Name: isolation of micrornas from tick ex vivo salivary gland cultures and extracellular vesicles
Uploaded: 2022-04-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles at JoVE.com

テキサス州エジンバーグの牛コレラダニ研究所からの支援に深く感謝しています。マイケル・モーゼス、ジェイソン・ティドウェル、ジェームズ・ヘルムス、セザリオ・アガド、ホーマー・バスケスに感謝します。また、サラ・シャープトン、エリザベス・ローストロ、エイミー・フィリップ、ケルシー・ジョンソン、ケリー・コッカン、アンドリュー・ヒルハウス、シャルルツ・アロチョ・ロザリオ、ステファニー・グスマン・バレンシアのプロジェクト全体の支援に感謝します。テキサスA&M Aggie Women in Entomology(AWE)ライティンググループには、この原稿の執筆中に助けとアドバイスをいただき、感謝します。以下の試薬は、BEI Resources、NIAID、NIHによる配布のために疾病管理予防センターによって提供された: Ixodes scapularis Adult (Live), NR-42510.雌 のI. scapularisダニも オクラホマ州立大学のティック飼育施設から受け取られた。このプロジェクトは、テキサスA&M大学T3:トランスフォーメーション助成金のためのトライアドと、USDA-ARSからAOCへの協力協定#58-3094-1-003によって資金提供されました。

すべての動物実験は、テキサスA&M大学の施設動物ケアおよび使用委員会(AICUC)によって承認された動物使用プロトコル(AUP#2020-0026)に従って実施した。ダニ種、 Ixodes scapularisおよび Rhipicephalus(Boophilus)マイクロプラス、ならびに42〜72日齢のニュージーランドオス白ウサギを本研究に使用した。 I. scapularisは 、疾病管理センター(CDC)およびオクラホマ州立大学から受領され、病?...

現在のプロトコルは、唾液腺およびEVからmiRNAを抽出するための詳細な方法論を提供する。ただし、重要な考慮事項があり、そのすべてがこのプロトコルの各セクションのメモに詳述されています。カプセルとメッシュネットは、ダニの餌やり中に固定して、ダニの逃げないようにする必要があります。カプセルの調製および配置は、Kogaら40に記載されている。不適切なサン...

ダニは、多くの病原体を野生生物、家畜、人間、およびそれらのペットに媒介する外部寄生虫である1,2。ダニの摂食は、隠れる損傷を引き起こし、重度の貧血による体重および牛乳生産を減少させ、潜在的に致命的な疾患を引き起こす病原体の伝播を引き起こすことによって、著しい経済的損失をもたらす1,3,4,5。ダニ集団を管理するための現在の制御慣行は、殺ダニ剤の使用に焦点を当てている。それにもかかわらず、家畜5,6を寄生するダニにおける殺ダニ剤耐性の継続的な出現、ダニ刺咬7の発生率の増加、および住宅地8,9内での病原体伝達は、ユニークなダニ防除代替物の必要性につながっている。
ダニの唾液腺は、ダニの生物学的成功を確実にする不可欠な器官である。それらは、様々な生理学的機能を有する異なる腺房タイプ(I、II、III、およびIV)によって形成される。唾液腺は、唾液分泌を介して過剰の水分および鉄含有量を宿主に戻すことによって、宿主のオフおよびオンの両方の浸透圧調節に関与している2,10。I型アチーニはまた、吸湿性唾液10、11の分泌による大気からの水の取り込みにも関与している。セメントおよびシスタチンなどの唾液エフェクタータンパク質は、II型およびIIIアシニ10,12の分泌細胞内で産生される。I型アチーニはダニの摂食に影響を及ぼさず、血粉摂取がこれらのアチーニ型13,14の形態学的および生理学的変化を引き起こさないことを示す。一方、アチーニII型およびIII型は摂食中に活性化され、付着前の活性はほとんど存在しない。したがって、摂食は、II型アチーニ内の分泌細胞の拡大および生理活性化合物の産生を誘発するために必要である。III型腺房は、分泌顆粒12内の分泌のために摂食中にサイズが縮小される。
唾液腺はまた、ダニおよび感染経路における病原体感染の部位でもある。摂食中、ダニは血粉を正常に完了するために必要な薬学的効果を有するいくつかの化合物を分泌する10、15、16。これらの化合物は、抗炎症性、免疫抑制性、および血管拡張性を有する10、15、17。最近の研究は、ダニ唾液腺に由来する細胞外小胞(EV)がこれらの化合物のいくつかを保有し、抗炎症および免疫調節効果を誘導することを示している18、19、20。「細胞外小胞」は、そのサイズおよび生合成に基づいてエキソソームおよび微小小胞として分類される小胞を記述するために使用される包括的な用語である。全体として、EVは、サイズ21で〜40nm-1μmの二重膜を有する脂質ブレブである。一般に、エキソソームはサイズが40〜150nmであると記載されているが、微小小胞はサイズが150nm〜1μmの間である21、22、23。しかしながら、その大きさは、EVs生合成経路22を示すものではない。
エキソソームの生合成は、原形質膜の逐次的な浸潤から始まる。この浸潤は多胞体の形成をもたらし、最終的にESCRT複合体またはスフィンゴミエリナーゼ(sMases)の作用による小胞膜の変形をもたらす24,25。エキソソームは、細胞恒常性を維持するためにリソソーム内で溶解されるか、または原形質膜への小胞融合を介して出て、細胞構成成分をレシピエント細胞に送達することができる21、24。一方、マイクロベシクルは、フローパスやフリップアスの作用により形成され、原形質膜26における脂質の立体構造を変化させる。EVは細胞間通信に不可欠であり、脂質、タンパク質、核酸、マイクロRNA(miRNA)などの細胞内貨物の輸送システムとして機能しています21,27,28。一旦輸送されると、これらの小胞は、それらの貨物をレシピエント細胞の細胞質に送達し、受容細胞22、29に表現型変化を生じる。ダニ摂食における細胞外小胞の重要性および宿主免疫および創傷治癒応答の操作18,20のために、細胞外小胞内の貨物は、抗ダニ治療薬の開発のための潜在的な標的およびダニ摂食を破壊するユニークなメカニズムを提示する。これには、ダニ唾液腺および唾液腺由来の細胞外小胞内のmiRNAが含まれる。
miRNAは、短い非コード配列であり、長さが〜18〜22ヌクレオチド(nt)であり、mRNA配列を転写後的に調節、分解、またはサイレンシングすることができる30、31。転写中、pri-miRNAはDicer(RNAポリメラーゼIII)によって切断され、特徴的なヘアピン様構造を形成し、プレmiRNAとなる。プレmiRNAは、ドロシャ(RNAポリメラーゼIII)によって再び切断され、成熟miRNA二重鎖を形成する。成熟配列は、mRNA配列に相補的なRNA誘導サイレンシング複合体(RISC)に組み込まれ、翻訳抑制またはmRNA分解を引き起こす28、30、32。宿主の摂食中、ダニの唾液中のmiRNAは宿主の遺伝子発現を調節して免疫応答を抑制し、病原体の伝達を増強することができる33、34、35、36、37。EVとmiRNAに関する広範な研究は存在するが、ダニと宿主の界面での摂食中のそれらの役割はまだほとんど理解されていない。高品質のmiRNAの単離と精製を容易に得られるプロトコルを最適化することは、これらのトピックに関する知識を進歩させるために不可欠です。
EVを単離するために、超遠心分離、エキソソーム沈殿、ポリマー沈殿、イムノアフィニティークロマトグラフィー、サイズベースの排除技術など、複数のオプションを利用することができます38。しかしながら、これらの技術は、エキソソームまたは微小小胞を区別することができない。したがって、前述のように、EVは異なるサンプルからEVを分離する際の包括的な用語として使用されます。本明細書に記載される実験において単離された小胞は、異なる生合成経路に由来する小胞の混合物を表す。細胞外小胞の特定の集団のさらなる精製は、目的の小胞集団に固有のマーカー(すなわち、エキソソームマーカー、腫瘍マーカー)に対する抗体でコーティングされたビーズを用いた免疫沈降によって達成することができる39、40。miRNAは、異なる市販の単離キット7、41、42を介して抽出することもできる。
このプロジェクトの目的は、EVを単離し、EVと摂食ダニ唾液腺の両方からmiRNAを抽出するために一般的に適用される方法を組み合わせたプロトコルを開発することでした。生理活性化合物の分泌は摂食12によって活性化されるので、ダニは宿主の免疫および創傷治癒応答を操作するために重要であるかもしれないmiRNAを同定するために摂食を許可されるべきである。現在のプロトコルは、EVおよびそれぞれのmiRNAを単離するために少数のダニ(20ダニ)を必要とするが、2000ダニ43を必要とした他の前述の研究と比較して。さらに、ピロカルピン44による唾液分泌物の汚染を回避し、宿主細胞に対するEVおよびそのmiRNAの効果を研究する実験に影響を与える可能性がある。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m syringe filter</td>
			<td>GenClone</td>
			<td>25-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 &#181;m nylon syringe filter</td>
			<td>Tisch Scientific</td>
			<td>283129028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 inch black adhesive</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B00FQ937NM</td>
			<td>Capsule</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL needeless syringe</td>
			<td>Exelint</td>
			<td>26265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#39; and 5&#39; Adapters</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 mm vannas scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.1523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>337922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-003-CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beads</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5425</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Macron</td>
			<td>UN1888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyverse Discovery Enviornment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://cyverse.org/discovery-environment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sideded carpet tape</td>
			<td>amazon</td>
			<td>&#8206;286373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Tubes, 50 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>FBS-02-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fine forceps</td>
			<td>Excelta</td>
			<td>5-S-SE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foamies, 2 mm</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B004M5QGBQ</td>
			<td>Capsule</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Phoenix Pharmaceuticals manfactured</td>
			<td>193.33165.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ixodes scaplaris</td>
			<td>CDC, Oklahoma State University</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L15C300 medium</td>
			<td>In-lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lipoprotein-cholesterol concentrate</td>
			<td>MPI</td>
			<td>02191476-CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10118-596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRDeep2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/rajewsky-lab/mirdeep2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-MuLV Reverse Transcriptase</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>molecular grade ethanol</td>
			<td>Fischer Bioreagents</td>
			<td>UN1170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multi-well 24 well tissue culture treated plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanopaticle Tracking Analyzer machine</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosep with 300K Omega filter</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>OD3003C33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit v3</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq 500/550 High Output Kit (75 cycles)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XPN 90 Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>Thermofischer Scientific</td>
			<td>ICN19453780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pippettes</td>
			<td>Ependorff</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polycarbonate centrifuge bottle</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen miRNeasy kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAzol lysis reagent</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>Q32880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit kit</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>Q10212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbits</td>
			<td>Charles River</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Universal Primer</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhipicephalus microplus</td>
			<td>Cattle Fever Tick Research Labratoty</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Fischer Bioreagents</td>
			<td>215544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>833280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse free tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse inhibitor</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>11111729</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse/DNAse free water</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Minelute spin column</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217084</td>
			<td>Qiagen miRNeasy kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPE Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217084</td>
			<td>Qiagen miRNeasy kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT Buffer</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-seq kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT Forward Primer</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-seq kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTE Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217084</td>
			<td>Qiagen miRNeasy kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6014-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall ST16</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>75004380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized Gauze sponges</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>2187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized PBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>RNBK0694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>streptomycin</td>
			<td>thermofischer Scientific</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TapeStation</td>
			<td>Aligent</td>
			<td>G2991BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tear Mender Instant Fabric and Leather Adhesive</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>7.42836E+11</td>
			<td>Capsule</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Adhesive</td>
			<td>3M VetBond</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triple Antibiotics</td>
			<td>dechra</td>
			<td>17033-122-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptose phosphate broth</td>
			<td>BD</td>
			<td>BD 260300</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of micrornas from tick ex vivo salivary gland cultures and extracellular vesicles

ダニは、複数の病原体を媒介することができる重要な外部寄生虫である。ダニの唾液腺は、その唾液が宿主の免疫応答を減少させ、病原体の伝達を増強することができる医薬的特性を有する多くのエフェクターを含むので、摂食に不可欠である。このようなエフェクターの1つのグループは、マイクロRNA(miRNA)である。miRNAは、ダニと宿主の界面およびダニの器官内で宿主遺伝子発現を調節する短い非コード配列である。これらの小さなRNAは、細胞間および細胞内のコミュニケーションに役立つ細胞外小胞(EV) を介して ダニの唾液中に輸送される。miRNAを含む小胞は、ダニの唾液中に同定されている。しかし、ダニの唾液小胞および腺におけるmiRNAの役割およびプロファイルについてはほとんど知られていない。さらに、ダニの唾液中の小胞およびmiRNAの研究は、ダニの唾液を収集するための退屈な手順を必要とする。このプロトコルは、 エクスビボ 臓器培養によって産生された精製された細胞外小胞からmiRNAを単離する方法を開発し、検証することを目的としています。細胞外小胞およびダニ唾液腺からmiRNAを抽出するために必要な材料および方法論が本明細書に記載されている。

本プロトコルは、唾液腺およびEVからmiRNAを抽出するための詳細な方法論を提供する。結果によると、このプロトコルは、 I. scapularis および R. microplusの2つの異なるダニ種の成体からのmiRNAの単離に有効であり、潜在的に他のダニ種でも使用することができる。EVの濃度(粒子/mL)はNTA 経由で 測定した。 R. microplusの場合、各性別およびライフステージには、3つの技術的...

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Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

本プロトコールは、ダニ唾液腺および精製された細胞外小胞からのマイクロRNAの単離を記載する。これは、一般的に使用される試薬と消耗品を組み合わせた普遍的な手順です。この方法はまた、少数のダニの使用を可能にし、容易に配列決定することができる高品質のマイクロRNAをもたらす。

ダニ Ex Vivo 唾液腺培養物および細胞外小胞からのマイクロRNAの単離

Ticks are important ectoparasites that can vector multiple pathogens. The salivary glands of ticks are essential for feeding as their saliva contains many ...

このプロトコルにより、ダニの数を減らすことができ、コロニーの維持コストを削減し、ダニの摂食に必要な椎骨動物の数を減らすことができます。このプロトコルには約 20 ティックが必要です。ただし、小さなサンプルサイズを使用することを除けば、このプロトコルを複数のダニ種と異なるライフステージに適用できることが主な利点です。ダニの解剖や宿主と寄生虫の相互作用への応用は別として、マイクロRNA分泌に対する病原体感染の影響とダニによって分泌されるマイクロRNAに対する生理学的変化の影響。まず、ウシ胎児血清、トリプトースリン酸ブロス、10%リポタンパク質コレステロール濃縮物、5%重炭酸ナトリウム、HEPES、およびL15C300培地を26.3ミリリットルのポリカーボネート遠心分離機ボトルに追加して、小胞を含まない培地を準備し、必要に応じて容量を調整します。次に、培地を摂氏4度で100, 000倍Gで18時間超遠心分離します。ペレットを乱さずに上清を注意深く取り除き、上清を新しい遠沈管に移します。チューブをもう一度超遠心分離します。上清を取り、0.22マイクロメートルのフィルターに通して汚染物質を除去します。上清を50ミリリットルの遠心チューブにピペットで入れ、必要になるまで摂氏マイナス20度または最長3年間保管します。24ウェル培養プレートの各ウェルの500マイクロリットルのベシクルフリー培地に適量の抗生物質を加えます。次に、細菌の増殖を防ぐために、小胞を含まない培地を含まないウェルにリファンピシンを含むPBSを追加します。解剖顕微鏡下で両面カーペットテープでスライドガラスの上にダニを置きます。解剖する前に、リファンピシンを含むPBSをダニに加え、4ミリメートルのバンナハサミを使用して、各女性の側面に約1ミリメートルの切開を行います。次に、ダニの背側と唾液腺を取り除き、24ウェル組織培養処理プレートの単一のウェルに加えた500マイクロリットルの小胞を含まない培地に20〜40個のダニの唾液腺を入れます。唾液腺サンプルを摂氏32度で24時間インキュベートして、細胞外小胞の分泌を可能にします。インキュベーションの最後に、唾液腺を含むすべての培地を1.5ミリリットルの微量遠心チューブにピペットで入れ、摂氏4度で300倍Gで10分間遠心分離します。上清を新しい1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。後で唾液腺を含むペレットをRNAに再懸濁し、使用するまで摂氏マイナス80度で無期限に保管します。次に、上清を摂氏4度で2, 000倍Gで10分間遠心分離して細胞の破片を取り除き、上清を新しい1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブにピペットで入れます。次に、摂氏4度で30分間10, 000倍Gで遠心分離し、アポトーシス小体とより大きな細胞外小胞を除去し、上清を新しい1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移します。次に、10ミリリットルのシリンジに1マイクロメートルのナイロンシリンジフィルターを組み立て、超遠心チューブに保管します。次にサンプルを追加し、シリンジに10ミリリットルのPBSを充填します。上清をフィルターを通してチューブに通します。チューブをろ過してバランスをとった後、70 Tiローターに入れ、摂氏4度で18時間、100、000倍Gでチューブを超遠心分離します。濃縮された細胞外小胞は、超遠心分離後にペレットを形成する。ペレットを乱すことなく上清を除去し、ペレットをPBSに再懸濁します。500マイクロリットルの細胞外小胞を300 K遠心フィルターにピペットで入れ、周囲温度で8, 000倍Gで10分間遠心分離し、すべての細胞外小胞がろ過されるまでこの手順を繰り返します。最後に、400マイクロリットルの滅菌PBSをカラムに加え、十分に混合して、膜に付着した細胞外小胞を除去します。次に、サンプルを1.5ミリリットルのDNAアーゼRNAseフリーチューブに入れます。細胞外小胞の濃度と大きさは、雌、雄、ニンフの生物学的複製の間のダニの性別とライフステージによって異なりました。全ての組み合わせた生物学的複製について、同様の結果が観察された。唾液腺から単離された低分子RNAの解析は、リボソームRNAおよびマイクロRNAに対応するバンドを示した。しかし、唾液腺から分離された小胞にはリボソームRNAは存在せず、細胞外小胞から精製されたマイクロRNAサンプルはより多くの分解を示しました。濃縮後、EVから精製されたマイクロRNAサンプルは、最小限の分解とcDNAライブラリ合成に十分なマイクロRNA濃度を示しました。cDNAライブラリ調製後に約150塩基対の予想されるバンドサイズが得られたことは、低分子RNA cDNAライブラリを意味する。ベシクルフリーの準備中は、外部ベシクルの汚染を防ぐための手順に従ってください。ウェルプレートの準備中は、ダニの微生物叢からの細菌汚染を防ぐために抗生物質を必ず追加してください。このプロトコルを使用して抽出されたマイクロRNAは、マイクロRNA経路の標的の予測、阻害、模倣実験などのマイクロRNAの役割を検証するためのプロファイリングおよび機能実験に使用できます。

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells

マウス唾液腺幹細胞の単離

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of ...

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

から細胞外液のヴァンパイア·アイソレーション<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em

The genetically tractable model organism C. elegans has provided insights into a myriad of biological questions, enabled by its short generation time, ...

Isolation of Basal Cells and Submucosal Gland Duct Cells from Mouse Trachea

マウス気管から基底細胞および粘膜下腺管細胞の単離

The large airways are directly in contact with the environment and therefore susceptible to injury from toxins and infectious agents that we breath in 1. ...

Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures

唾液腺器官培養の遺伝子改変と再結合

Branching  morphogenesis occurs during the development of many organs, and the embryonic  mouse submandibular gland (SMG) is a classical model for the ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

初代ヒト線維芽細胞培養からナイーブ成人幹細胞の分離

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Isolation of Intact, Whole Mouse Mammary Glands for Analysis of Extracellular Matrix Expression and Gland Morphology

そのままに、全体のマウス乳腺の腺の形態と細胞外マトリックス式の分析のための分離

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal ...

Isolation of Retinal Arterioles for Ex Vivo Cell Physiology Studies

Isolation of Retinal Arterioles for Ex Vivo Cell Physiology Studies

Ex Vivo細胞生理学研究のため網膜細動脈の隔離

The retina is a highly metabolically active tissue that requires a substantial blood supply. The retinal circulation supports the inner retina, while the ...

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

フローサイトメトリー法による細胞小胞細胞調節されたメディアからの解析します。

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

細胞外小胞体のカエノールハブディティス・エレガンスの精製と分析

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

大腸菌およびその他の細菌からの細胞外小胞のスケーラブルな単離および精製(英語)

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...