralen bedekt met antilichamen tegen markers (d.w.z. exosomale markers, tumormarkers) die uniek zijn voor de blaasjespopulatie van belang 39,40. miRNA's kunnen ook worden geëxtraheerd via verschillende in de handel verkrijgbare isolatiekits 7,41,42.
Het doel van dit project was om een protocol te ontwikkelen dat veelgebruikte methoden combineert om EV's te isoleren en miRNA te extraheren uit zowel EV's als speekselklieren. Omdat de afscheiding van bioactieve stoffen wordt geactiveerd door12 te voeren, moeten teken kunnen voeden om miRNA's te identificeren die belangrijk kunnen zijn voor het manipuleren van immuun- en wondgenezingsreacties van de gastheer. Het huidige protocol vereist een klein aantal teken (20 teken) om EV's en hun respectieve miRNA's te isoleren, vergeleken met andere eerder beschreven studies die 2000 teken43 vereisten. Verder vermijdt het de besmetting van speekselafscheidingen met pilocarpine44, wat van invloed kan zijn op experimenten die het effect van EV's en hun miRNA's op gastheercellen bestuderen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m syringe filter</td>
			<td>GenClone</td>
			<td>25-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 &#181;m nylon syringe filter</td>
			<td>Tisch Scientific</td>
			<td>283129028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 inch black adhesive</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B00FQ937NM</td>
			<td>Capsule</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL needeless syringe</td>
			<td>Exelint</td>
			<td>26265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#39; and 5&#39; Adapters</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 mm vannas scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.1523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>337922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-003-CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beads</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5425</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Macron</td>
			<td>UN1888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyverse Discovery Enviornment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://cyverse.org/discovery-environment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sideded carpet tape</td>
			<td>amazon</td>
			<td>&#8206;286373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Tubes, 50 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>FBS-02-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fine forceps</td>
			<td>Excelta</td>
			<td>5-S-SE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foamies, 2 mm</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B004M5QGBQ</td>
			<td>Capsule</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Phoenix Pharmaceuticals manfactured</td>
			<td>193.33165.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ixodes scaplaris</td>
			<td>CDC, Oklahoma State University</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L15C300 medium</td>
			<td>In-lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lipoprotein-cholesterol concentrate</td>
			<td>MPI</td>
			<td>02191476-CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10118-596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRDeep2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/rajewsky-lab/mirdeep2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-MuLV Reverse Transcriptase</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>molecular grade ethanol</td>
			<td>Fischer Bioreagents</td>
			<td>UN1170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multi-well 24 well tissue culture treated plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanopaticle Tracking Analyzer machine</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosep with 300K Omega filter</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>OD3003C33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit v3</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq 500/550 High Output Kit (75 cycles)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XPN 90 Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>Thermofischer Scientific</td>
			<td>ICN19453780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pippettes</td>
			<td>Ependorff</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polycarbonate centrifuge bottle</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen miRNeasy kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAzol lysis reagent</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>Q32880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit kit</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>Q10212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbits</td>
			<td>Charles River</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Universal Primer</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhipicephalus microplus</td>
			<td>Cattle Fever Tick Research Labratoty</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Fischer Bioreagents</td>
			<td>215544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>833280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse free tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse inhibitor</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>11111729</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse/DNAse free water</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Minelute spin column</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217084</td>
			<td>Qiagen miRNeasy kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPE Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217084</td>
			<td>Qiagen miRNeasy kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT Buffer</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-seq kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT Forward Primer</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-seq kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTE Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217084</td>
			<td>Qiagen miRNeasy kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6014-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall ST16</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>75004380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized Gauze sponges</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>2187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized PBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>RNBK0694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>streptomycin</td>
			<td>thermofischer Scientific</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TapeStation</td>
			<td>Aligent</td>
			<td>G2991BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tear Mender Instant Fabric and Leather Adhesive</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>7.42836E+11</td>
			<td>Capsule</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Adhesive</td>
			<td>3M VetBond</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triple Antibiotics</td>
			<td>dechra</td>
			<td>17033-122-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptose phosphate broth</td>
			<td>BD</td>
			<td>BD 260300</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of micrornas from tick ex vivo salivary gland cultures and extracellular vesicles

Teken zijn belangrijke ectoparasieten die meerdere pathogenen kunnen overbrengen. De speekselklieren van teken zijn essentieel voor het voeden, omdat hun speeksel veel effectoren bevat met farmaceutische eigenschappen die de immuunrespons van de gastheer kunnen verminderen en de overdracht van ziekteverwekkers kunnen verbeteren. Een groep van dergelijke effectoren zijn microRNA's (miRNA's). miRNA's zijn korte niet-coderende sequenties die de genexpressie van de gastheer reguleren op de teken-gastheerinterface en in de organen van de teek. Deze kleine RNA's worden in het tekenspeeksel getransporteerd via extracellulaire blaasjes (EV's), die inter- en intracellulaire communicatie dienen. Blaasjes met miRNA's zijn geïdentificeerd in het speeksel van teken. Er is echter weinig bekend over de rollen en profielen van de miRNA's in speekselblaasjes en -klieren. Bovendien vereist de studie van blaasjes en miRNA's in tekenspeeksel vervelende procedures om tekenspeeksel te verzamelen. Dit protocol heeft tot doel een methode te ontwikkelen en te valideren voor het isoleren van miRNA's van gezuiverde extracellulaire blaasjes geproduceerd door ex vivo orgaanculturen. De materialen en methodologie die nodig zijn om miRNA's uit extracellulaire blaasjes en speekselklieren te extraheren, worden hierin beschreven.

Het huidige protocol biedt een gedetailleerde methodologie om miRNA's uit speekselklieren en EV's te extraheren. Volgens de resultaten is dit protocol effectief voor de isolatie van miRNA van volwassenen van twee verschillende tekensoorten, I. scapularis en R. microplus, en kan het mogelijk ook bij andere tekensoorten worden gebruikt. De EV-concentratie (deeltjes/ml) werd gemeten via NTA. Voor R. microplus bevatte elk geslacht en elke levensfase drie biologische replicaties gemeten in ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles at JoVE.com

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

Het huidige protocol beschrijft de isolatie van microRNA's uit teken speekselklieren en gezuiverde extracellulaire blaasjes. Dit is een universele procedure die veelgebruikte reagentia en benodigdheden combineert. De methode maakt ook het gebruik van een klein aantal teken mogelijk, wat resulteert in hoogwaardige microRNA's die gemakkelijk kunnen worden gesequenced.

Isolatie van microRNA's van Tick Ex Vivo Speekselklierculturen en Extracellulaire Blaasjes

Ticks are important ectoparasites that can vector multiple pathogens. The salivary glands of ticks are essential for feeding as their saliva contains many ...

Dit protocol stelt ons in staat om een verminderd aantal teken te gebruiken, wat de kosten van kolonieonderhoud vermindert en het aantal werveldieren vermindert dat nodig is voor het voeren van teken. Dit protocol vereist ongeveer 20 teken. Het belangrijkste voordeel naast het gebruik van een kleine steekproefgrootte is echter dat dit protocol kan worden toegepast op meerdere tekensoorten en verschillende levensfasen.Afgezien van tekendissecties of de toepassing op gastheer-parasietinteracties, het effect van pathogene infectie op microRNA-secretie en het effect van fysiologische veranderingen op microRNA uitgescheiden door teken. Bereid om te beginnen vesikelvrije media door foetaal runderserum, tryptosefosfaatbouillon, 10% lipoproteïnecholesterolconcentraat, 5% natriumbicarbonaat, HEPES en L15C300-medium toe te voegen aan een 26,3 milliliter polycarbonaatcentrifugefles en pas het volume indien nodig aan. Ultracentrifugeer nu het medium op 100, 000 keer G bij vier graden Celsius gedurende 18 uur.Verwijder het supernatant voorzichtig zonder de pellet te verstoren en breng het supernatant over naar een verse centrifugebuis. Ultracentrifugeer de buis nogmaals. Neem het supernatant en laat het door een filter van 0,22 micrometer lopen om verontreinigingen te verwijderen.Pipetteer het supernatant in een centrifugebuis van 50 milliliter en bewaar het bij min 20 graden Celsius totdat het nodig is of tot drie jaar. Voeg een geschikte hoeveelheid antibiotica toe aan 500 microliter van het blaasjesvrije medium in elk putje van een kweekplaat met 24 putten. Voeg nu PBS met rifampicine toe aan de putjes die geen vesikelvrij medium bevatten om bacteriegroei te voorkomen.Plaats de teken op een glazen dia met dubbelzijdige tapijttape onder een ontleedmicroscoop. Voeg vóór dissectie PBS met rifampicine toe aan de teek en maak met behulp van een Vannas-schaar van vier millimeter een incisie van ongeveer een millimeter aan de zijkant van elk vrouwtje. Verwijder nu de dorsale kant en speekselklieren van de teek en plaats vervolgens 20 tot 40 tekens speekselklieren in 500 microliter blaasjesvrij medium toegevoegd aan een enkele put in een 24-well weefselkweek behandelde plaat.Incubeer de speekselkliermonsters bij 32 graden Celsius gedurende 24 uur om de afscheiding van de extracellulaire blaasjes mogelijk te maken. Pipetteer aan het einde van de incubatie al het medium dat de speekselklieren bevat in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter en centrifugeer gedurende 10 minuten op 300 keer G bij vier graden Celsius. Breng het supernatant over in een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 milliliter.Resuspendeer de pellet met de speekselklieren later in RNA en bewaar bij min 80 graden Celsius totdat het wordt gebruikt of voor onbepaalde tijd. Verwijder nu het cellulaire vuil door het supernatant gedurende 10 minuten op 2.000 keer G bij vier graden Celsius te centrifugeren en pipetteer het supernatant in een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 milliliter. Centrifugeer vervolgens op 10.000 keer G gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius om apoptotische lichamen en grotere extracellulaire blaasjes te verwijderen en breng het supernatant over naar een verse microcentrifugebuis van 1,5 milliliter.Monteer vervolgens een nylon spuitfilter van één micrometer op een spuit van 10 milliliter en bewaar deze op een ultracentrifugebuis. Voeg vervolgens het monster toe en vul de spuit met 10 milliliter PBS. Giet het supernatant door het filter in de buis.Na het filteren en balanceren van de buizen, plaats ze in een rotor van 70 Ti en ultracentrifugeer de buizen op 100. 000 keer G gedurende 18 uur bij vier graden Celsius. De geconcentreerde extracellulaire blaasjes vormen een pellet na ultracentrifugatie. Verwijder het supernatant zonder de pellet te verstoren en resuspendeer de pellet in PBS.Pipetteer 500 microliter van het extracellulaire blaasje in een centrifugaalfilter van 300 K en centrifugeer op 8.000 maal G gedurende 10 minuten bij omgevingstemperatuur en herhaal deze procedure totdat alle extracellulaire blaasjes zijn gefilterd. Voeg ten slotte 400 microliter gesteriliseerde PBS toe aan de kolom en meng grondig om extracellulaire blaasjes te verwijderen die aan het membraan zijn bevestigd. Doe het monster vervolgens in een 1,5 milliliter DNAase RNAse-vrije buis.De concentratie en grootte van extracellulaire blaasjes varieerden afhankelijk van het geslacht en de levensfase van de teken tussen de biologische replicaties voor vrouwtjes, mannetjes en nimfen. Voor alle gecombineerde biologische replicaties werden vergelijkbare resultaten waargenomen. Analyse van kleine RNA's geïsoleerd uit de speekselklier toonde banden die overeenkomen met ribosomaal RNA en microRNA's.De ribosomale RNA's waren echter afwezig in de blaasjes geïsoleerd uit de speekselklieren, en microRNA-monsters gezuiverd uit extracellulaire blaasjes vertoonden meer afbraak. Na verrijking vertoonden de microRNA-monsters gezuiverd uit EV's minimale afbraak en voldoende microRNA-concentratie voor cDNA-bibliotheeksynthese. De verwachte bandgrootte van ongeveer 150 basenparen nadat cDNA-bibliotheekvoorbereiding werd verkregen, betekent kleine RNA cDNA-bibliotheken.Zorg er tijdens de vesikelvrije bereiding voor dat u de stappen volgt om externe vesikelbesmetting te voorkomen. Zorg er tijdens de voorbereiding van de putplaat voor dat u antibiotica toevoegt om bacteriële besmetting door het tekenmicrobioom te voorkomen. De microRNA's die met behulp van dit protocol worden geëxtraheerd, kunnen worden gebruikt voor profilering en functionele experimenten om microRNA-rollen te valideren, zoals het voorspellen van microRNA-routedoelen, remming en mimicry-experimenten.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells

Isolatie van Mouse speekselklier Stem Cells

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of ...

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

Vampiric Isolatie van extracellulaire vloeistof uit<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The genetically tractable model organism C. elegans has provided insights into a myriad of biological questions, enabled by its short generation time, ...

Isolation of Basal Cells and Submucosal Gland Duct Cells from Mouse Trachea

Isolatie van basale cellen en Submucosale Gland Duct Cellen van Mouse Luchtpijp

The large airways are directly in contact with the environment and therefore susceptible to injury from toxins and infectious agents that we breath in 1. ...

Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures

Genetische Modificatie en recombinatie van speekselklier Orgel culturen

Branching  morphogenesis occurs during the development of many organs, and the embryonic  mouse submandibular gland (SMG) is a classical model for the ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

Naïve Volwassen stamcellen Isolatie van primaire humane fibroblastkweken

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Isolation of Intact, Whole Mouse Mammary Glands for Analysis of Extracellular Matrix Expression and Gland Morphology

Isolatie van Intact, hele muis borstklieren p.a. van extracellulaire Matrix expressie en klier morfologie

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal ...

Isolation of Retinal Arterioles for Ex Vivo Cell Physiology Studies

Isolation of Retinal Arterioles for Ex Vivo Cell Physiology Studies

Isolatie van retinale arteriolen voor Ex Vivo cel fysiologie Studies

The retina is a highly metabolically active tissue that requires a substantial blood supply. The retinal circulation supports the inner retina, while the ...

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

Cytometrische analyse van extracellulaire blaasjes van cel-geconditioneerd Media stromen

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Zuivering en analyse van Caenorhabditis elegans Extracellular Blaasjes

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Schaalbare isolatie en zuivering van extracellulaire blaasjes van Escherichia coli en andere bacteriën

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...