Name: isolation of micrornas from tick ex vivo salivary gland cultures and extracellular vesicles
Uploaded: 2022-04-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles at JoVE.com

우리는 텍사스 주 에딘버러에있는 Cattle Fever 진드기 연구소의 지원에 크게 감사드립니다. 마이클 모세, 제이슨 티드웰, 제임스 헬럼스, 세자리오 아가도, 호머 바스케스에게 감사드립니다. 우리는 또한 Sarah Sharpton, Elizabeth Lohstroh, Amy Filip, Kelsey Johnson, Kelli Kochcan, Andrew Hillhouse, Charluz Arocho Rosario 및 Stephanie Guzman Valencia의 도움을 프로젝트 전반에 걸쳐 인정하고 싶습니다. 이 원고를 작성하는 동안 텍사스 A & M Aggie Women in Entomology (AWE) Writing Group에 도움과 조언을 해주신 것에 감사드립니다. 다음 시약은 BEI Resources, NIAID, NIH에 의한 유통을 위해 질병 통제 및 예방 센터에 의해 제공되었다 : Ixodes 견갑골증 성인 (라이브), NR-42510. 여성 I. 견갑골 진드기는 오클라호마 주립 대학의 진드기 사육 시설에서도 받았다. 이 프로젝트는 Texas A & M University T3 : 변환 보조금을위한 트라이어드와 USDA-ARS가 AOC에 대한 협력 계약 # 58-3094-1-003에 의해 자금을 지원했습니다.

모든 동물 실험은 텍사스 A & M 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (AICUC)의 승인 된 동물 사용 프로토콜 (AUP # 2020-0026)에 따라 수행되었습니다. 진드기 종, Ixodes 견갑골증 및 리피세팔루스(Boophilus) 마이크로플러스, 및 42-72일령의 뉴질랜드 수컷 흰 토끼를 본 연구에 사용하였다. I. 견갑골은 질병 통제 센터 (CDC)와 오클라호마 주립 대학에서 병원균이없는 것으로 인증되었습니다...

현재의 프로토콜은 타액선 및 EV로부터 miRNA를 추출하기 위한 상세한 방법론을 제공한다. 그러나 중요한 고려 사항이 있으며,이 모든 사항은이 프로토콜의 각 섹션에 대한 노트에 자세히 설명되어 있습니다. 진드기가 빠져 나가는 것을 방지하기 위해 진드기를 먹이는 동안 캡슐과 메쉬 그물을 고정해야합니다. 캡슐 제제 및 배치는 Koga et al.40에 기재되어 있다. 진드기 해부의 여러...

진드기는 야생 동물, 가축, 인간 및 애완 동물에게 많은 병원균을 벡터하는 외부 기생충입니다 1,2. 진드기 먹이는 가죽에 손상을 입히고, 심한 빈혈로 인한 체중 및 우유 생산을 줄이며, 잠재적으로 치명적인 질병을 일으키는 병원균 1,3,4,5의 전염으로 인해 상당한 경제적 손실을 초래합니다. 진드기 개체군을 관리하기위한 현재의 통제 관행은 살비제의 사용에 초점을 맞추고 있습니다. 그럼에도 불구하고, 가축5,6을 기생시키는 진드기에서 살비제 내성의 지속적인 출현, 진드기 물린의 발생률 증가7, 주거 지역 내의 병원균 전염 8,9은 독특한 진드기 통제 대안에 대한 필요성을 이끌어 냈다.
진드기 타액선은 진드기의 생물학적 성공을 보장하는 필수 기관입니다. 그들은 다양한 생리 기능을 가진 다른 acinus 유형 (I, II, III 및 IV)에 의해 형성됩니다. 타액선은 타액분비 2,10을 통해 과도한 물과 철분 함량을 숙주에게 돌려줌으로써 숙주 안팎에서 삼투 조절을 담당합니다. 타입 I acini는 또한 흡습성 타액10,11의 분비에 의해 대기로부터 물의 흡수에 관여한다. 타액 이펙터 단백질, 예를 들어 시멘트 및 시스타틴은 유형 II 및 III acini10,12에서 분비 세포 내에서 생산됩니다. 유형 I acini는 진드기 먹이기에 영향을 미치지 않으며, 이는 혈액 식사 섭취가 이러한 acini 유형13,14의 형태 학적 및 생리적 변화를 유발하지 않는다는 것을 나타냅니다. 반면에, Acini 유형 II 및 III는 먹이는 동안 활성화되며 사전 부착 된 활성이 거의 없습니다. 따라서, 먹이는 유형 II acini 내의 분비 세포의 확대 및 생리 활성 화합물의 생산을 촉발시키기 위해 필요하다. III형 아시니는 분비 과립(12) 내의 분비로 인해 먹이는 동안 크기가 감소된다.
타액선은 진드기와 전염 경로에서 병원균 감염 부위이기도합니다. 먹이를주는 동안, 진드기는 혈액 식사10,15,16의 성공적인 완료에 필요한 제약 효과가있는 여러 화합물을 분비합니다. 이들 화합물은 항염증성, 면역억제 및 혈관확장성 특성10,15,17을 갖는다. 최근 연구에 따르면 진드기 타액선에서 유래 한 세포 밖 소포 (EVs)는 이러한 화합물 중 몇 가지를 보유하여 항 염증 및 면역 조절 효과 18,19,20을 유도합니다. "세포밖 소포"는 그들의 크기 및 생물발생에 기초하여 엑소좀 및 마이크로베시클로 분류된 소포를 기술하는데 사용되는 포괄적인 용어이다. 전반적으로, EVs는 크기21에서 ~40 nm-1 μm인 이중층 막을 갖는 지질 블렙이다; 일반적으로 엑소좀은 크기가 40-150 nm 인 반면, 마이크로베시클은 크기가 150 nm-1 μm 사이인21,22,23 사이입니다. 그러나, 크기는 EVs 생물발생 경로(22)를 지시하지 않는다.
엑소좀의 생물발생은 원형질막의 순차적 질도입으로 시작됩니다. 이 질은 다소포체의 형성으로 이어지고 마침내 ESCRT 복합체 또는 스핑고미엘리나제 (sMases)의 작용에 의해 수포막의 변형을 초래합니다.24,25. 엑소좀은 세포 항상성을 유지하기 위해 리소좀 내에 용해되거나 수포 융합을 통해 원형질막으로 빠져나와 세포 구성성분을 수용자 세포(21,24)에 전달할 수 있다. 한편, 마이크로베시클은 플로패스 및 플립어엉덩이의 작용에 의해 형성되고, 원형질막(26)에서 지질의 입체형태를 변화시킨다. EV는 지질, 단백질, 핵산 및 마이크로RNA(miRNAs)21,27,28과 같은 세포내 화물을 위한 수송 시스템 역할을 하는 세포간 통신에 필수적이다. 일단 수송되면, 이들 소포는 수용자 세포의 세포질 내로 그들의 화물을 전달하여, 수용 세포(22,29)에서 표현형 변화를 생성한다. 진드기 먹이에서 세포 밖 소포의 중요성과 숙주 면역 및 상처 치유 반응18,20의 조작으로 인해, 세포 밖 소포 내의화물은 항 진드기 치료제 개발을위한 잠재적 인 목표와 진드기 먹이를 방해하는 독특한 메커니즘을 제시합니다. 여기에는 진드기 타액선 내 miRNAs와 타액선 유래 세포밖 소포가 포함됩니다.
miRNAs는 짧은 비-코딩 서열, ∼18-22 뉴클레오티드 (nt) 길이, 즉 전사 후 mRNA 서열30,31을 조절, 분해, 또는 침묵시킬 수 있다. 전사 동안, pri-miRNAs는 다이서(RNA 폴리머라제 III)에 의해 절단되어 특유의 헤어핀 유사 구조를 형성하고, 프리-miRNA가 된다. pre-miRNA는 Drosha (RNA 폴리머라제 III)에 의해 다시 한번 절단되어 성숙한 miRNA 듀플렉스를 형성한다. 성숙 서열은 mRNA 서열에 상보적인 RNA-유도 침묵 복합체 (RISC) 내로 통합되어, 번역 억제 또는 mRNA 분해 28,30,32를 야기한다. 숙주 먹이를 먹는 동안, 진드기 타액 내의 miRNAs는 숙주 유전자 발현을 조절하여 면역 반응을 억제하고 병원체 전달을 강화할 수 있다(33,34,35,36,37). EV 및 miRNA에 대한 광범위한 연구가 존재하지만, 진드기 - 숙주 인터페이스에서 먹이를주는 동안 그들의 역할은 여전히 잘 이해되지 않습니다. 고품질 miRNA의 분리 및 정제를 쉽게 초래할 수 있는 프로토콜을 최적화하는 것은 이러한 주제에 대한 지식을 발전시키는 데 매우 중요합니다.
EV를 분리하기 위해 다수의 옵션이 이용될 수 있는데, 예를 들어 초원심분리, 엑소좀 침전, 중합체 침전, 면역친화성 크로마토그래피, 및 크기-기반 배제 기술(38)이 있다. 그러나 이러한 기술은 엑소좀이나 마이크로베시클을 구별할 수 없다. 따라서, 앞서 언급한 바와 같이, EV는 상이한 샘플로부터 EV를 분리할 때 포괄적인 용어로서 사용된다. 본원에 기재된 실험에서 단리된 소포는 상이한 생물발생 경로로부터 유래된 소포의 혼합물을 나타낸다. 세포밖 소포의 특정 집단의 추가의 정제는 관심 소포 집단39,40에 고유한 마커 (즉, 엑소좀 마커, 종양 마커)에 대한 항체로 코팅된 비드를 사용하는 면역침전에 의해 달성될 수 있다. miRNA는 또한 상이한 상업적으로 이용가능한 분리 키트(7,41,42)를 통해 추출될 수 있다.
이 프로젝트의 목적은 EV를 분리하고 EV와 유당 타액선 모두에서 miRNA를 추출하기 위해 일반적으로 적용되는 방법을 결합한 프로토콜을 개발하는 것이 었습니다. 생리 활성 화합물의 분비는먹이 12에 의해 활성화되기 때문에, 진드기는 숙주 면역 및 상처 치유 반응을 조작하는 데 중요 할 수있는 miRNA를 확인하기 위해 사료를 허용해야합니다. 본 프로토콜은 2000 틱(43)을 필요로 하는 이전에 기술된 다른 연구들에 비해 EV들 및 그들의 각각의 miRNA들을 분리하기 위해 적은 수의 틱들(20 틱들)을 필요로 한다. 또한, 필로카르핀44로 타액 분비물의 오염을 피하며, 이는 EVs와 그들의 miRNA가 숙주 세포에 미치는 영향을 연구하는 실험에 영향을 미칠 수 있다.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m syringe filter</td>
			<td>GenClone</td>
			<td>25-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 &#181;m nylon syringe filter</td>
			<td>Tisch Scientific</td>
			<td>283129028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 inch black adhesive</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B00FQ937NM</td>
			<td>Capsule</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL needeless syringe</td>
			<td>Exelint</td>
			<td>26265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#39; and 5&#39; Adapters</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 mm vannas scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.1523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>337922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-003-CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beads</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5425</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Macron</td>
			<td>UN1888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyverse Discovery Enviornment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://cyverse.org/discovery-environment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sideded carpet tape</td>
			<td>amazon</td>
			<td>&#8206;286373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Tubes, 50 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>FBS-02-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fine forceps</td>
			<td>Excelta</td>
			<td>5-S-SE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foamies, 2 mm</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B004M5QGBQ</td>
			<td>Capsule</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Phoenix Pharmaceuticals manfactured</td>
			<td>193.33165.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ixodes scaplaris</td>
			<td>CDC, Oklahoma State University</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L15C300 medium</td>
			<td>In-lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lipoprotein-cholesterol concentrate</td>
			<td>MPI</td>
			<td>02191476-CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10118-596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRDeep2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/rajewsky-lab/mirdeep2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-MuLV Reverse Transcriptase</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>molecular grade ethanol</td>
			<td>Fischer Bioreagents</td>
			<td>UN1170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multi-well 24 well tissue culture treated plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanopaticle Tracking Analyzer machine</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosep with 300K Omega filter</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>OD3003C33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit v3</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq 500/550 High Output Kit (75 cycles)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XPN 90 Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>Thermofischer Scientific</td>
			<td>ICN19453780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pippettes</td>
			<td>Ependorff</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polycarbonate centrifuge bottle</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen miRNeasy kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAzol lysis reagent</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>Q32880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit kit</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>Q10212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbits</td>
			<td>Charles River</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Universal Primer</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhipicephalus microplus</td>
			<td>Cattle Fever Tick Research Labratoty</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Fischer Bioreagents</td>
			<td>215544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>833280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse free tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse inhibitor</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>11111729</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse/DNAse free water</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Minelute spin column</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217084</td>
			<td>Qiagen miRNeasy kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPE Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217084</td>
			<td>Qiagen miRNeasy kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT Buffer</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-seq kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT Forward Primer</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-seq kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTE Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217084</td>
			<td>Qiagen miRNeasy kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6014-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall ST16</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>75004380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized Gauze sponges</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>2187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized PBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>RNBK0694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>streptomycin</td>
			<td>thermofischer Scientific</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TapeStation</td>
			<td>Aligent</td>
			<td>G2991BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tear Mender Instant Fabric and Leather Adhesive</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>7.42836E+11</td>
			<td>Capsule</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Adhesive</td>
			<td>3M VetBond</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triple Antibiotics</td>
			<td>dechra</td>
			<td>17033-122-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptose phosphate broth</td>
			<td>BD</td>
			<td>BD 260300</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of micrornas from tick ex vivo salivary gland cultures and extracellular vesicles

진드기는 여러 병원체를 벡터 할 수있는 중요한 외부 기생충입니다. 진드기의 타액선은 타액에 숙주 면역 반응을 감소시키고 병원균 전달을 향상시킬 수있는 제약 특성을 가진 많은 이펙터가 포함되어 있기 때문에 먹이에 필수적입니다. 이러한 이펙터의 한 그룹은 마이크로RNA(miRNAs)이다. miRNAs는 진드기-숙주 계면과 진드기의 기관 내에서 숙주 유전자 발현을 조절하는 짧은 비코딩 서열이다. 이 작은 RNA는 세포 간 및 세포 내 의사 소통을 제공하는 세포 밖 소포 (EVs)를 통해 진드기 타액으로 운반됩니다. miRNA를 포함하는 소포는 진드기의 타액에서 확인되었습니다. 그러나 진드기 타액 소포와 땀샘에서 miRNA의 역할과 프로파일에 대해서는 거의 알려져 있지 않습니다. 또한, 진드기 타액의 소포와 miRNA에 대한 연구는 진드기 타액을 수집하는 지루한 절차가 필요합니다. 이 프로토콜은 생체외 장기 배양에 의해 생산된 정제된 세포밖 소포로부터 miRNA를 단리하는 방법을 개발하고 검증하는 것을 목표로 한다. 세포밖 소포 및 진드기 타액선으로부터 miRNAs를 추출하는데 필요한 물질 및 방법론이 본원에 기재되어 있다.

본 프로토콜은 타액선 및 EV로부터 miRNA를 추출하기 위한 상세한 방법론을 제공한다. 결과에 따르면, 이 프로토콜은 두 개의 상이한 진드기 종, I. 견갑골 및 R. 마이크로플러스의 성인으로부터 miRNA의 단리에 효과적이며, 잠재적으로 다른 진드기 종에서도 사용될 수 있다. EVs 농도(입자/mL)는 NTA 를 통해 측정되었다. R. microplus의 경우, 각 성별 및 수명 단계에는 세 가지 기술...

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Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

본 프로토콜은 진드기 타액선 및 정제된 세포밖 소포로부터 마이크로RNAs의 단리를 기술한다. 이것은 일반적으로 사용되는 시약과 공급을 결합하는 보편적 인 절차입니다. 이 방법은 또한 적은 수의 틱을 사용할 수있게하여 쉽게 시퀀싱 할 수있는 양질의 microRNA를 생성합니다.

Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures 및 Extracellular Vesicles에서 microRNAs의 분리

Ticks are important ectoparasites that can vector multiple pathogens. The salivary glands of ticks are essential for feeding as their saliva contains many ...

이 프로토콜을 사용하면 식민지 유지 비용을 줄이고 진드기 먹이에 필요한 척추 동물의 수를 줄이는 진드기 수를 줄일 수 있습니다. 이 프로토콜에는 약 20틱이 필요합니다. 그러나 작은 샘플 크기를 사용하는 것 외에 주요 이점은이 프로토콜이 여러 진드기 종 및 다양한 수명 단계에 적용될 수 있다는 것입니다.진드기 해부 또는 숙주-기생충 상호 작용에 대한 적용 외에도 병원체 감염이 microRNA 분비에 미치는 영향 및 진드기가 분비하는 microRNA에 대한 생리적 변화의 영향. 시작하려면 태아 소 혈청, 트립토스 인산염 액체, 10 % 지단백질 콜레스테롤 농축액, 5 % 중탄산 나트륨, HEPES 및 L15C300 배지를 26.3 밀리리터 폴리 카보네이트 원심 분리기 병에 추가하여 소포가없는 배지를 준비하고 필요에 따라 부피를 조정하십시오. 이제 섭씨 4도에서 100, 000 배 G에서 18 시간 동안 매체를 초 원심 분리합니다.펠릿을 방해하지 않고 상청액을 조심스럽게 제거하고 상청액을 새로운 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 튜브를 다시 한 번 초원심분리합니다. 상청액을 가져 와서 0.22 마이크로 미터 필터를 통과시켜 오염 물질을 제거하십시오.상청액을 50 밀리리터 원심 분리 튜브에 피펫팅하고 필요할 때까지 또는 최대 3 년까지 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오. 24웰 배양 플레이트의 각 웰에 있는 500마이크로리터의 소포가 없는 배지에 적절한 양의 항생제를 추가합니다. 이제 박테리아 성장을 방지하기 위해 소포가없는 배지가 포함되지 않은 웰에 리팜피신이 함유 된 PBS를 추가하십시오.해부 현미경으로 양면 카펫 테이프가있는 유리 슬라이드에 진드기를 놓습니다. 해부하기 전에 리팜피신이 함유 된 PBS를 진드기에 넣고 4 밀리미터 Vannas 가위를 사용하여 각 암컷의 측면에 약 1 밀리미터의 절개를하십시오. 이제 진드기의 등쪽과 침샘을 제거한 다음 24웰 조직 배양 처리된 플레이트의 단일 웰에 첨가된 500마이크로리터의 소포가 없는 배지에 20-40개의 진드기 타액선을 넣습니다.타액선 샘플을 섭씨 32도에서 24시간 동안 배양하여 세포외 소포가 분비될 수 있도록 합니다. 배양이 끝나면 타액선이 포함된 모든 배지를 1.5밀리리터 미세원심분리 튜브에 넣고 섭씨 4도에서 300배 G에서 10분 동안 원심분리합니다. 상청액을 새로운 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리기 튜브로 옮깁니다.나중에 RNA에 타액선이 들어있는 펠릿을 다시 현탁시키고 사용할 때까지 또는 무기한으로 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 이제 상층액을 섭씨 4도에서 2, 000 배 G에서 10 분 동안 원심 분리하여 세포 파편을 제거하고 상청액을 새로운 1.5 밀리리터 미세 원심 분리 튜브에 피펫팅합니다. 다음으로, 섭씨 4도에서 30 분 동안 10, 000 배 G에서 원심 분리하여 세포 사멸체 및 더 큰 세포 외 소포를 제거하고 상청액을 새로운 1.5 밀리리터 미세 원심 분리 튜브로 옮깁니다.그런 다음 10 밀리리터 주사기에 1 마이크로 미터 나일론 주사기 필터를 조립하고 초 원심 분리기 튜브에 보관하십시오. 그런 다음 샘플을 넣고 주사기에 10 밀리리터의 PBS를 채 웁니다. 상청액을 필터를 통해 튜브로 통과시킵니다.튜브를 여과하고 균형을 잡은 후 70 Ti 로터에 넣고 섭씨 4도에서 18 시간 동안 튜브를 100, 000 배 G로 초 원심 분리합니다. 농축된 세포외 소포는 초원심분리 후에 펠릿을 형성한다. 펠릿을 방해하지 않고 상청액을 제거하고 PBS에 펠릿을 재현탁합니다.피펫팅된 500 마이크로리터의 세포밖 소포를 300 K 원심분리 필터에 넣고 주변 온도에서 10분 동안 8, 000회 G로 원심분리하고 모든 세포밖 소포가 여과될 때까지 이 과정을 반복한다. 마지막으로 멸균된 PBS 400마이크로리터를 컬럼에 넣고 완전히 혼합하여 막에 부착된 세포외 소포를 제거합니다. 그런 다음 샘플을 1.5 밀리리터 DNAase RNAse가없는 튜브에 넣습니다.세포 외 소포의 농도와 크기는 암컷, 수컷 및 님프의 생물학적 복제 사이에 있는 진드기의 성별과 수명 단계에 따라 다양했습니다. 모든 조합된 생물학적 복제에 대해, 유사한 결과가 관찰되었다. 타액선에서 분리 된 작은 RNA의 분석은 리보솜 RNA 및 마이크로 RNA에 해당하는 밴드를 보였다.그러나, 리보솜 RNA는 타액선으로부터 분리 된 소포에 존재하지 않았고, 세포 외 소포로부터 정제 된 microRNA 샘플은 더 많은 분해를 보였다. 농축 후, EV로부터 정제된 마이크로RNA 샘플은 cDNA 라이브러리 합성을 위한 최소한의 분해 및 충분한 마이크로RNA 농도를 나타내었다. cDNA 라이브러리 준비가 얻어진 후 약 150 염기쌍의 예상 밴드 크기는 작은 RNA cDNA 라이브러리를 의미합니다.소포가 없는 준비 중에는 외부 소포 오염을 방지하기 위한 단계를 따르십시오. 웰 플레이트를 준비하는 동안 진드기 마이크로바이옴의 박테리아 오염을 방지하기 위해 항생제를 추가해야 합니다. 이 프로토콜을 사용하여 추출된 마이크로RNA는 마이크로RNA 경로 표적 예측, 억제 및 모방 실험과 같은 마이크로RNA 역할을 검증하기 위한 프로파일링 및 기능 실험에 사용할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells

마우스 침샘에 줄기 세포의 분리

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of ...

연구

생물학

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

에서 세포 외액의 Vampiric 절연<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The genetically tractable model organism C. elegans has provided insights into a myriad of biological questions, enabled by its short generation time, ...

Isolation of Basal Cells and Submucosal Gland Duct Cells from Mouse Trachea

마우스 기관에서 자연적으로 흐르는 것과 셀 및 Submucosal 글 랜드 덕트 세포의 분리

The large airways are directly in contact with the environment and therefore susceptible to injury from toxins and infectious agents that we breath in 1. ...

Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures

침샘 조직 문화의 유전자 변형과 재결합

Branching  morphogenesis occurs during the development of many organs, and the embryonic  mouse submandibular gland (SMG) is a classical model for the ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

인간의 기본 섬유 아세포 배양에서 순진 성인 줄기 세포 분리

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Isolation of Intact, Whole Mouse Mammary Glands for Analysis of Extracellular Matrix Expression and Gland Morphology

세포 외 기질 식 및 선 형태 분석을 그대로, 전체 마우스 유 방 땀 샘의 절연

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal ...

Isolation of Retinal Arterioles for Ex Vivo Cell Physiology Studies

Isolation of Retinal Arterioles for Ex Vivo Cell Physiology Studies

Ex Vivo 세포 생리학 연구에 대 한 망막 Arterioles의 절연

The retina is a highly metabolically active tissue that requires a substantial blood supply. The retinal circulation supports the inner retina, while the ...

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

Extracellular 소포 세포 조절 미디어에서의 Cytometric 분석 흐름

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

예쁜꼬마선충의 정화 및 분석 세포외 소포

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

대장균 및 다른 박테리아로부터의 세포외 소포의 확장 가능한 분리 및 정제

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...