Name: isolation of micrornas from tick ex vivo salivary gland cultures and extracellular vesicles
Uploaded: 2022-04-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles at JoVE.com

Nous sommes très reconnaissants de l’aide du Cattle Fever Tick Laboratory à Edinburg, au Texas. Nous tenons à remercier Michael Moses, Jason Tidwell, James Hellums, Cesario Agado et Homer Vasquez. Nous tenons également à remercier Sarah Sharpton, Elizabeth Lohstroh, Amy Filip, Kelsey Johnson, Kelli Kochcan, Andrew Hillhouse, Charluz Arocho Rosario et Stephanie Guzman Valencia tout au long du projet. Nous tenons à remercier le Texas A&M Aggie Women in Entomology (AWE) Writing Group pour son aide et ses conseils lors de la rédaction de ce manuscrit. Les réactifs suivants ont été fournis par les Centers for Disease Control and Prevention pour distribution par BEI Resources, NIAID, NIH: Ixodes scapularis Adult (Live), NR-42510. Des tiques femelles I. scapularis ont également été reçues du Tick Rearing Facility de l’Oklahoma State University. Ce projet a été financé par texas a &M University T3: triades pour la subvention de transformation et l’accord de coopération n ° 58-3094-1-003 par l’USDA-ARS à AOC.

Toutes les expériences sur les animaux ont été effectuées conformément au protocole d’utilisation des animaux (AUP # 2020-0026) approuvé par le comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (AICUC) de la Texas A & M University. Les espèces de tiques, Ixodes scapularis et Rhipicephalus (Boophilus) microplus, et les lapins blancs mâles de Nouvelle-Zélande, âgés de 42 à 72 jours, ont été utilisés pour la présente étude. I. scapularis a été reçu du Center for ...

Le protocole actuel fournit une méthodologie détaillée pour extraire les miARN des glandes salivaires et des VE. Cependant, il y a des considérations importantes, qui sont toutes détaillées dans les notes pour chaque section de ce protocole. La capsule et le filet en maille doivent être fixés pendant l’alimentation des tiques pour empêcher les tiques de s’échapper. La préparation et la mise en place de la capsule sont décrites dans Koga et al.40. Plusieurs répétitions des dissect...

Les tiques sont des ectoparasites qui transmettent de nombreux agents pathogènes à la faune, au bétail, aux humains et à leurs animaux de compagnie 1,2. L’alimentation des tiques entraîne des pertes économiques importantes en causant des dommages à la peau, en réduisant le poids et la production de lait en raison d’une anémie sévère et de la transmission d’agents pathogènes potentiellement mortels 1,3,4,5. Les pratiques de contrôle actuelles pour la gestion des populations de tiques sont axées sur l’utilisation d’acaricides. Néanmoins, l’émergence continue de la résistance aux acaricides chez les tiques parasitant le bétail 5,6, l’incidence accrue des piqûres de tiques7 et la transmission d’agents pathogènes dans les zones résidentielles 8,9 ont conduit à un besoin de solutions de rechange uniques pour la lutte contre les tiques.
Les glandes salivaires des tiques sont des organes essentiels qui assurent le succès biologique d’une tique. Ils sont formés par différents types d’acinus (I, II, III et IV) avec diverses fonctions physiologiques. Les glandes salivaires sont responsables de l’osmorégulation, à la fois hors et sur l’hôte, en renvoyant l’excès d’eau et la teneur en fer à l’hôte via la salivation 2,10. Les acini de type I sont également impliqués dans l’absorption de l’eau de l’atmosphère par la sécrétion de salive hygroscopique10,11. Les protéines effectrices salivaires, telles que le ciment et les cystatines, sont produites dans les cellules sécrétoires des acini10,12 de type II et III. Les acini de type I n’affectent pas l’alimentation des tiques, ce qui indique que l’apport en farine de sang ne déclenche pas de changements morphologiques et physiologiques dans ces acini de type13,14. D’autre part, les Acini de type II et III sont activés pendant l’alimentation et présentent très peu d’activité avant l’attachement. Ainsi, l’alimentation est nécessaire pour déclencher l’élargissement des cellules sécrétoires au sein des acini de type II et la production de composés bioactifs. Les acini de type III sont réduits en taille pendant l’alimentation en raison de la sécrétion dans les granules sécrétoires12.
Les glandes salivaires sont également le site de l’infection pathogène dans la tique et la voie de transmission. Pendant l’alimentation, les tiques sécrètent plusieurs composés ayant des effets pharmaceutiques qui sont nécessaires pour réussir la farine de sang 10,15,16. Ces composés ont des propriétés anti-inflammatoires, immunosuppressives et vasodilatatrices 10,15,17. Des études récentes ont montré que les vésicules extracellulaires (VE) dérivées des glandes salivaires des tiques hébergent plusieurs de ces composés, induisant des effets anti-inflammatoires et immunomodulateurs 18,19,20. « Vésicules extracellulaires » est un terme générique utilisé pour décrire les vésicules classées comme exosomes et microvésicules en fonction de leur taille et de leur biogenèse. Dans l’ensemble, les VE sont des blebs lipidiques avec des membranes bicouches d’environ 40 nm-1 μm de taille21; en général, les exosomes sont décrits comme ayant une taille de 40 à 150 nm, tandis que les microvésicules mesurent entre 150 nm et 1 μm etune taille de 21,22,23. Cependant, la taille n’est pas indicative de la voie de biogenèse22 des VE.
La biogenèse des exosomes commence par l’invagination séquentielle de la membrane plasmique. Cette invagination conduit à la formation de corps multivésiculaires et aboutit finalement à la déformation de la membrane vésiculeuse par l’action de complexes ESCRT ou de sphingomyélinases (sMases)24,25. Les exosomes peuvent soit être lysés dans les lysosomes pour maintenir l’homéostasie cellulaire, soit sortir par fusion vésiculeuse vers la membrane plasmique pour délivrer des constituants cellulaires aux cellules réceptrices21,24. D’autre part, les microvésicules sont formées par l’action des flopasses et des tongasses, modifiant la conformation des lipides dans la membraneplasmique 26. Les VE sont essentiels pour la communication de cellule à cellule, servant de système de transport pour les cargaisons intracellulaires, telles que les lipides, les protéines, les acides nucléiques et les microARN (miARN)21,27,28. Une fois transportées, ces vésicules délivrent leur cargaison dans le cytoplasme des cellules réceptrices, générant des changements phénotypiques dans la cellule réceptrice22,29. En raison de l’importance des vésicules extracellulaires dans l’alimentation des tiques et de la manipulation des réponses immunitaires et de cicatrisation des plaiesde l’hôte 18,20, la cargaison dans les vésicules extracellulaires présente des cibles potentielles pour le développement de thérapies anti-tiques et un mécanisme unique pour perturber l’alimentation des tiques. Cela inclut les miARN dans les glandes salivaires des tiques et les vésicules extracellulaires dérivées des glandes salivaires.
Les miARN sont de courtes séquences non codantes, d’une longueur d’environ 18 à 22 nucléotides (nt), qui peuvent réguler, dégrader ou faire taire les séquences d’ARNm30,31 par post-transcription. Au cours de la transcription, les pri-miARN sont clivés par Dicer (ARN polymérase III) pour former une structure distinctive en forme d’épingle à cheveux, devenant un pré-miARN. Le pré-miARN est coupé une fois de plus par Drosha (ARN polymérase III) pour former un duplex miARN mature. La séquence mature s’intègre dans le complexe de silençage induit par l’ARN (RISC) complémentaire à la séquence d’ARNm, provoquant une répression de la traduction ou une dégradation de l’ARNm 28,30,32. Pendant l’alimentation de l’hôte, les miARN dans la salive de la tique peuvent moduler l’expression des gènes de l’hôte pour supprimer les réponses immunitaires et améliorer la transmission des agents pathogènes 33,34,35,36,37. Bien qu’il existe des études approfondies sur les ve et les miARN, leurs rôles lors de l’alimentation à l’interface tique-hôte sont encore mal compris. L’optimisation des protocoles qui peuvent facilement entraîner l’isolement et la purification de miARN de haute qualité est cruciale pour faire progresser nos connaissances sur ces sujets.
Plusieurs options peuvent être utilisées pour isoler les VE, telles que l’ultracentrifugation, la précipitation des exosomes, la précipitation des polymères, la chromatographie par immunoaffinité et les techniques d’exclusion basées sur la taille38. Cependant, ces techniques ne peuvent pas faire la distinction entre les exosomes ou les microvésicules. Ainsi, comme mentionné précédemment, EV est utilisé comme un terme générique lors de l’isolation des véhicules électriques de différents échantillons. Les vésicules isolées dans les expériences décrites ici représentent un mélange de vésicules dérivées de différentes voies de biogenèse. Une purification plus poussée d’une population spécifique de vésicules extracellulaires peut être obtenue par immunoprécipitation à l’aide de perles recouvertes d’anticorps contre les marqueurs (c.-à-d. marqueurs exosomaux, marqueurs tumoraux) uniques à la population de vésicules d’intérêt39,40. Les miARN peuvent également être extraits via différents kits d’isolement disponibles dans le commerce 7,41,42.
L’objectif de ce projet était de développer un protocole qui combine des méthodes couramment appliquées pour isoler les VE et extraire les miARN des VE et des glandes salivaires nourries. Étant donné que la sécrétion de composés bioactifs est activée en nourrissant12 personnes, les tiques devraient être autorisées à se nourrir pour identifier les miARN qui peuvent être importants pour manipuler les réponses immunitaires et de cicatrisation des plaies de l’hôte. Le protocole actuel exige un petit nombre de tiques (20 tiques) pour isoler les VE et leurs miARN respectifs, par rapport à d’autres études décrites précédemment qui nécessitaient 2000 tiques43. En outre, il évite la contamination des sécrétions salivaires par la pilocarpine44, ce qui pourrait influencer les expériences étudiant l’effet des VE et de leurs miARN sur les cellules hôtes.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m syringe filter</td>
			<td>GenClone</td>
			<td>25-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 &#181;m nylon syringe filter</td>
			<td>Tisch Scientific</td>
			<td>283129028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 inch black adhesive</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B00FQ937NM</td>
			<td>Capsule</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL needeless syringe</td>
			<td>Exelint</td>
			<td>26265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#39; and 5&#39; Adapters</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 mm vannas scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.1523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>337922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-003-CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beads</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5425</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Macron</td>
			<td>UN1888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyverse Discovery Enviornment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://cyverse.org/discovery-environment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sideded carpet tape</td>
			<td>amazon</td>
			<td>&#8206;286373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Tubes, 50 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>FBS-02-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fine forceps</td>
			<td>Excelta</td>
			<td>5-S-SE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foamies, 2 mm</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B004M5QGBQ</td>
			<td>Capsule</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Phoenix Pharmaceuticals manfactured</td>
			<td>193.33165.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ixodes scaplaris</td>
			<td>CDC, Oklahoma State University</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L15C300 medium</td>
			<td>In-lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lipoprotein-cholesterol concentrate</td>
			<td>MPI</td>
			<td>02191476-CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10118-596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRDeep2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/rajewsky-lab/mirdeep2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-MuLV Reverse Transcriptase</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>molecular grade ethanol</td>
			<td>Fischer Bioreagents</td>
			<td>UN1170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multi-well 24 well tissue culture treated plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanopaticle Tracking Analyzer machine</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosep with 300K Omega filter</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>OD3003C33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit v3</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq 500/550 High Output Kit (75 cycles)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XPN 90 Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>Thermofischer Scientific</td>
			<td>ICN19453780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pippettes</td>
			<td>Ependorff</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polycarbonate centrifuge bottle</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen miRNeasy kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAzol lysis reagent</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>Q32880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit kit</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>Q10212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbits</td>
			<td>Charles River</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Universal Primer</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhipicephalus microplus</td>
			<td>Cattle Fever Tick Research Labratoty</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Fischer Bioreagents</td>
			<td>215544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>833280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse free tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse inhibitor</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>11111729</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse/DNAse free water</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Minelute spin column</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217084</td>
			<td>Qiagen miRNeasy kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPE Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217084</td>
			<td>Qiagen miRNeasy kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT Buffer</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-seq kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT Forward Primer</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-seq kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTE Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217084</td>
			<td>Qiagen miRNeasy kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6014-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall ST16</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>75004380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized Gauze sponges</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>2187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized PBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>RNBK0694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>streptomycin</td>
			<td>thermofischer Scientific</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TapeStation</td>
			<td>Aligent</td>
			<td>G2991BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tear Mender Instant Fabric and Leather Adhesive</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>7.42836E+11</td>
			<td>Capsule</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Adhesive</td>
			<td>3M VetBond</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triple Antibiotics</td>
			<td>dechra</td>
			<td>17033-122-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptose phosphate broth</td>
			<td>BD</td>
			<td>BD 260300</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of micrornas from tick ex vivo salivary gland cultures and extracellular vesicles

Les tiques sont des ectoparasites importants qui peuvent vecteurs de multiples agents pathogènes. Les glandes salivaires des tiques sont essentielles à l’alimentation car leur salive contient de nombreux effecteurs aux propriétés pharmaceutiques qui peuvent diminuer les réponses immunitaires de l’hôte et améliorer la transmission des agents pathogènes. Un groupe de ces effecteurs sont les microARN (miARN). Les miARN sont de courtes séquences non codantes qui régulent l’expression des gènes hôtes à l’interface tique-hôte et dans les organes de la tique. Ces petits ARN sont transportés dans la salive des tiques via des vésicules extracellulaires (VE), qui servent à la communication intercellulaire et intracellulaire. Des vésicules contenant des miARN ont été identifiées dans la salive des tiques. Cependant, on sait peu de choses sur les rôles et les profils des miARN dans les vésicules et les glandes salivaires des tiques. De plus, l’étude des vésicules et des miARN dans la salive des tiques nécessite des procédures fastidieuses pour recueillir la salive des tiques. Ce protocole vise à développer et valider une méthode d’isolement des miARN à partir de vésicules extracellulaires purifiées produites par des cultures d’organes ex vivo . Les matériaux et la méthodologie nécessaires pour extraire les miARN des vésicules extracellulaires et des glandes salivaires des tiques sont décrits ici.

Le présent protocole fournit une méthodologie détaillée pour extraire les miARN des glandes salivaires et des VE. Selon les résultats, ce protocole est efficace pour isoler les miARN des adultes de deux espèces de tiques différentes, I. scapularis et R. microplus, et peut également être utilisé chez d’autres espèces de tiques. La concentration des VE (particules/mL) a été mesurée par NTA. Pour R. microplus, chaque sexe et chaque étape de la vie contenaient trois répli...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles at JoVE.com

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

Le présent protocole décrit l’isolement des microARN des glandes salivaires des tiques et des vésicules extracellulaires purifiées. Il s’agit d’une procédure universelle qui combine des réactifs et des fournitures couramment utilisés. La méthode permet également l’utilisation d’un petit nombre de tiques, ce qui donne des microARN de qualité qui peuvent être facilement séquencés.

Isolement de microARN à partir de cultures de glandes salivaires ex vivo et de vésicules extracellulaires

Ticks are important ectoparasites that can vector multiple pathogens. The salivary glands of ticks are essential for feeding as their saliva contains many ...

Ce protocole nous permet d’utiliser un nombre réduit de tiques, ce qui réduit le coût d’entretien des colonies et diminue le nombre de vertèbres nécessaires à l’alimentation des tiques. Ce protocole nécessite environ 20 tiques. Cependant, le principal avantage, outre l’utilisation d’un échantillon de petite taille, est que ce protocole peut être appliqué à plusieurs espèces de tiques et à différents stades de vie.Outre les dissections de tiques ou l’application aux interactions hôte-parasite, l’effet de l’infection pathogène sur la sécrétion de microARN et l’effet des changements physiologiques sur les microARN sécrétés par les tiques. Pour commencer, préparez un milieu sans vésicule en ajoutant du sérum bovin fœtal, du bouillon de phosphate de tryptose, du concentré de cholestérol à 10 % de lipoprotéines, du bicarbonate de sodium à 5 %, du HEPES et du milieu L15C300 dans un flacon centrifugeuse en polycarbonate de 26,3 millilitres et ajustez le volume au besoin. Maintenant, ultracentrifuger le milieu à 100 000 fois G à quatre degrés Celsius pendant 18 heures.Retirez délicatement le surnageant sans déranger la pastille et transférez le surnageant dans un tube à centrifuger frais. Ultracentrifugez le tube une fois de plus. Prenez le surnageant et passez-le à travers un filtre de 0,22 micromètre pour éliminer les contaminants.Introduire le surnageant dans un tube à centrifuger de 50 millilitres et le conserver à moins 20 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit nécessaire ou jusqu’à trois ans. Ajouter une quantité appropriée d’antibiotiques à 500 microlitres du milieu sans vésicule dans chaque puits d’une plaque de culture de 24 puits. Maintenant, ajoutez PBS avec de la rifampicine aux puits qui ne contiennent pas de milieu sans vésicules pour empêcher la croissance bactérienne.Placez les tiques sur une lame de verre avec du ruban adhésif double face sous un microscope à dissection. Avant la dissection, ajoutez du PBS contenant de la rifampicine à la tique et, à l’aide de ciseaux Vannas de quatre millimètres, faites une incision d’environ un millimètre sur le côté de chaque femelle. Maintenant, retirez la face dorsale et les glandes salivaires de la tique, puis mettez 20 à 40 glandes salivaires à tiques dans 500 microlitres de milieu sans vésicules ajoutés à un seul puits dans une plaque traitée par culture tissulaire de 24 puits.Incuber les échantillons de glandes salivaires à 32 degrés Celsius pendant 24 heures pour permettre la sécrétion des vésicules extracellulaires. À la fin de l’incubation, pipeter tout le milieu contenant les glandes salivaires dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre et centrifuger à 300 fois G à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Transférer le surnageant dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,5 millilitre.Remettez en suspension la pastille contenant les glandes salivaires dans l’ARN plus tard et stockez-la à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’elle soit utilisée ou indéfiniment. Maintenant, retirez les débris cellulaires en centrifugeant le surnageant à 2 000 fois G à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes et pipette le surnageant dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,5 millilitre. Ensuite, centrifugez à 10 000 fois G pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius pour éliminer les corps apoptotiques et les vésicules extracellulaires plus grandes et transférer le surnageant dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,5 millilitre.Ensuite, assemblez un filtre de seringue en nylon d’un micromètre sur une seringue de 10 millilitres et conservez-le sur un tube ultracentrifugeur. Ajoutez ensuite l’échantillon et remplissez la seringue avec 10 millilitres de PBS. Passez le surnageant à travers le filtre dans le tube.Après avoir filtré et équilibré les tubes, placez-les dans un rotor de 70 Ti et ultracentrifugez les tubes à 100 000 fois G pendant 18 heures à quatre degrés Celsius. Les vésicules extracellulaires concentrées forment une pastille après ultracentrifugation. Retirer le surnageant sans déranger le granulé et remettre le granulé en suspension dans du PBS.Pipeter 500 microlitres de la vésicule extracellulaire dans un filtre centrifuge de 300 K et centrifuger à 8 000 fois G pendant 10 minutes à température ambiante et répéter cette procédure jusqu’à ce que toutes les vésicules extracellulaires soient filtrées. Enfin, ajoutez 400 microlitres de PBS stérilisé à la colonne et mélangez soigneusement pour éliminer les vésicules extracellulaires attachées à la membrane. Ensuite, mettez l’échantillon dans un tube libre de 1,5 millilitre d’ADN RNAse.La concentration et la taille des vésicules extracellulaires variaient en fonction du sexe et du stade de vie des tiques entre les répliques biologiques pour les femelles, les mâles et les nymphes. Pour toutes les réplications biologiques combinées, des résultats similaires ont été observés. L’analyse de petits ARN isolés de la glande salivaire a montré des bandes correspondant à des ARN ribosomales et des microARN.Cependant, les ARN ribosomales étaient absents dans les vésicules isolées des glandes salivaires, et les échantillons de microARN purifiés à partir de vésicules extracellulaires ont montré plus de dégradation. Après enrichissement, les échantillons de microARN purifiés à partir de VE ont montré une dégradation minimale et une concentration suffisante de microARN pour la synthèse de la banque d’ADNc. La taille de bande attendue d’environ 150 paires de bases après l’obtention de la préparation de la banque d’ADNc signifie de petites bibliothèques d’ADNc d’ARN.Pendant la préparation sans vésicule, assurez-vous de suivre les étapes pour éviter la contamination externe des vésicules. Pendant la préparation de la plaque de puits, assurez-vous d’ajouter des antibiotiques pour prévenir la contamination bactérienne par le microbiome de la tique. Les microARN extraits à l’aide de ce protocole peuvent être utilisés pour des expériences de profilage et fonctionnelles afin de valider les rôles des microARN tels que la prédiction des cibles de la voie des microARN, l’inhibition et les expériences de mimétisme.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells

L&#39;isolement des cellules souches de la souris salivaires Gland

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of ...

Recherche

Biologie

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

Isolation vampirique de fluide extracellulaire d&#39;<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The genetically tractable model organism C. elegans has provided insights into a myriad of biological questions, enabled by its short generation time, ...

Isolation of Basal Cells and Submucosal Gland Duct Cells from Mouse Trachea

Isolement de cellules basales et les cellules sous-muqueux du canal de la glande de la souris Trachée

The large airways are directly in contact with the environment and therefore susceptible to injury from toxins and infectious agents that we breath in 1. ...

Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures

Modification génétique et la recombinaison des cultures d&#39;organes salivaires Gland

Branching  morphogenesis occurs during the development of many organs, and the embryonic  mouse submandibular gland (SMG) is a classical model for the ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

Naïve cellules souches adultes Isolation de cultures de fibroblastes humains primaires

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Isolation of Intact, Whole Mouse Mammary Glands for Analysis of Extracellular Matrix Expression and Gland Morphology

Isolement des glandes mammaires de souris intacte, toute analyse d’Expression de la matrice extracellulaire et la morphologie de la glande

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal ...

Isolation of Retinal Arterioles for Ex Vivo Cell Physiology Studies

Isolation of Retinal Arterioles for Ex Vivo Cell Physiology Studies

Isolement des artérioles rétiniennes Ex Vivo études de physiologie cellulaire

The retina is a highly metabolically active tissue that requires a substantial blood supply. The retinal circulation supports the inner retina, while the ...

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

Analyse par cytométrie en flux de vésicules extracellulaires de médias conditionné par cellule d’écoulement

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purification et analyse de Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Isolement et purification évolutifs de vésicules extracellulaires à partir d’Escherichia coli et d’autres bactéries

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...