Name: isolation of micrornas from tick ex vivo salivary gland cultures and extracellular vesicles
Uploaded: 2022-04-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles at JoVE.com

אנו מעריכים מאוד את הסיוע ממעבדת קרציות קדחת הבקר באדינבורו, טקסס. ברצוננו להודות למייקל מוזס, ג'ייסון טידוול, ג'יימס הלומס, סזאריו אגאדו והומר ואסקז. ברצוננו גם להודות על עזרתן של שרה שרפטון, אליזבת לוהסטרו, איימי פיליפ, קלסי ג'ונסון, קלי קוצ'קאן, אנדרו הילאוס, צ'רלוז ארוצ'ו רוסאריו וסטפני גוזמן ולנסיה לאורך כל הפרויקט. ברצוננו להודות לקבוצת הכתיבה של טקסס A&M Aggie Women in Entomology (AWE) על עזרתן ועצותיהן במהלך כתיבת כתב יד זה. הריאגנטים הבאים סופקו על ידי המרכזים לבקרת מחלות ומניעתן להפצה על ידי משאבי BEI, NIAID, NIH: Ixodes scapularis Adult (חי), NR-42510. נקבות קרציות I. scapularis התקבלו גם הן ממתקן גידול הקרציות באוניברסיטת אוקלהומה סטייט. פרויקט זה מומן על ידי אוניברסיטת טקסס A&M T3: שלישיות למענק טרנספורמציה והסכם שיתוף הפעולה #58-3094-1-003 על ידי USDA-ARS ל- AOC.

כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בעקבות פרוטוקול שימוש בבעלי חיים (AUP#2020-0026) שאושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (AICUC) באוניברסיטת טקסס A&M. מיני הקרציות, Ixodes scapularis ו-Rhipicephalus (Boophilus) microplus, וארנבים לבנים זכרים מניו זילנד, בני 42-72 ימים, שימשו למחקר הנוכחי. I. scapularis התקבל מ...

הפרוטוקול הנוכחי מספק מתודולוגיה מפורטת לחילוץ miRNA מבלוטות הרוק ומרכבים חשמליים. עם זאת, ישנם שיקולים חשובים, שכולם מפורטים בהערות עבור כל סעיף בפרוטוקול זה. יש לאבטח את הקפסולה ואת רשת הרשת במהלך האכלת הקרציות כדי למנוע מהקרציות לברוח. ההכנה והמיקום של הקפסולה מתוארים ב- Koga et al.40...

קרציות הן ectoparasitesites אשר וקטור פתוגנים רבים לחיות בר, בעלי חיים, בני אדם, וחיות המחמד שלהם 1,2. האכלת קרציות גורמת לאובדן כלכלי משמעותי על ידי גרימת נזק להסתרה, הפחתת המשקל וייצור החלב עקב אנמיה קשה, והעברת פתוגנים שעלולים לגרום למחלות קטלניות 1,3,4,5. נוהלי הבקרה הנוכחיים לניהול אוכלוסיות קרציות מתמקדים בשימוש בקוטלי אקריות. אף על פי כן, הופעתה המתמשכת של עמידות בפני קוטלים בקרציות הטפילות בעלי חיים 5,6, השכיחות המוגברת של עקיצות קרציות7 והעברת פתוגנים באזורי מגורים 8,9, הובילו לצורך בחלופות ייחודיות לבקרת קרציות.
בלוטות הרוק של הקרצייה הן איברים חיוניים המבטיחים את הצלחתה הביולוגית של הקרצייה. הם נוצרים על ידי סוגים שונים של צינוס (I, II, III ו- IV) עם פונקציות פיזיולוגיות שונות. בלוטות הרוק אחראיות לאוסמורגולציה, הן מחוץ לפונדקאי והן על הפונדקאי, על ידי החזרת עודף מים ותכולת ברזל לפונדקאי באמצעות ריר 2,10. אצ'יני מסוג I מעורבים גם בקליטת מים מהאטמוספרה על ידי הפרשת הרוק ההיגרוסקופי10,11. חלבונים משפיעי רוק, כגון מלט וציסטאטינים, מיוצרים בתוך תאים מפרישים בסוג II ו-IIIacini 10,12. אצ'יני מסוג I אינו משפיע על האכלת קרציות, מה שמצביע על כך שצריכת קמח הדם אינה מעוררת שינויים מורפולוגיים ופיזיולוגיים באצ'יני מסוג13,14 אלה. מצד שני, אצ'יני מסוג II ו- III מופעלים במהלך ההאכלה ומציגים מעט מאוד פעילות לפני ההתקשרות. לפיכך, האכלה נחוצה כדי להפעיל את הגדלת התאים המפרישים בתוך סוג II acini ואת הייצור של תרכובות ביואקטיביות. אצ'יני מסוג III מצטמצמים בגודלם במהלך ההאכלה עקב הפרשה בתוך גרגירי הפרשה12.
בלוטות הרוק הן גם האתר של זיהום פתוגן בקרצייה ובנתיב ההעברה. במהלך ההאכלה, הקרציות מפרישות מספר תרכובות עם השפעות תרופתיות הדרושות לסיום מוצלח של קמח הדם 10,15,16. לתרכובות אלה יש תכונות אנטי דלקתיות, מדכאות חיסון ואסודילטוריות 10,15,17. מחקרים אחרונים הראו כי שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) המופקות מבלוטות הרוק של הקרציות מכילות כמה מהתרכובות הללו, מה שגורם להשפעות אנטי-דלקתיות ואימונו-אפנון 18,19,20. "שלפוחיות חוץ-תאיות" הוא מונח-על המשמש לתיאור בועיות המסווגות כאקסוזומים ומיקרו-ווסיקלים בהתבסס על גודלן ועל פי הביוגנזה שלהן. בסך הכל, כלי רכב חשמליים הם גושים שומניים עם ממברנות דו-שכבתיות שגודלן כ-40 ננומטר-1 מיקרומטר בגודל21; באופן כללי, אקסוזומים מתוארים כגודלם 40-150 ננומטר, בעוד שגודלם בין 150 ננומטר ל-1 מיקרומטר הוא 21,22,23. עם זאת, הגודל אינו מעיד על מסלול הביוגנזה של כלי הרכב החשמליים22.
הביוגנזה של האקסוזומים מתחילה באינווגינציה רציפה של קרום הפלזמה. אינווגינציה זו מובילה להיווצרותם של גופים רב-ווסקולריים ולבסוף גורמת לעיוות של קרום השלפוחית על ידי פעולה של קומפלקסים ESCRT או sphingomyelinases (sMases)24,25. ניתן לשכב את האקסוזומים בתוך הליזוזומים כדי לשמור על הומאוסטזיס תאי או לצאת באמצעות היתוך שלפוחיתי לקרום הפלזמה כדי להעביר מרכיבים תאיים לתאים המקבלים21,24. מצד שני, microvesicles נוצרים על ידי פעולה של flopasses ו flipasses, שינוי הקונפורמציה של שומנים בקרום פלזמה26. כלי רכב חשמליים חיוניים לתקשורת בין תאים, ומשמשים כמערכת הובלה למטענים תוך-תאיים, כגון שומנים, חלבונים, חומצות גרעין ומיקרו-רנ"א (miRNA)21,27,28. לאחר ההובלה, בועיות אלה מעבירות את המטען שלהן לתוך הציטופלסמה של התאים המקבלים, ויוצרות שינויים פנוטיפיים בתא המקבל22,29. בשל החשיבות של שלפוחיות חוץ-תאיות בהאכלת קרציות ומניפולציה של תגובות ריפוי חיסון ופצעים של המארח18,20, המטען בתוך שלפוחיות חוץ-תאיות מציג מטרות פוטנציאליות לפיתוח טיפולים נגד קרציות ומנגנון ייחודי לשיבוש האכלת הקרציות. זה כולל miRNAs בתוך בלוטות הרוק של קרציות ושלפוחיות חוץ-תאיות שמקורן בבלוטת הרוק.
miRNAs הם רצפים קצרים שאינם מקודדים, באורך של כ-18-22 נוקלאוטידים (nt), שיכולים לווסת, להשפיל או להשתיק רצפי mRNA לאחר שעתוק30,31. במהלך שעתוק, ה-pri-miRNAs נבקעים על ידי Dicer (RNA פולימראז III) ויוצרים מבנה ייחודי דמוי סיכת שיער, והופכים ל-pre-miRNA. הקדם-miRNA נחתך שוב על ידי Drosha (RNA פולימראז III) כדי ליצור דופלקס miRNA בוגר. הרצף הבוגר משתלב בקומפלקס ההשתקה המושרה על ידי RNA (RISC) המשלים את רצף ה-mRNA, וגורם להדחקת תרגום או לפירוק mRNA 28,30,32. במהלך האכלת הפונדקאי, miRNAs בתוך רוק הקרציות יכולים לווסת את ביטוי הגנים המארחים כדי לדכא תגובות חיסוניות ולהגביר את העברת הפתוגנים ל-33,34,35,36,37. למרות שקיימים מחקרים מקיפים על כלי רכב חשמליים ו-miRNA, תפקידם במהלך ההזנה בממשק הטיק-מארח עדיין לא מובן היטב. אופטימיזציה של פרוטוקולים שיכולים בקלות לגרום לבידוד וטיהור של miRNA באיכות גבוהה היא חיונית לקידום הידע שלנו בנושאים אלה.
ניתן להשתמש באפשרויות רבות כדי לבודד כלי רכב חשמליים, כגון אולטרה-צנטריפוגציה, משקעים אקסוזומים, משקעים פולימריים, כרומטוגרפיה של אימונו-אפיניטי וטכניקות הרחקה מבוססות גודל38. עם זאת, טכניקות אלה אינן יכולות להבחין בין אקסוזומים או מיקרו-וסיקלים. לפיכך, כאמור, EV משמש כמונח מטריה בעת בידוד כלי רכב חשמליים מדגימות שונות. הבועיות שבודדו בניסויים המתוארים כאן מייצגות תערובת של שלפוחיות שמקורן במסלולי ביוגנזה שונים. טיהור נוסף של אוכלוסייה מסוימת של בועיות חוץ-תאיות יכול להיות מושג על ידי מיצוי חיסוני באמצעות חרוזים המצופים בנוגדנים נגד סמנים (כלומר, סמנים אקסוזומליים, סמני גידול) הייחודיים לאוכלוסיית השלפוחית המעניינת39,40. ניתן גם לחלץ miRNAs באמצעות ערכות בידוד שונות הזמינות מסחרית 7,41,42.
מטרת הפרויקט הייתה לפתח פרוטוקול המשלב שיטות נפוצות לבידוד כלי רכב חשמליים ולמיצוי miRNA הן מרכבים חשמליים והן מבלוטות רוק מוזנות. מאחר שהפרשת תרכובות ביו-אקטיביות מופעלת על-ידי האכלהשל 12, יש לאפשר לקרציות להזין כדי לזהות miRNAs שעשויים להיות חשובים למניפולציה של תגובות חיסוניות ופצעים של פונדקאי. הפרוטוקול הנוכחי דורש מספר קטן של קרציות (20 קרציות) כדי לבודד כלי רכב חשמליים ואת ה-miRNA שלהם בהתאמה, בהשוואה למחקרים אחרים שתוארו קודם לכן שדרשו 2000 קרציות43. יתר על כן, הוא מונע זיהום של הפרשות רוק עם pilocarpine44, אשר יכול להשפיע על ניסויים החוקרים את ההשפעה של כלי רכב חשמליים ואת miRNAs שלהם על תאים מארחים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m syringe filter</td>
			<td>GenClone</td>
			<td>25-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 &#181;m nylon syringe filter</td>
			<td>Tisch Scientific</td>
			<td>283129028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 inch black adhesive</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B00FQ937NM</td>
			<td>Capsule</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL needeless syringe</td>
			<td>Exelint</td>
			<td>26265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#39; and 5&#39; Adapters</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 mm vannas scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.1523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>337922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-003-CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beads</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5425</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Macron</td>
			<td>UN1888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyverse Discovery Enviornment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://cyverse.org/discovery-environment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sideded carpet tape</td>
			<td>amazon</td>
			<td>&#8206;286373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Tubes, 50 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>FBS-02-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fine forceps</td>
			<td>Excelta</td>
			<td>5-S-SE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foamies, 2 mm</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B004M5QGBQ</td>
			<td>Capsule</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Phoenix Pharmaceuticals manfactured</td>
			<td>193.33165.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ixodes scaplaris</td>
			<td>CDC, Oklahoma State University</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L15C300 medium</td>
			<td>In-lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lipoprotein-cholesterol concentrate</td>
			<td>MPI</td>
			<td>02191476-CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10118-596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRDeep2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/rajewsky-lab/mirdeep2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-MuLV Reverse Transcriptase</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>molecular grade ethanol</td>
			<td>Fischer Bioreagents</td>
			<td>UN1170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multi-well 24 well tissue culture treated plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanopaticle Tracking Analyzer machine</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosep with 300K Omega filter</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>OD3003C33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit v3</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq 500/550 High Output Kit (75 cycles)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XPN 90 Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>Thermofischer Scientific</td>
			<td>ICN19453780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pippettes</td>
			<td>Ependorff</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polycarbonate centrifuge bottle</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen miRNeasy kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAzol lysis reagent</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>Q32880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit kit</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>Q10212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbits</td>
			<td>Charles River</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Universal Primer</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhipicephalus microplus</td>
			<td>Cattle Fever Tick Research Labratoty</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Fischer Bioreagents</td>
			<td>215544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>833280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse free tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse inhibitor</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>11111729</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse/DNAse free water</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Minelute spin column</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217084</td>
			<td>Qiagen miRNeasy kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPE Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217084</td>
			<td>Qiagen miRNeasy kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT Buffer</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-seq kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT Forward Primer</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-seq kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTE Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217084</td>
			<td>Qiagen miRNeasy kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6014-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall ST16</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>75004380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized Gauze sponges</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>2187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized PBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>RNBK0694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>streptomycin</td>
			<td>thermofischer Scientific</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TapeStation</td>
			<td>Aligent</td>
			<td>G2991BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tear Mender Instant Fabric and Leather Adhesive</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>7.42836E+11</td>
			<td>Capsule</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Adhesive</td>
			<td>3M VetBond</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triple Antibiotics</td>
			<td>dechra</td>
			<td>17033-122-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptose phosphate broth</td>
			<td>BD</td>
			<td>BD 260300</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of micrornas from tick ex vivo salivary gland cultures and extracellular vesicles

קרציות הן ectoparasitesites חשוב שיכולים וקטור פתוגנים מרובים. בלוטות הרוק של הקרציות חיוניות להאכלה מכיוון שהרוק שלהן מכיל אפקטים רבים בעלי תכונות פרמצבטיות שיכולות להפחית את התגובה החיסונית של המארח ולהגביר את העברת הפתוגנים. קבוצה אחת של משפיעים כאלה הם מיקרו-רנ"א (miRNAs). miRNAs הם רצפים קצרים שאינם מקודדים המווסתים את ביטוי הגנים המארחים בממשק הקרצייה-מארח ובתוך איברי הקרצייה. רנ"א קטנים אלה מועברים ברוק הקרציות באמצעות שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs), המשרתות תקשורת בין-תאית ותוך-תאית. שלפוחיות המכילות miRNA זוהו ברוק של קרציות. עם זאת, מעט ידוע על התפקידים והפרופילים של miRNAs בשלפוחיות ובלוטות רוק קרציות. יתר על כן, המחקר של שלפוחיות ו miRNAs ברוק קרציות דורש הליכים מייגעים כדי לאסוף רוק קרציות. פרוטוקול זה נועד לפתח ולאמת שיטה לבידוד miRNAs מבועיות חוץ-תאיות מטוהרות המיוצרות על ידי תרביות איברים ex vivo . החומרים והמתודולוגיה הדרושים לחילוץ miRNA מבועיות חוץ-תאיות ומבלוטות רוק קרציות מתוארים כאן.

הפרוטוקול הנוכחי מספק מתודולוגיה מפורטת לחילוץ miRNA מבלוטות רוק ומרכבים חשמליים. על פי התוצאות, פרוטוקול זה יעיל לבידוד של miRNA מבוגרים של שני מיני קרציות שונים, I. scapularis ו - R. microplus, וניתן להשתמש בו גם במינים אחרים של קרציות. ריכוז כלי הרכב החשמליים (חלקיקים/מ"ל) נמדד באמצעות נת"ע. ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles at JoVE.com

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את הבידוד של מיקרו-רנ"א מבלוטות הרוק של קרציות ושלפוחיות חוץ-תאיות מטוהרות. זהו הליך אוניברסלי המשלב ריאגנטים ואספקה נפוצים. השיטה גם מאפשרת שימוש במספר קטן של קרציות, וכתוצאה מכך מיקרו-רנ"א איכותיים שניתן לרצף בקלות.

בידוד של מיקרו-רנ"א מתרביות בלוטת הרוק של Tick Ex Vivo ושלפוחיות חוץ-תאיות

Ticks are important ectoparasites that can vector multiple pathogens. The salivary glands of ticks are essential for feeding as their saliva contains many ...

פרוטוקול זה מאפשר לנו להשתמש במספר מופחת של קרציות מה שמפחית את עלות תחזוקת המושבה ומקטין את מספר בעלי החוליות הדרושים להאכלת קרציות. פרוטוקול זה דורש כ-20 קרציות. עם זאת, היתרון העיקרי מלבד שימוש בגודל מדגם קטן הוא שניתן ליישם פרוטוקול זה על מיני קרציות מרובים ושלבי חיים שונים.מלבד נתיחות קרציות או יישום לקראת אינטראקציות פונדקאי-טפיל, השפעת זיהום פתוגן על הפרשת מיקרו-רנ"א והשפעת שינויים פיזיולוגיים על מיקרו-רנ"א המופרש על ידי קרציות. כדי להתחיל, הכינו מדיה נטולת שלפוחית על ידי הוספת סרום בקר עוברי, ציר טריפטוז פוספט, תרכיז כולסטרול ליפופרוטאין 10%, 5% סודיום ביקרבונט, HEPES ומדיום L15C300 לבקבוק צנטריפוגה פוליקרבונט 26.3 מיליליטר והתאימו את הנפח לפי הצורך. עכשיו ultracentrifuge המדיום ב 100, 000 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס במשך 18 שעות.הסר בזהירות את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור והעבר את הסופרנטנט לצינור צנטריפוגה טרי. Ultracentrifuge את הצינור שוב. קחו את הסופר-נטנט והעבירו אותו דרך מסנן של 0.22 מיקרומטר כדי להסיר מזהמים.מכניסים את הסופר-נאטנט לצינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר ומאחסנים אותו במינוס 20 מעלות צלזיוס עד שיידרש או עד שלוש שנים. הוסיפו כמות מתאימה של אנטיביוטיקה ל-500 מיקרוליטרים של המדיום נטול השלפוחית בכל באר של צלחת תרבית בת 24 בארות. כעת, הוסיפו PBS עם ריפאמפיצין לבארות שאינן מכילות מדיום נטול שלפוחית כדי למנוע צמיחת חיידקים.הניחו את הקרציות על מגלשת זכוכית עם סרט שטיח דו-צדדי תחת מיקרוסקופ מנתח. לפני הנתיחה, להוסיף PBS המכיל rifampicin לקרצייה באמצעות מספריים של ארבעה מילימטר Vannas, לעשות חתך של כמילימטר אחד בצד של כל נקבה. כעת, הסירו את הצד הגבי ובלוטות הרוק של הקרצייה, ולאחר מכן הכניסו 20 עד 40 בלוטות רוק של קרציות ב-500 מיקרוליטרים של מדיום ללא שלפוחית שנוספו לבאר אחת בצלחת שטופלה בתרבית רקמה בת 24 בארות.לדגום את דגימות בלוטת הרוק ב 32 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות כדי לאפשר הפרשת שלפוחית חוץ תאית. בסוף הדגירה, פיפטה את כל המדיום המכיל את בלוטות הרוק לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר צנטריפוגה צנטריפוגה ב 300 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. העבר את הסופר-נאטנט לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש של 1.5 מיליליטר.יש להשעות את הכדור המכיל את בלוטות הרוק ב-RNA מאוחר יותר ולאחסן בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס עד לשימוש או ללא הגבלת זמן. כעת, הסר את הפסולת התאית על ידי צנטריפוגה של הסופרנטנט ב -2, 000 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות והפיפטציה של הסופרנאטנט לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש של 1.5 מיליליטר. לאחר מכן, צנטריפוגה ב 10, 000 פעמים G במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי להסיר גופים אפופטוטיים ושלפוחיות חוץ תאיות גדולות יותר ולהעביר את supernatant לצינור microcentrifuge טרי 1.5 מיליליטר.לאחר מכן להרכיב מסנן מזרק ניילון מיקרומטר אחד על מזרק 10 מיליליטר ולשמור אותו על צינור ultracentrifuge. לאחר מכן מוסיפים את המדגם וממלאים את המזרק עם 10 מיליליטר של PBS. מעבירים את הסופר-נטנט דרך המסנן לתוך הצינור.לאחר סינון ואיזון הצינורות, הנח אותם ברוטור 70 Ti ו ultracentrifuge את הצינורות ב 100, 000 פעמים G במשך 18 שעות בארבע מעלות צלזיוס. הבועיות החוץ-תאיות המרוכזות יוצרות גלולה לאחר אולטרה-צנטריפוגה. הסר את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור והשעה את הכדור ב- PBS.Pipette 500 microliters של שלפוחית חוץ תאית לתוך מסנן צנטריפוגלי 300 K צנטריפוגה ב 8, 000 פעמים G במשך 10 דקות בטמפרטורת הסביבה ולחזור על הליך זה עד כל שלפוחית חוץ תאית מסוננים. לבסוף, הוסף 400 microliters של PBS מעוקר לעמודה ומערבבים היטב כדי להסיר שלפוחית חוץ תאית המחוברת לממברנה. לאחר מכן הכניסו את הדגימה לצינור חופשי של 1.5 מיליליטר DNAase RNAse.הריכוז והגודל של שלפוחיות חוץ-תאיות השתנו בהתאם למין ולשלב החיים של הקרציות בין ההעתקים הביולוגיים של נקבות, זכרים ונימפות. עבור כל השכפולים הביולוגיים המשולבים, נצפו תוצאות דומות. ניתוח של רנ"א קטנים שבודדו מבלוטת הרוק הראה פסים המתאימים לרנ"א ריבוזומלי ומיקרו-רנ"א.עם זאת, הרנ"א הריבוזומלי נעדר בבועיות שבודדו מבלוטות הרוק, ודגימות מיקרו-רנ"א שטוהרו מבועיות חוץ-תאיות הראו ירידה רבה יותר. לאחר ההעשרה, דגימות המיקרו-רנ"א שטוהרו מכלי רכב חשמליים הראו השפלה מינימלית וריכוז מיקרו-רנ"א מספיק לסינתזה של ספריית cDNA. גודל הפס הצפוי של כ-150 זוגות בסיסים לאחר קבלת הכנת ספריית cDNA מסמל ספריות RNA cDNA קטנות.במהלך הכנה ללא שלפוחית, הקפד לבצע את השלבים כדי למנוע זיהום שלפוחית חיצונית. במהלך הכנת צלחת היטב, הקפידו להוסיף אנטיביוטיקה כדי למנוע זיהום חיידקי מהמיקרוביום של הקרציות. המיקרו-רנ"א שחולצו באמצעות פרוטוקול זה יכולים לשמש ליצירת פרופילים ולניסויים פונקציונליים כדי לאמת תפקידי מיקרו-רנ"א כגון חיזוי מטרות של מסלולי מיקרו-רנ"א, ניסויי עיכוב וחיקוי.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells

בידוד של בלוטת הרוק עכבר תאים גזע

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of ...

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

בידוד ערפדים של נוזלים מתאיים<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

The genetically tractable model organism C. elegans has provided insights into a myriad of biological questions, enabled by its short generation time, ...

Isolation of Basal Cells and Submucosal Gland Duct Cells from Mouse Trachea

בידוד של תאי בסיס ותאי בלוטת Duct Submucosal מעכבר קנה נשימה

The large airways are directly in contact with the environment and therefore susceptible to injury from toxins and infectious agents that we breath in 1. ...

Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures

שינוי ורקומבינציה גנטי של תרבויות איברי בלוטות רוק

Branching  morphogenesis occurs during the development of many organs, and the embryonic  mouse submandibular gland (SMG) is a classical model for the ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

בידוד תאי גזע בוגרים נאיבי מתרבויות פיברובלסטים אנושיות הראשוניות

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Isolation of Intact, Whole Mouse Mammary Glands for Analysis of Extracellular Matrix Expression and Gland Morphology

בידוד של בלוטות מוגדלות ללא פגע, כל עכבר לניתוח של בלוטת מורפולוגיה וביטוי מטריצה חוץ-תאית

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal ...

Isolation of Retinal Arterioles for Ex Vivo Cell Physiology Studies

Isolation of Retinal Arterioles for Ex Vivo Cell Physiology Studies

בידוד של רבים ברשתית ללימודי פיזיולוגיה של התא Vivo לשעבר

The retina is a highly metabolically active tissue that requires a substantial blood supply. The retinal circulation supports the inner retina, while the ...

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

זרימה Cytometric ניתוח של שלפוחית חוץ-תאית ממדיה ממוזגים-תא

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

טיהור וניתוח מסחטות של האלקאים ושלפוחיות

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

בידוד וטיהור מדרגיים של שלפוחיות חוץ-תאיות מ-Escherichia coli וחיידקים אחרים

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...