Name: isolation of micrornas from tick ex vivo salivary gland cultures and extracellular vesicles
Uploaded: 2022-04-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles at JoVE.com

Vi setter stor pris på hjelpen fra Cattle Fever tick Laboratory i Edinburg, Texas. Vi vil takke Michael Moses, Jason Tidwell, James Hellums, Cesario Agado og Homer Vasquez. Vi ønsker også å anerkjenne hjelp fra Sarah Sharpton, Elizabeth Lohstroh, Amy Filip, Kelsey Johnson, Kelli Kochcan, Andrew Hillhouse, Charluz Arocho Rosario og Stephanie Guzman Valencia gjennom hele prosjektet. Vi vil gjerne takke Texas A&M Aggie Women in Entomology (AWE) Writing Group for deres hjelp og råd under skrivingen av dette manuskriptet. Følgende reagenser ble levert av Centers for Disease Control and Prevention for distribusjon av BEI Resources, NIAID, NIH: Ixodes scapularis Adult (Live), NR-42510. Kvinne I. scapularis flått ble også mottatt fra Tick Rearing Facility ved Oklahoma State University. Dette prosjektet ble finansiert av Texas A &M University T3: triader for transformasjonstilskudd og samarbeidsavtalen # 58-3094-1-003 av USDA-ARS til AOC.

Alle dyreforsøk ble utført etter dyrebruksprotokoll (AUP # 2020-0026) godkjent av den institusjonelle dyrepleie- og brukskomiteen (AICUC) ved Texas A &M University. Flåttartene Ixodes scapularis og Rhipicephalus (Boophilus) microplus, og New Zealand Male White Rabbits, 42-72 dager gamle, ble brukt i denne studien. I. scapularis ble mottatt fra Center for Disease Control (CDC) og Oklahoma State University, sertifisert som patogenfri. R. microplus ble oppdrettet ved Cattle Fever Tick...

Den nåværende protokollen gir en detaljert metodikk for å trekke ut miRNA fra spyttkjertler og elbiler. Det er imidlertid viktige hensyn, som alle er beskrevet i notatene for hver del av denne protokollen. Kapselen og netting må sikres under flåttfôring for å forhindre at flått slipper ut. Kapselprepareringen og plasseringen er beskrevet i Koga et al.40. Flere replikasjoner av flåttdisseksjonene må gjøres hvis en uegnet prøve kasseres. I tillegg kan flere utfordringer være til stede v...

Flått er ektoparasitter som vektor mange patogener til dyreliv, husdyr, mennesker og deres kjæledyr 1,2. Flåttfôring resulterer i betydelig økonomisk tap ved å forårsake skade på skjul, redusere vekt og melkeproduksjon på grunn av alvorlig anemi, og overføring av potensielt dødelige sykdomsfremkallende patogener 1,3,4,5. Nåværende kontrollpraksis for håndtering av flåttpopulasjoner er fokusert på bruk av akaricider. Likevel har den kontinuerlige fremveksten av akaricidresistens i flått som parasiterer husdyr 5,6, den økte forekomsten av flåttbitt7 og patogenoverføring i boligområde 8,9, ført til et behov for unike flåttkontrollalternativer.
Flåttspyttkjertlene er essensielle organer som sikrer flåttens biologiske suksess. De dannes av forskjellige acinustyper (I, II, III og IV) med ulike fysiologiske funksjoner. Spyttkjertlene er ansvarlige for osmoregulering, både av og på verten, ved å returnere vannoverskudd og jerninnhold til verten via salivasjon 2,10. Type I acini er også involvert i opptak av vann fra atmosfæren ved sekresjon av hygroskopisk spytt10,11. Spytteffektorproteiner, som sement og cystatiner, produseres i sekretoriske celler i type II og III acini10,12. Type I acini påvirker ikke flåttfôring, noe som indikerer at blodmelinntaket ikke utløser morfologiske og fysiologiske endringer i disse acini type13,14. På den annen side aktiveres Acini type II og III under fôring og har svært liten aktivitet før festing. Dermed er fôring nødvendig for å utløse utvidelsen av sekretoriske celler innenfor type II acini og produksjon av bioaktive forbindelser. Type III acini reduseres i størrelse under fôring på grunn av sekresjonen i sekretoriske granulater12.
Spyttkjertlene er også stedet for patogeninfeksjon i krysset og overføringsveien. Under fôring utskiller flått flere forbindelser med farmasøytiske effekter som er nødvendige for vellykket gjennomføring avblodmelet 10,15,16. Disse forbindelsene har antiinflammatoriske, immunsuppressive og vasodilatoriske egenskaper 10,15,17. Nylige studier har vist at ekstracellulære vesikler (EV) avledet fra flåttspyttkjertler har flere av disse forbindelsene, noe som induserer antiinflammatoriske og immunmodulerende effekter 18,19,20. "Ekstracellulære vesikler" er et paraplybegrep som brukes til å beskrive vesikler klassifisert som eksosomer og mikrovesikler basert på deres størrelse og biogenese. Samlet sett er elbiler lipidblester med dobbeltlagsmembraner som er ~ 40 nm-1 μm i størrelse21; Generelt er eksosomer beskrevet som 40-150 nm i størrelse, mens mikrovesikler er mellom 150 nm-1 μm i størrelse 21,22,23. Størrelsen er imidlertid ikke en indikasjon på elbilens biogenesebane22.
Biogenesen av eksosomer starter med sekvensiell invaginering av plasmamembranen. Denne invaginasjonen fører til dannelsen av multivesikulære legemer og resulterer til slutt i deformasjon av vesikulærmembranen ved virkningen av ESCRT-komplekser eller sfingomyelinaser (sMases)24,25. Eksosomene kan enten lyses i lysosomene for å opprettholde cellulær homeostase eller gå ut via vesikulær fusjon til plasmamembranen for å levere cellulære bestanddeler til mottakercellene21,24. På den annen side dannes mikrovesikler ved virkningen av flopasses og flipasses, og endrer konformasjonen av lipider i plasmamembranen26. Elbiler er avgjørende for celle-til-celle-kommunikasjon, og fungerer som et transportsystem for intracellulær last, for eksempel lipider, proteiner, nukleinsyrer og mikroRNA (miRNA)21,27,28. Når de er transportert, leverer disse vesiklene lasten sin inn i cytoplasmaet til mottakercellene, og genererer fenotypiske endringer i mottakscellen22,29. På grunn av viktigheten av ekstracellulære vesikler i kryssfôring og manipulering av vertsimmun- og sårhelingsresponser18,20, presenterer lasten i ekstracellulære vesikler potensielle mål for utvikling av anti-tick-terapi og en unik mekanisme for å forstyrre kryssfôring. Dette inkluderer miRNA i flåttspyttkjertler og spyttkjertelavledede ekstracellulære vesikler.
miRNA er korte ikke-kodende sekvenser, ~18-22 nukleotid (nt) i lengde, som etter transkripsjonelt kan regulere, degradere eller dempe mRNA-sekvenser30,31. Under transkripsjon spaltes pri-miRNA av Dicer (RNA-polymerase III) for å danne en særegen hårnålslignende struktur, og blir et pre-miRNA. Pre-miRNA kuttes igjen av Drosha (RNA-polymerase III) for å danne en moden miRNA-dupleks. Den modne sekvensen blir integrert i det RNA-induserte silencingkomplekset (RISC) komplementært til mRNA-sekvensen, noe som forårsaker translasjonsundertrykkelse eller mRNA-nedbrytning 28,30,32. Under vertsfôring kan miRNA i flåttspytt modulere vertsgenuttrykk for å undertrykke immunresponser og forbedre patogenoverføring 33,34,35,36,37. Selv om det finnes omfattende studier på elbiler og miRNA-er, er deres roller under fôring ved tick-host-grensesnittet fortsatt dårlig forstått. Optimalisering av protokoller som lett kan resultere i isolering og rensing av miRNA av høy kvalitet er avgjørende for å fremme vår kunnskap om disse emnene.
Flere alternativer kan brukes til å isolere elbiler, for eksempel ultrasentrifugering, eksosomutfelling, polymerutfelling, immunoaffinitetskromatografi og størrelsesbaserte eksklusjonsteknikker38. Imidlertid kan disse teknikkene ikke skille mellom eksosomer eller mikrovesikler. Således, som nevnt tidligere, brukes EV som et paraplybegrep når du isolerer elbiler fra forskjellige prøver. Vesiklene isolert i forsøkene beskrevet her representerer en blanding av vesikler avledet fra forskjellige biogeneseveier. Ytterligere rensing av en spesifikk populasjon av ekstracellulære vesikler kan oppnås ved immunprecipitasjon ved bruk av perler belagt med antistoffer mot markører (dvs. eksosomale markører, tumormarkører) som er unike for vesikkelpopulasjonen av interesse39,40. miRNA kan også ekstraheres via forskjellige kommersielt tilgjengelige isolasjonssett 7,41,42.
Målet med dette prosjektet var å utvikle en protokoll som kombinerer vanlige metoder for å isolere elbiler og trekke ut miRNA fra både elbiler og spyttkjertler. Fordi sekresjonen av bioaktive forbindelser aktiveres ved å mate12, bør flått få lov til å mate for å identifisere miRNA som kan være viktige for å manipulere vertens immun- og sårhelingsresponser. Den nåværende protokollen krever et lite antall flått (20 flått) for å isolere elbiler og deres respektive miRNA, sammenlignet med andre tidligere beskrevne studier som krevde 2000 flått43. Videre unngår det forurensning av spyttsekretjoner med pilokarpin44, noe som kan påvirke eksperimenter som studerer effekten av EV og deres miRNA på vertsceller.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m syringe filter</td>
			<td>GenClone</td>
			<td>25-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 &#181;m nylon syringe filter</td>
			<td>Tisch Scientific</td>
			<td>283129028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 inch black adhesive</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B00FQ937NM</td>
			<td>Capsule</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL needeless syringe</td>
			<td>Exelint</td>
			<td>26265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#39; and 5&#39; Adapters</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 mm vannas scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.1523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>337922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-003-CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beads</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5425</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Macron</td>
			<td>UN1888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyverse Discovery Enviornment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://cyverse.org/discovery-environment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sideded carpet tape</td>
			<td>amazon</td>
			<td>&#8206;286373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Tubes, 50 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>FBS-02-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fine forceps</td>
			<td>Excelta</td>
			<td>5-S-SE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foamies, 2 mm</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B004M5QGBQ</td>
			<td>Capsule</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Phoenix Pharmaceuticals manfactured</td>
			<td>193.33165.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ixodes scaplaris</td>
			<td>CDC, Oklahoma State University</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L15C300 medium</td>
			<td>In-lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lipoprotein-cholesterol concentrate</td>
			<td>MPI</td>
			<td>02191476-CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10118-596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRDeep2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/rajewsky-lab/mirdeep2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-MuLV Reverse Transcriptase</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>molecular grade ethanol</td>
			<td>Fischer Bioreagents</td>
			<td>UN1170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multi-well 24 well tissue culture treated plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanopaticle Tracking Analyzer machine</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosep with 300K Omega filter</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>OD3003C33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit v3</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq 500/550 High Output Kit (75 cycles)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XPN 90 Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>Thermofischer Scientific</td>
			<td>ICN19453780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pippettes</td>
			<td>Ependorff</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polycarbonate centrifuge bottle</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen miRNeasy kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAzol lysis reagent</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>Q32880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit kit</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>Q10212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbits</td>
			<td>Charles River</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Universal Primer</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhipicephalus microplus</td>
			<td>Cattle Fever Tick Research Labratoty</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Fischer Bioreagents</td>
			<td>215544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>833280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse free tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse inhibitor</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>11111729</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse/DNAse free water</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Minelute spin column</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217084</td>
			<td>Qiagen miRNeasy kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPE Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217084</td>
			<td>Qiagen miRNeasy kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT Buffer</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-seq kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT Forward Primer</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-seq kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTE Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217084</td>
			<td>Qiagen miRNeasy kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6014-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall ST16</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>75004380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized Gauze sponges</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>2187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized PBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>RNBK0694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>streptomycin</td>
			<td>thermofischer Scientific</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TapeStation</td>
			<td>Aligent</td>
			<td>G2991BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tear Mender Instant Fabric and Leather Adhesive</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>7.42836E+11</td>
			<td>Capsule</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Adhesive</td>
			<td>3M VetBond</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triple Antibiotics</td>
			<td>dechra</td>
			<td>17033-122-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptose phosphate broth</td>
			<td>BD</td>
			<td>BD 260300</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of micrornas from tick ex vivo salivary gland cultures and extracellular vesicles

Ticks er viktige ektoparasitter som kan vektorere flere patogener. Spyttkjertlene i flått er avgjørende for fôring, da spyttet inneholder mange effektorer med farmasøytiske egenskaper som kan redusere vertsimmunresponser og forbedre patogenoverføringen. En gruppe slike effektorer er mikroRNA (miRNA). miRNA er korte ikke-kodende sekvenser som regulerer vertsgenuttrykk ved tick-host-grensesnittet og i flåttens organer. Disse små RNA-ene transporteres i flåttspytt via ekstracellulære vesikler (EV), som betjener inter- og intracellulær kommunikasjon. Vesikler som inneholder miRNA har blitt identifisert i spytt av flått. Imidlertid er lite kjent om rollene og profilene til miRNA i flåttspyttblærene og kjertlene. Videre krever studiet av vesikler og miRNA i flåttspytt kjedelige prosedyrer for å samle flåttspytt. Denne protokollen tar sikte på å utvikle og validere en metode for å isolere miRNA fra rensede ekstracellulære vesikler produsert av ex vivo organkulturer. Materialene og metodikken som trengs for å trekke ut miRNA fra ekstracellulære vesikler og flåttspyttkjertler er beskrevet her.

Den nåværende protokollen gir en detaljert metodikk for å trekke ut miRNA fra spyttkjertler og elbiler. Ifølge resultatene er denne protokollen effektiv for isolering av miRNA fra voksne av to forskjellige flåttarter, I. scapularis og R. microplus, og kan potensielt også brukes i andre flåttarter. Elbilkonsentrasjonen (partikler/ml) ble målt via NTA. For R. microplus inneholdt hvert kjønn og livsstadium tre biologiske replikasjoner målt i tre tekniske replikasjoner. Utvalgene...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles at JoVE.com

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

Denne protokollen beskriver isoleringen av mikroRNA fra flåttspyttkjertler og rensede ekstracellulære vesikler. Dette er en universell prosedyre som kombinerer ofte brukte reagenser og forsyninger. Metoden tillater også bruk av et lite antall flått, noe som resulterer i mikroRNA av høy kvalitet som lett kan sekvenseres.

Isolering av mikroRNA fra Tick Ex Vivo spyttkjertelkulturer og ekstracellulære vesikler

Ticks are important ectoparasites that can vector multiple pathogens. The salivary glands of ticks are essential for feeding as their saliva contains many ...

Denne protokollen lar oss bruke et redusert antall flått som reduserer kostnadene ved kolonivedlikehold og reduserer antall ryggvirvler som trengs for flåttfôring. Denne protokollen krever omtrent 20 flått. Den største fordelen bortsett fra å bruke en liten prøvestørrelse er imidlertid at denne protokollen kan brukes på flere flåttarter og forskjellige livsstadier.Bortsett fra kryssdisseksjoner eller applikasjonen mot vertsparasittinteraksjoner, effekten av patogeninfeksjon på mikroRNA-sekresjon og effekten av fysiologiske endringer på mikroRNA utskilt av flått. Til å begynne med, forbered vesikkelfrie medier ved å tilsette føtalt bovint serum, tryptosefosfatbuljong, 10% lipoproteinkolesterolkonsentrat, 5% natriumbikarbonat, HEPES og L15C300 medium i en 26,3 milliliter polykarbonatsentrifugeflaske og juster volumet etter behov. Nå ultracentrifuge mediet ved 100.000 ganger G ved fire grader Celsius i 18 timer.Fjern supernatanten forsiktig uten å forstyrre pelleten og overfør supernatanten til et friskt sentrifugerør. Ultracentrifuge røret igjen. Ta supernatanten og pass den gjennom et 0,22 mikrometer filter for å fjerne forurensninger.Pipette supernatanten i et 50 milliliter sentrifugerør og oppbevar det ved minus 20 grader Celsius til det kreves eller opptil tre år. Tilsett en passende mengde antibiotika til 500 mikroliter av det vesikkelfrie mediet i hver brønn i en 24-brønns kulturplate. Legg nå PBS med rifampicin til brønnene som ikke inneholder vesikkelfritt medium for å forhindre bakterievekst.Plasser flåttene på et glassglass med dobbeltsidig teppebånd under et dissekeringsmikroskop. Før disseksjon, legg PBS som inneholder rifampicin til krysset og bruk fire millimeter Vannas saks, gjør et snitt på omtrent en millimeter på siden av hver kvinne. Fjern nå tippens dorsale side og spyttkjertler, og legg deretter 20 til 40 flått spyttkjertler i 500 mikroliter vesikkelfritt medium tilsatt til en enkelt brønn i en 24-brønns vevskultur behandlet plate.Inkuber spyttkjertelprøvene ved 32 grader Celsius i 24 timer for å tillate sekresjon av ekstracellulære vesikler. På slutten av inkubasjonen, pipette hele mediet som inneholder spyttkjertlene i et 1,5 milliliter mikrosentrifugerør og sentrifuge ved 300 ganger G ved fire grader Celsius i 10 minutter. Overfør supernatanten til et nytt 1,5 milliliter mikrosentrifugerør.Resuspender pelleten som inneholder spyttkjertlene i RNA senere og lagre ved minus 80 grader Celsius til den brukes eller på ubestemt tid. Fjern nå det cellulære rusk ved å sentrifugere supernatanten ved 2.000 ganger G ved fire grader Celsius i 10 minutter og pipette supernatanten til et nytt 1,5 milliliter mikrosentrifugerør. Deretter sentrifuger ved 10.000 ganger G i 30 minutter ved fire grader Celsius for å fjerne apoptotiske legemer og større ekstracellulære vesikler og overføre supernatanten til et friskt 1, 5 milliliter mikrosentrifugerør.Monter deretter et en mikrometer nylonsprøytefilter på en 10 milliliter sprøyte og hold den på et ultracentrifugerør. Tilsett deretter prøven og fyll sprøyten med 10 milliliter PBS. Før supernatanten gjennom filteret inn i røret.Etter filtrering og balansering av rørene, plasser dem i en 70 Ti rotor og ultrasentrifuger rørene ved 100.000 ganger G i 18 timer ved fire grader Celsius. De konsentrerte ekstracellulære vesiklene danner en pellet etter ultracentrifugering. Fjern supernatanten uten å forstyrre pelleten og resuspender pelleten i PBS.Pipette 500 mikroliter av den ekstracellulære vesikkelen til et 300 K sentrifugalfilter og sentrifuge ved 8.000 ganger G i 10 minutter ved omgivelsestemperatur og gjenta denne prosedyren til alle ekstracellulære vesikler er filtrert. Til slutt tilsett 400 mikroliter sterilisert PBS til kolonnen og bland grundig for å fjerne ekstracellulære vesikler festet til membranen. Sett deretter prøven i et 1,5 milliliter DNAase RNAse fritt rør.Konsentrasjonen og størrelsen på ekstracellulære vesikler varierte avhengig av kjønn og livsstadium av flåttene mellom de biologiske replikasjonene for kvinner, menn og nymfer. For alle kombinerte biologiske replikasjoner ble lignende resultater observert. Analyse av små RNA isolert fra spyttkjertelen viste bånd tilsvarende ribosomalt RNA og mikroRNA.Imidlertid var de ribosomale RNAene fraværende i vesiklene isolert fra spyttkjertlene, og mikroRNA-prøver renset fra ekstracellulære vesikler viste mer nedbrytning. Etter anrikning viste mikroRNA-prøvene renset fra elbiler minimal nedbrytning og tilstrekkelig mikroRNA-konsentrasjon for cDNA-biblioteksyntese. Den forventede båndstørrelsen på ca. 150 basepar etter at cDNA-bibliotekspreparatet ble oppnådd, betyr små RNA cDNA-biblioteker.Under vesikkelfri forberedelse, sørg for å følge trinnene for å forhindre ekstern vesikkelforurensning. Under klargjøring av brønnplater, sørg for å legge til antibiotika for å forhindre bakteriell forurensning fra kryssmikrobiomet. MikroRNA-ene ekstrahert ved hjelp av denne protokollen kan brukes til profilering og funksjonelle eksperimenter for å validere mikroRNA-roller som å forutsi mikroRNA-veimål, inhibering og etterligningseksperimenter.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of ...

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

The genetically tractable model organism C. elegans has provided insights into a myriad of biological questions, enabled by its short generation time, ...

Isolation of Basal Cells and Submucosal Gland Duct Cells from Mouse Trachea

Isolering av basal celler og submukøst Gland kanalsystem celler fra mus Trachea

The large airways are directly in contact with the environment and therefore susceptible to injury from toxins and infectious agents that we breath in 1. ...

Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures

Genmodifisering og Rekombinasjon av spyttkjertel Organ kulturer

Branching  morphogenesis occurs during the development of many organs, and the embryonic  mouse submandibular gland (SMG) is a classical model for the ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

Naive Adult Stem Cells Isolasjon fra primære humane fibroblastkulturer

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Isolation of Intact, Whole Mouse Mammary Glands for Analysis of Extracellular Matrix Expression and Gland Morphology

Isolering av intakt, hele musen brystkjertlene for analyse av ekstracellulær Matrix uttrykk og kjertel morfologi

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal ...

Isolation of Retinal Arterioles for Ex Vivo Cell Physiology Studies

Isolation of Retinal Arterioles for Ex Vivo Cell Physiology Studies

Isolering av netthinnen arterioler for Ex Vivo celle fysiologi studier

The retina is a highly metabolically active tissue that requires a substantial blood supply. The retinal circulation supports the inner retina, while the ...

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

Flow Cytometric analyse av ekstracellulære blemmer fra celle-conditioned Media

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Rensing og analyse av Caenorhabditis elegans Ekstracellulære vesikler

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Skalerbar isolasjon og rensing av ekstracellulære vesikler fra Escherichia coli og andre bakterier

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...