Name: isolation of micrornas from tick ex vivo salivary gland cultures and extracellular vesicles
Uploaded: 2022-04-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles at JoVE.com

Wir sind sehr dankbar für die Unterstützung durch das Cattle Fever Tick Laboratory in Edinburg, Texas. Wir danken Michael Moses, Jason Tidwell, James Hellums, Cesario Agado und Homer Vasquez. Wir möchten auch die Unterstützung von Sarah Sharpton, Elizabeth Lohstroh, Amy Filip, Kelsey Johnson, Kelli Kochcan, Andrew Hillhouse, Charluz Arocho Rosario und Stephanie Guzman Valencia während des gesamten Projekts danken. Wir möchten der Texas A&M Aggie Women in Entomology (AWE) Writing Group für ihre Hilfe und ihren Rat während des Schreibens dieses Manuskripts danken. Die folgenden Reagenzien wurden von den Centers for Disease Control and Prevention zur Verteilung durch BEI Resources, NIAID, NIH, zur Verfügung gestellt: Ixodes scapularis Adult (Live), NR-42510. Weibliche I. scapularis-Zecken wurden auch von der Tick Rearing Facility an der Oklahoma State University erhalten. Dieses Projekt wurde von der Texas A&M University T3: triads for transformation grant und der Kooperationsvereinbarung #58-3094-1-003 des USDA-ARS an AOC finanziert.

Alle Tierversuche wurden nach dem Tiernutzungsprotokoll (AUP # 2020-0026) durchgeführt, das vom Institutional Animal Care and Use Committee (AICUC) der Texas A & M University genehmigt wurde. Die Zeckenarten, Ixodes scapularis und Rhipicephalus (Boophilus) microplus, sowie neuseeländische männliche weiße Kaninchen, 42-72 Tage alt, wurden für die vorliegende Studie verwendet. I. scapularis wurde vom Center for Disease Control (CDC) und der Oklahoma State University als pathogenfrei zertifiz...

Das aktuelle Protokoll bietet eine detaillierte Methodik zur Extraktion von miRNA aus Speicheldrüsen und EVs. Es gibt jedoch wichtige Überlegungen, die alle in den Anmerkungen zu jedem Abschnitt dieses Protokolls ausführlich beschrieben werden. Die Kapsel und das Netz müssen während der Zeckenfütterung gesichert werden, um zu verhindern, dass Zecken entweichen. Die Kapselvorbereitung und -platzierung sind in Koga et al.40 beschrieben. Mehrere Wiederholungen der Zeckendissektionen müssen dur...

Zecken sind Ektoparasiten, die viele Krankheitserreger auf Wildtiere, Nutztiere, Menschen und ihre Haustiere übertragen 1,2. Die Fütterung von Zecken führt zu erheblichen wirtschaftlichen Verlusten, indem sie die Haut schädigt, das Gewicht und die Milchproduktion aufgrund schwerer Anämie reduziert und potenziell tödliche krankheitserregende Krankheitserregerüberträgt 1,3,4,5. Die derzeitigen Kontrollpraktiken für das Management von Zeckenpopulationen konzentrieren sich auf den Einsatz von Akariziden. Dennoch haben das kontinuierliche Auftreten von Akarizidresistenzen bei Zecken, die Nutztiereparasitieren 5,6, die erhöhte Inzidenz von Zeckenstichen7 und die Übertragung von Krankheitserregern in Wohngebieten 8,9 zu einem Bedarf an einzigartigen Zeckenbekämpfungsalternativen geführt.
Die Zeckenspeicheldrüsen sind essentielle Organe, die den biologischen Erfolg einer Zecke sicherstellen. Sie werden von verschiedenen Acinus-Typen (I, II, III und IV) mit verschiedenen physiologischen Funktionen gebildet. Die Speicheldrüsen sind für die Osmoregulation, sowohl außerhalb als auch auf dem Wirt, verantwortlich, indem sie dem Wirt über Speichelfluss Wasserüberschuss und Eisengehalt zurückgeben 2,10. Typ-I-Acini sind auch an der Aufnahme von Wasser aus der Atmosphäre durch die Sekretion von hygroskopischem Speichelbeteiligt 10,11. Speicheleffektorproteine wie Zement und Cystatine werden in sekretorischen Zellen in Typ-II- und III-Acini10,12 produziert. Typ-I-Acini haben keinen Einfluss auf die Zeckenfütterung, was darauf hindeutet, dass die Blutmahlzeitenaufnahme keine morphologischen und physiologischen Veränderungen bei diesen Acini Typ13,14 auslöst. Auf der anderen Seite werden Acini Typ II und III während der Fütterung aktiviert und zeigen sehr wenig Aktivität vor der Befestigung. Daher ist die Fütterung notwendig, um die Vergrößerung der sekretorischen Zellen innerhalb von Typ-II-Acini und die Produktion bioaktiver Verbindungen auszulösen. Typ-III-Acini werden während der Fütterung aufgrund der Sekretion im sekretorischen Granulat12 verkleinert.
Die Speicheldrüsen sind auch der Ort der Erregerinfektion in der Zecke und im Übertragungsweg. Während der Fütterung sezernieren Zecken mehrere Verbindungen mit pharmazeutischer Wirkung, die für einen erfolgreichen Abschluss der Blutmahlzeitbenötigt werden 10,15,16. Diese Verbindungen haben entzündungshemmende, immunsuppressive und vasodilatatorische Eigenschaften10,15,17. Neuere Studien haben gezeigt, dass extrazelluläre Vesikel (EVs), die aus Zeckenspeicheldrüsen gewonnen werden, mehrere dieser Verbindungen beherbergen und entzündungshemmende und immunmodulatorische Wirkungen induzieren18,19,20. "Extrazelluläre Vesikel" ist ein Überbegriff, der verwendet wird, um Vesikel zu beschreiben, die aufgrund ihrer Größe und Biogenese als Exosomen und Mikrovesikel klassifiziert werden. Insgesamt sind EVs Lipidblebs mit zweischichtigen Membranen, die ~ 40 nm-1 μm in Größe21 sind; Im Allgemeinen werden Exosomen als 40-150 nm groß beschrieben, während Mikrovesikel zwischen 150 nm-1 μm in der Größe21,22,23 liegen. Die Größe ist jedoch kein Hinweis auf den Biogeneseweg der EVs22.
Die Biogenese von Exosomen beginnt mit der sequentiellen Invagination der Plasmamembran. Diese Invagination führt zur Bildung von multivesikulären Körpern und führt schließlich zur Verformung der vesikulären Membran durch die Wirkung von ESCRT-Komplexen oder Sphingomyelinasen (sMases)24,25. Die Exosomen können entweder innerhalb der Lysosomen lysiert werden, um die zelluläre Homöostase aufrechtzuerhalten, oder durch vesikuläre Fusion in die Plasmamembran austreten, um zelluläre Bestandteile an die Empfängerzellen zu liefern21,24. Auf der anderen Seite werden Mikrovesikel durch die Wirkung von Flopassen und Flipassen gebildet, wodurch die Konformation von Lipiden in der Plasmamembran26 verändert wird. EVs sind essentiell für die Zell-zu-Zell-Kommunikation und dienen als Transportsystem für intrazelluläre Fracht wie Lipide, Proteine, Nukleinsäuren und microRNAs (miRNAs)21,27,28. Nach dem Transport geben diese Vesikel ihre Fracht in das Zytoplasma der Empfängerzellen ab und erzeugen phänotypische Veränderungen in der aufnehmenden Zelle22,29. Aufgrund der Bedeutung extrazellulärer Vesikel bei der Zeckenfütterung und der Manipulation der Immun- und Wundheilungsreaktionen des Wirts18,20 bietet die Ladung in extrazellulären Vesikeln potenzielle Ziele für die Entwicklung von Anti-Zecken-Therapeutika und einen einzigartigen Mechanismus zur Störung der Zeckenfütterung. Dazu gehören miRNAs in Zeckenspeicheldrüsen und aus Speicheldrüsen gewonnene extrazelluläre Vesikel.
miRNAs sind kurze, nicht-kodierende Sequenzen, ~ 18-22 Nukleotid (nt) lang, die mRNA-Sequenzen30,31 posttranskriptionell regulieren, abbauen oder zum Schweigen bringen können. Während der Transkription werden die pri-miRNAs von Dicer (RNA-Polymerase III) gespalten, um eine unverwechselbare Haarnadel-ähnliche Struktur zu bilden, die zu einer Pre-miRNA wird. Die Pre-miRNA wird erneut durch Drosha (RNA-Polymerase III) geschnitten, um einen reifen miRNA-Duplex zu bilden. Die ausgereifte Sequenz wird komplementär zur mRNA-Sequenz in den RNA-induzierten Silencing-Komplex (RISC) integriert, was zu einer Translationsrepression oder einem mRNA-Abbauführt 28,30,32. Während der Wirtsfütterung können miRNAs im Zeckenspeichel die Expression des Wirtsgens modulieren, um Immunantworten zu unterdrücken und die Erregerübertragungzu verbessern 33,34,35,36,37. Obwohl umfangreiche Studien zu EVs und miRNAs existieren, sind ihre Rollen während der Fütterung an der Zecken-Wirt-Schnittstelle noch wenig verstanden. Die Optimierung von Protokollen, die leicht zur Isolierung und Aufreinigung hochwertiger miRNAs führen können, ist entscheidend für die Weiterentwicklung unseres Wissens zu diesen Themen.
Zur Isolierung von Elektrofahrzeugen können mehrere Optionen verwendet werden, z. B. Ultrazentrifugation, Exosomenfällung, Polymerausfällung, Immunaffinitätschromatographie und größenbasierte Ausschlusstechniken38. Diese Techniken können jedoch nicht zwischen Exosomen oder Mikrovesikeln unterscheiden. Wie bereits erwähnt, wird EV als Oberbegriff verwendet, wenn Elektrofahrzeuge von verschiedenen Proben isoliert werden. Die in den hierin beschriebenen Experimenten isolierten Vesikel stellen eine Mischung von Vesikeln dar, die aus verschiedenen Biogenesewegen stammen. Eine weitere Aufreinigung einer spezifischen Population extrazellulärer Vesikel kann durch Immunpräzipitation unter Verwendung von Kügelchen erreicht werden, die mit Antikörpern gegen Marker (d.h. exosomale Marker, Tumormarker) beschichtet sind, die für die für die interessierende Vesikelpopulationeinzigartig sind 39,40. miRNAs können auch über verschiedene kommerziell erhältliche Isolationskits 7,41,42 extrahiert werden.
Ziel dieses Projekts war es, ein Protokoll zu entwickeln, das häufig angewandte Methoden zur Isolierung von EVs und zur Extraktion von miRNA sowohl aus EVs als auch aus Speicheldrüsen kombiniert. Da die Sekretion bioaktiver Verbindungen durch Fütterungvon 12 aktiviert wird, sollten Zecken gefüttert werden dürfen, um miRNAs zu identifizieren, die für die Manipulation der Immun- und Wundheilungsreaktionen des Wirts wichtig sein können. Das vorliegende Protokoll erfordert eine kleine Anzahl von Zecken (20 Zecken), um EVs und ihre jeweiligen miRNAs zu isolieren, verglichen mit anderen zuvor beschriebenen Studien, die 2000 Zecken43 erforderten. Darüber hinaus vermeidet es die Kontamination von Speichelsekreten mit Pilocarpin44, was Experimente beeinflussen könnte, die die Wirkung von EVs und ihren miRNAs auf Wirtszellen untersuchen.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m syringe filter</td>
			<td>GenClone</td>
			<td>25-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 &#181;m nylon syringe filter</td>
			<td>Tisch Scientific</td>
			<td>283129028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 inch black adhesive</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B00FQ937NM</td>
			<td>Capsule</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL needeless syringe</td>
			<td>Exelint</td>
			<td>26265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#39; and 5&#39; Adapters</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 mm vannas scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.1523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>337922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-003-CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beads</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5425</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Macron</td>
			<td>UN1888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyverse Discovery Enviornment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://cyverse.org/discovery-environment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sideded carpet tape</td>
			<td>amazon</td>
			<td>&#8206;286373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Tubes, 50 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>FBS-02-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fine forceps</td>
			<td>Excelta</td>
			<td>5-S-SE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foamies, 2 mm</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B004M5QGBQ</td>
			<td>Capsule</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Phoenix Pharmaceuticals manfactured</td>
			<td>193.33165.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ixodes scaplaris</td>
			<td>CDC, Oklahoma State University</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L15C300 medium</td>
			<td>In-lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lipoprotein-cholesterol concentrate</td>
			<td>MPI</td>
			<td>02191476-CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10118-596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRDeep2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/rajewsky-lab/mirdeep2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-MuLV Reverse Transcriptase</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>molecular grade ethanol</td>
			<td>Fischer Bioreagents</td>
			<td>UN1170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multi-well 24 well tissue culture treated plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanopaticle Tracking Analyzer machine</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosep with 300K Omega filter</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>OD3003C33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit v3</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq 500/550 High Output Kit (75 cycles)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XPN 90 Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>Thermofischer Scientific</td>
			<td>ICN19453780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pippettes</td>
			<td>Ependorff</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polycarbonate centrifuge bottle</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen miRNeasy kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAzol lysis reagent</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>Q32880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit kit</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>Q10212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbits</td>
			<td>Charles River</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Universal Primer</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhipicephalus microplus</td>
			<td>Cattle Fever Tick Research Labratoty</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Fischer Bioreagents</td>
			<td>215544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>833280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse free tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse inhibitor</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>11111729</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse/DNAse free water</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Minelute spin column</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217084</td>
			<td>Qiagen miRNeasy kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPE Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217084</td>
			<td>Qiagen miRNeasy kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT Buffer</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-seq kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT Forward Primer</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-seq kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTE Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217084</td>
			<td>Qiagen miRNeasy kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6014-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall ST16</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>75004380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized Gauze sponges</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>2187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized PBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>RNBK0694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>streptomycin</td>
			<td>thermofischer Scientific</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TapeStation</td>
			<td>Aligent</td>
			<td>G2991BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tear Mender Instant Fabric and Leather Adhesive</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>7.42836E+11</td>
			<td>Capsule</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Adhesive</td>
			<td>3M VetBond</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triple Antibiotics</td>
			<td>dechra</td>
			<td>17033-122-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptose phosphate broth</td>
			<td>BD</td>
			<td>BD 260300</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of micrornas from tick ex vivo salivary gland cultures and extracellular vesicles

Zecken sind wichtige Ektoparasiten, die mehrere Krankheitserreger übertragen können. Die Speicheldrüsen von Zecken sind für die Fütterung unerlässlich, da ihr Speichel viele Effektoren mit pharmazeutischen Eigenschaften enthält, die die Immunantwort des Wirts verringern und die Übertragung von Krankheitserregern verbessern können. Eine Gruppe solcher Effektoren sind microRNAs (miRNAs). miRNAs sind kurze nicht-kodierende Sequenzen, die die Expression von Wirtsgenen an der Zecken-Wirt-Grenzfläche und in den Organen der Zecke regulieren. Diese kleinen RNAs werden im Zeckenspeichel über extrazelluläre Vesikel (EVs) transportiert, die der inter- und intrazellulären Kommunikation dienen. Vesikel, die miRNAs enthalten, wurden im Speichel von Zecken identifiziert. Über die Rollen und Profile der miRNAs in Zeckenspeichelbläschen und -drüsen ist jedoch wenig bekannt. Darüber hinaus erfordert die Untersuchung von Vesikeln und miRNAs im Zeckenspeichel langwierige Verfahren, um Zeckenspeichel zu sammeln. Dieses Protokoll zielt darauf ab, eine Methode zur Isolierung von miRNAs aus gereinigten extrazellulären Vesikeln zu entwickeln und zu validieren, die von Ex-vivo-Organkulturen produziert werden. Die Materialien und die Methodik, die benötigt werden, um miRNAs aus extrazellulären Vesikeln und Zeckenspeicheldrüsen zu extrahieren, werden hierin beschrieben.

Das vorliegende Protokoll bietet eine detaillierte Methodik zur Extraktion von miRNAs aus Speicheldrüsen und EVs. Den Ergebnissen zufolge ist dieses Protokoll für die Isolierung von miRNA aus Erwachsenen zweier verschiedener Zeckenarten, I. scapularis und R. microplus, wirksam und kann möglicherweise auch bei anderen Zeckenarten verwendet werden. Die EV-Konzentration (Partikel/ml) wurde mittels NTA gemessen. Für R. microplus enthielt jedes Geschlecht und jede Lebensphase drei biolo...

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Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Isolierung von microRNAs aus Zeckenspeicheldrüsen und gereinigten extrazellulären Vesikeln. Dies ist ein universelles Verfahren, das häufig verwendete Reagenzien und Verbrauchsmaterialien kombiniert. Die Methode ermöglicht auch die Verwendung einer kleinen Anzahl von Zecken, was zu hochwertigen microRNAs führt, die leicht sequenziert werden können.

Isolierung von microRNAs aus Zecken-Ex-vivo-Speicheldrüsenkulturen und extrazellulären Vesikeln

Ticks are important ectoparasites that can vector multiple pathogens. The salivary glands of ticks are essential for feeding as their saliva contains many ...

Dieses Protokoll ermöglicht es uns, eine reduzierte Anzahl von Zecken zu verwenden, was die Kosten für die Erhaltung der Kolonie reduziert und die Anzahl der für die Zeckenfütterung benötigten Wirbeltiere verringert. Dieses Protokoll erfordert ungefähr 20 Zecken. Der Hauptvorteil neben der Verwendung einer kleinen Stichprobengröße besteht jedoch darin, dass dieses Protokoll auf mehrere Zeckenarten und verschiedene Lebensstadien angewendet werden kann.Abgesehen von Zeckendissektionen oder der Anwendung auf Wirt-Parasit-Interaktionen ist die Wirkung einer Erregerinfektion auf die microRNA-Sekretion und die Wirkung physiologischer Veränderungen auf die von Zecken sezernierte microRNA die Sekretion. Bereiten Sie zunächst vesikelfreie Medien vor, indem Sie fötales Rinderserum, Tryptosephosphatbrühe, 10% Lipoproteincholesterinkonzentrat, 5% Natriumbicarbonat, HEPES und L15C300-Medium in eine 26,3-Milliliter-Polycarbonat-Zentrifugenflasche geben und das Volumen nach Bedarf anpassen. Nun ultrazentrifugieren Sie das Medium bei 100.000 mal G bei vier Grad Celsius für 18 Stunden.Entfernen Sie den Überstand vorsichtig, ohne das Pellet zu stören, und geben Sie den Überstand in ein frisches Zentrifugenröhrchen. Ultrazentrifugieren Sie das Röhrchen erneut. Nehmen Sie den Überstand und leiten Sie ihn durch einen 0,22-Mikrometer-Filter, um Verunreinigungen zu entfernen.Pipetten Sie den Überstand in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und lagern Sie ihn bei minus 20 Grad Celsius bis zu Bedarf oder bis zu drei Jahre. Fügen Sie eine angemessene Menge Antibiotika zu 500 Mikrolitern des vesikelfreien Mediums in jeder Vertiefung einer 24-Well-Kulturplatte hinzu. Fügen Sie nun PBS mit Rifampicin zu den Vertiefungen hinzu, die kein vesikelfreies Medium enthalten, um Bakterienwachstum zu verhindern.Legen Sie die Zecken auf einen Glasobjektträger mit doppelseitigem Teppichband unter einem Seziermikroskop. Vor der Dissektion PBS, das Rifampicin enthält, zur Zecke hinzufügen und mit einer Vier-Millimeter-Vannas-Schere einen Schnitt von etwa einem Millimeter an der Seite jedes Weibchens machen. Entfernen Sie nun die Rückenseite und die Speicheldrüsen der Zecke und legen Sie dann 20 bis 40 Zeckenspeicheldrüsen in 500 Mikroliter vesikelfreies Medium, das zu einer einzigen Vertiefung in eine mit 24-Well-Gewebekultur behandelte Platte gegeben wird.Inkubieren Sie die Speicheldrüsenproben bei 32 Grad Celsius für 24 Stunden, um die Sekretion der extrazellulären Vesikel zu ermöglichen. Am Ende der Inkubation das gesamte Medium, das die Speicheldrüsen enthält, in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen pipettieren und 10 Minuten lang bei 300 mal G bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Den Überstand in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführen.Resuspendieren Sie das Pellet mit den Speicheldrüsen später in RNA und lagern Sie es bei minus 80 Grad Celsius, bis es verwendet wird oder auf unbestimmte Zeit. Entfernen Sie nun die Zelltrümmer, indem Sie den Überstand bei 2.000 mal G bei vier Grad Celsius für 10 Minuten zentrifugieren und den Überstand in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen pipettieren. Als nächstes zentrifugieren Sie bei 10.000 mal G für 30 Minuten bei vier Grad Celsius, um apoptotische Körper und größere extrazelluläre Vesikel zu entfernen und den Überstand in ein frisches 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen zu übertragen.Montieren Sie dann einen Ein-Mikrometer-Nylon-Spritzenfilter auf einer 10-Milliliter-Spritze und halten Sie ihn auf einem Ultrazentrifugenröhrchen. Dann fügen Sie die Probe hinzu und füllen Sie die Spritze mit 10 Milliliter PBS. Führen Sie den Überstand durch den Filter in das Rohr.Nachdem Sie die Röhrchen gefiltert und ausgewuchtet haben, legen Sie sie in einen 70 Ti-Rotor und ultrazentrifugieren Sie die Röhrchen bei 100.000 Mal G für 18 Stunden bei vier Grad Celsius. Die konzentrierten extrazellulären Vesikel bilden nach der Ultrazentrifugation ein Pellet. Entfernen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören, und resuspendieren Sie das Pellet in PBS.Pipettieren Sie 500 Mikroliter des extrazellulären Vesikels in einen 300 K Zentrifugalfilter und zentrifugieren Sie bei 8.000 mal G für 10 Minuten bei Umgebungstemperatur und wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle extrazellulären Vesikel gefiltert sind. Schließlich fügen Sie 400 Mikroliter sterilisiertes PBS zur Säule hinzu und mischen Sie gründlich, um extrazelluläre Vesikel zu entfernen, die an der Membran befestigt sind. Dann geben Sie die Probe in ein 1,5 Milliliter DNAase RNAse freies Röhrchen.Die Konzentration und Größe der extrazellulären Vesikel variierte je nach Geschlecht und Lebensstadium der Zecken zwischen den biologischen Replikaten für Weibchen, Männchen und Nymphen. Für alle kombinierten biologischen Replikate wurden ähnliche Ergebnisse beobachtet. Die Analyse kleiner RNAs, die aus der Speicheldrüse isoliert wurden, zeigte Banden, die ribosomalen RNAs und microRNAs entsprechen.Die ribosomalen RNAs fehlten jedoch in den aus den Speicheldrüsen isolierten Vesikel, und microRNA-Proben, die aus extrazellulären Vesikeln gereinigt wurden, zeigten mehr Abbau. Nach der Anreicherung zeigten die aus EVs gereinigten microRNA-Proben einen minimalen Abbau und eine ausreichende microRNA-Konzentration für die cDNA-Bibliothekssynthese. Die erwartete Bandengröße von etwa 150 Basenpaaren nach Erhalt der cDNA-Bibliotheksvorbereitung bedeutet kleine RNA-cDNA-Bibliotheken.Stellen Sie während der vesikelfreien Zubereitung sicher, dass Sie die Schritte befolgen, um eine Kontamination mit externen Vesikeln zu verhindern. Achten Sie während der Brunnenplattenvorbereitung darauf, Antibiotika hinzuzufügen, um eine bakterielle Kontamination durch das Zeckenmikrobiom zu verhindern. Die mit diesem Protokoll extrahierten microRNAs können für Profiling- und Funktionsexperimente verwendet werden, um microRNA-Rollen zu validieren, z. B. die Vorhersage von microRNA-Signalwegzielen, Hemmungs- und Mimikry-Experimenten.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells

Isolierung von Maus Speicheldrüsen Stem Cells

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of ...

Forschung

Biologie

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

Vampiric Isolation der extrazellulären Flüssigkeit aus<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The genetically tractable model organism C. elegans has provided insights into a myriad of biological questions, enabled by its short generation time, ...

Isolation of Basal Cells and Submucosal Gland Duct Cells from Mouse Trachea

Isolierung von Basalzellen und Submuköse Gland Duct Zellen aus Maus Trachea

The large airways are directly in contact with the environment and therefore susceptible to injury from toxins and infectious agents that we breath in 1. ...

Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures

Genetic Modification und Rekombination von Speicheldrüsen Organkulturen

Branching  morphogenesis occurs during the development of many organs, and the embryonic  mouse submandibular gland (SMG) is a classical model for the ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

Naive Adult Stem Cells Isolation von primären humanen Fibroblasten Kulturen

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Isolation of Intact, Whole Mouse Mammary Glands for Analysis of Extracellular Matrix Expression and Gland Morphology

Isolierung von intakt, ganze Maus Milchdrüsen zur Analyse der extrazellulären Matrix Ausdruck und Drüse Morphologie

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal ...

Isolation of Retinal Arterioles for Ex Vivo Cell Physiology Studies

Isolation of Retinal Arterioles for Ex Vivo Cell Physiology Studies

Isolierung der retinalen Arteriolen für Ex Vivo Zelle Physiologie Studien

The retina is a highly metabolically active tissue that requires a substantial blood supply. The retinal circulation supports the inner retina, while the ...

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

Fließen Sie durchflusszytometrischen Analyse der extrazellulären Vesikel aus Zelle konditioniertes Medien

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Reinigung und Analyse von Caenorhabditis elegans Extrazelluläre Vesikel

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Skalierbare Isolierung und Reinigung extrazellulärer Vesikel aus Escherichia coli und anderen Bakterien

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...