Name: isolation of micrornas from tick ex vivo salivary gland cultures and extracellular vesicles
Uploaded: 2022-04-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles at JoVE.com

Agradecemos muito a ajuda do Laboratório de Carrapatos da Febre do Gado em Edinburg, Texas. Gostaríamos de agradecer a Michael Moses, Jason Tidwell, James Hellums, Cesario Agado e Homer Vasquez. Também gostaríamos de reconhecer a ajuda de Sarah Sharpton, Elizabeth Lohstroh, Amy Filip, Kelsey Johnson, Kelli Kochcan, Andrew Hillhouse, Charluz Arocho Rosario e Stephanie Guzman Valencia durante todo o projeto. Gostaríamos de agradecer ao Texas A&M Aggie Women in Entomology (AWE) Writing Group por sua ajuda e conselhos durante a escrita deste manuscrito. Os seguintes reagentes foram fornecidos pelos Centros de Controle e Prevenção de Doenças para distribuição pela BEI Resources, NIAID, NIH: Ixodes scapularis Adult (Live), NR-42510. Carrapatos femininos I. scapularis também foram recebidos do Tick Rearing Facility na Oklahoma State University. Este projeto foi financiado pela Texas A&M University T3: tríades para subvenção de transformação e o acordo de cooperação #58-3094-1-003 pelo USDA-ARS para a AOC.

Todos os experimentos em animais foram realizados seguindo o protocolo de uso de animais (AUP#2020-0026) aprovado pelo comitê institucional de cuidados e uso de animais (AICUC) da Texas A&M University. As espécies de carrapatos, Ixodes scapularis e Rhipicephalus (Boophilus) microplus, e Coelhinhos Brancos Machos da Nova Zelândia, de 42 a 72 dias de idade, foram utilizadas para o presente estudo. I. scapularis foi recebido do Center for Disease Control (CDC) e da Oklahoma State University, ce...

O protocolo atual fornece uma metodologia detalhada para extrair miRNA de glândulas salivares e EVs. No entanto, há considerações importantes, todas detalhadas nas notas de cada seção deste protocolo. A cápsula e a rede de malha devem ser fixadas durante a alimentação do carrapato para evitar que os carrapatos escapem. A preparação e colocação da cápsula estão descritas em Koga et al.40. Várias réplicas das dissecções de carrapato precisam ser feitas se uma amostra inadequada fo...

Carrapatos são ectoparasitas que vetores muitos patógenos para a vida selvagem, pecuária, humanos e seus animaisde estimação 1,2. A alimentação por carrapatos resulta em perda econômica significativa, causando danos à pele, reduzindo a produção de peso e leite devido à anemia grave, e a transmissão de patógenos potencialmente mortais causadores de doenças 1,3,4,5. As práticas atuais de controle para o manejo das populações de carrapatos estão focadas no uso de acaricídios. No entanto, o surgimento contínuo da resistência ao acaricídio em carrapatos que parasitam a pecuária 5,6, o aumento da incidência de picadas de carrapato7 e a transmissão de patógenos em áreas residenciais 8,9, levaram à necessidade de alternativas únicas de controle de carrapatos.
As glândulas salivares do carrapato são órgãos essenciais que garantem o sucesso biológico de um carrapato. São formadas por diferentes tipos de acinus (I, II, III e IV) com várias funções fisiológicas. As glândulas salivares são responsáveis pela osmoregulação, tanto fora quanto no hospedeiro, devolvendo o excesso de água e o conteúdo de ferro ao hospedeiro via salivação 2,10. Tipo I acini também estão envolvidos na captação de água da atmosfera pela secreção da saliva higroscópica10,11. Proteínas efeitos salivares, como cimento e cistatinas, são produzidas dentro de células secretary nos tipos II e III acini10,12. O acini tipo I não afeta a alimentação do carrapato, indicando que a ingestão de farinha de sangue não desencadeia alterações morfológicas e fisiológicas nestes acini tipo13,14. Por outro lado, acini tipo II e III são ativados durante a alimentação e apresentam muito pouca atividade pré-apego. Assim, a alimentação é necessária para desencadear o alargamento das células secretas dentro do acini tipo II e a produção de compostos bioativos. O acini tipo III é reduzido em tamanho durante a alimentação devido à secreção dentro dos grânulos secretos12.
As glândulas salivares também são o local da infecção por patógenos no carrapato e na rota de transmissão. Durante a alimentação, os carrapatos secretam vários compostos com efeitos farmacêuticos que são necessários para a conclusão bem sucedida da farinha de sangue 10,15,16. Esses compostos possuem propriedades anti-inflamatórias, imunossupressores e vasodilatações 10,15,17. Estudos recentes têm demonstrado que vesículas extracelulares (EVs) derivadas das glândulas salivares de carrapato abrigam vários desses compostos, induzindo efeitos anti-inflamatórios e imuno-modulatórios 18,19,20. "Vesículas extracelulares" é um termo de guarda-chuva usado para descrever vesículas classificadas como exosóis e microvesculas com base em seu tamanho e biogênese. No geral, os EVs são blebs lipídes com membranas bicamadas que são ~40 nm-1 μm no tamanho21; geralmente, exossomos são descritos como sendo de 40-150 nm de tamanho, enquanto microvesículos estão entre 150 nm-1 μm no tamanho 21,22,23. No entanto, o tamanho não é indicativo da via biogênese dos EVs22.
A biogênese dos exosóis começa com a invaginação sequencial da membrana plasmática. Essa invaginação leva à formação de corpos multivesiculares e, finalmente, resulta na deformação da membrana vesicular pela ação de complexos ESCRT ou sphingomyelinases (sMases)24,25. Os exossomos podem ser lisosomes dentro dos lisosóis para manter a homeostase celular ou sair via fusão vesicular à membrana plasmática para entregar constituintes celulares às células receptoras21,24. Por outro lado, os microvesículos são formados pela ação de flopasses e flipasses, alterando a conformação de lipídios na membrana plasmática26. Os EVs são essenciais para a comunicação célula-celular, servindo como um sistema de transporte para carga intracelular, como lipídios, proteínas, ácidos nucleicos e microRNAs (miRNAs)21,27,28. Uma vez transportadas, essas vesículas entregam sua carga para o citoplasma das células receptoras, gerando alterações fenotípicas na célula receptora22,29. Devido à importância das vesículas extracelulares na alimentação do carrapato e à manipulação das respostas imunes e cicatrizanteshospedeiras 18,20, a carga dentro de vesículas extracelulares apresenta potenciais alvos para o desenvolvimento de terapêutica anti-carrapato e um mecanismo único para interromper a alimentação de carrapatos. Isso inclui miRNAs dentro das glândulas salivares de carrapato e vesículas extracelulares derivadas da glândula salivar.
miRNAs são sequências curtas de não codificação, ~18-22 nucleotídeos (nt) de comprimento, que podem regular, degradar ou silenciar sequências mRNA30,31. Durante a transcrição, os pri-miRNAs são cortados por Dicer (RNA polymerase III) para formar uma estrutura distinta semelhante ao grampo de cabelo, tornando-se um pré-miRNA. O pré-miRNA é cortado mais uma vez por Drosha (RNA polymerase III) para formar um duplex miRNA maduro. A sequência madura torna-se integrada ao complexo de silenciamento induzido pelo RNA (RISC) complementar à sequência mRNA, causando repressão de tradução ou degradação de mRNA 28,30,32. Durante a alimentação hospedeira, miRNAs dentro da saliva de carrapato podem modular a expressão genética hospedeira para suprimir respostas imunes e melhorar a transmissão de patógenos 33,34,35,36,37. Embora existam estudos extensivos sobre EVs e miRNAs, seus papéis durante a alimentação na interface tick-host ainda são mal compreendidos. Otimizar protocolos que podem facilmente resultar no isolamento e purificação de miRNAs de alta qualidade é crucial para o avanço de nossos conhecimentos sobre esses tópicos.
Várias opções podem ser utilizadas para isolar EVs, como ultracentrifugação, precipitação exósmida, precipitação de polímeros, cromatografia imunoaffinity e técnicas de exclusão baseadas em tamanho38. No entanto, essas técnicas não podem distinguir entre exosósmos ou microvesculas. Assim, como mencionado anteriormente, o EV é usado como um termo guarda-chuva ao isolar EVs de diferentes amostras. As vesículas isoladas nos experimentos aqui descritos representam uma mistura de vesículas derivadas de diferentes vias de biogênese. A purificação de uma população específica de vesículas extracelulares pode ser alcançada por imunoprecipitação usando contas revestidas com anticorpos contra marcadores (ou seja, marcadores exosômicos, marcadores tumorais) exclusivos da população vesícula de interesse39,40. miRNAs também podem ser extraídos através de diferentes kits de isolamento disponíveis comercialmente 7,41,42.
O objetivo deste projeto foi desenvolver um protocolo que combina métodos comumente aplicados para isolar EVs e extrair miRNA de ambos os EVs e glândulas salivares fed-tick. Como a secreção de compostos bioativos é ativada pela alimentação12, os carrapatos devem ser autorizados a se alimentar para identificar miRNAs que podem ser importantes para manipular as respostas imunes do hospedeiro e curar feridas. O presente protocolo requer um pequeno número de carrapatos (20 carrapatos) para isolar EVs e seus respectivos miRNAs, em comparação com outros estudos descritos anteriormente que exigiram 2000 carrapatos43. Além disso, evita a contaminação de secreções salivares com pilocarpina44, o que poderia influenciar experimentos que estudam o efeito de EVs e seus miRNAs em células hospedeiras.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m syringe filter</td>
			<td>GenClone</td>
			<td>25-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 &#181;m nylon syringe filter</td>
			<td>Tisch Scientific</td>
			<td>283129028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 inch black adhesive</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B00FQ937NM</td>
			<td>Capsule</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL needeless syringe</td>
			<td>Exelint</td>
			<td>26265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#39; and 5&#39; Adapters</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 mm vannas scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.1523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>337922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-003-CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beads</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5425</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Macron</td>
			<td>UN1888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyverse Discovery Enviornment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://cyverse.org/discovery-environment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sideded carpet tape</td>
			<td>amazon</td>
			<td>&#8206;286373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Tubes, 50 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>FBS-02-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fine forceps</td>
			<td>Excelta</td>
			<td>5-S-SE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foamies, 2 mm</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B004M5QGBQ</td>
			<td>Capsule</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Phoenix Pharmaceuticals manfactured</td>
			<td>193.33165.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ixodes scaplaris</td>
			<td>CDC, Oklahoma State University</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L15C300 medium</td>
			<td>In-lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lipoprotein-cholesterol concentrate</td>
			<td>MPI</td>
			<td>02191476-CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10118-596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRDeep2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/rajewsky-lab/mirdeep2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-MuLV Reverse Transcriptase</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>molecular grade ethanol</td>
			<td>Fischer Bioreagents</td>
			<td>UN1170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multi-well 24 well tissue culture treated plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanopaticle Tracking Analyzer machine</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosep with 300K Omega filter</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>OD3003C33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit v3</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq 500/550 High Output Kit (75 cycles)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XPN 90 Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>Thermofischer Scientific</td>
			<td>ICN19453780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pippettes</td>
			<td>Ependorff</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polycarbonate centrifuge bottle</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen miRNeasy kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAzol lysis reagent</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>Q32880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit kit</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>Q10212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbits</td>
			<td>Charles River</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Universal Primer</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhipicephalus microplus</td>
			<td>Cattle Fever Tick Research Labratoty</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Fischer Bioreagents</td>
			<td>215544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>833280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse free tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse inhibitor</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>11111729</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse/DNAse free water</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Minelute spin column</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217084</td>
			<td>Qiagen miRNeasy kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPE Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217084</td>
			<td>Qiagen miRNeasy kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT Buffer</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-seq kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT Forward Primer</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-seq kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTE Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217084</td>
			<td>Qiagen miRNeasy kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6014-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall ST16</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>75004380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized Gauze sponges</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>2187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized PBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>RNBK0694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>streptomycin</td>
			<td>thermofischer Scientific</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TapeStation</td>
			<td>Aligent</td>
			<td>G2991BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tear Mender Instant Fabric and Leather Adhesive</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>7.42836E+11</td>
			<td>Capsule</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Adhesive</td>
			<td>3M VetBond</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triple Antibiotics</td>
			<td>dechra</td>
			<td>17033-122-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptose phosphate broth</td>
			<td>BD</td>
			<td>BD 260300</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of micrornas from tick ex vivo salivary gland cultures and extracellular vesicles

Carrapatos são ectoparasitas importantes que podem vetor múltiplos patógenos. As glândulas salivares dos carrapatos são essenciais para a alimentação, pois sua saliva contém muitos efeitos com propriedades farmacêuticas que podem diminuir as respostas imunológicas hospedeiras e melhorar a transmissão de patógenos. Um grupo desses efeitos são microRNAs (miRNAs). miRNAs são sequências curtas de não codificação que regulam a expressão genética do hospedeiro na interface tick-host e dentro dos órgãos do carrapato. Estes pequenos RNAs são transportados na saliva de carrapato através de vesículas extracelulares (EVs), que servem comunicação inter e intracelular. Vesículas contendo miRNAs foram identificadas na saliva de carrapatos. No entanto, pouco se sabe sobre os papéis e perfis dos miRNAs em vesículas salivares de carrapato e glândulas. Além disso, o estudo de vesículas e miRNAs na saliva de carrapato requer procedimentos tediosos para coletar saliva de carrapato. Este protocolo visa desenvolver e validar um método de isolação de miRNAs a partir de vesículas extracelulares purificadas produzidas por culturas de órgãos ex vivo . Os materiais e a metodologia necessários para extrair miRNAs de vesículas extracelulares e glândulas salivares de carrapato são descritos aqui.

O presente protocolo fornece uma metodologia detalhada para extrair miRNAs de glândulas salivares e EVs. De acordo com os resultados, este protocolo é eficaz para o isolamento do miRNA de adultos de duas espécies diferentes de carrapatos, I. scapularis e R. microplus, e pode potencialmente ser usado em outras espécies de carrapatos também. A concentração de EVs (partículas/mL) foi medida via NTA. Para R. microplus, cada fase de gênero e vida continha três réplicas biológica...

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Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

O presente protocolo descreve o isolamento de microRNAs de glândulas salivares de carrapatos e vesículas extracelulares purificadas. Este é um procedimento universal que combina reagentes e suprimentos comumente usados. O método também permite o uso de um pequeno número de carrapatos, resultando em microRNAs de qualidade que podem ser facilmente sequenciadas.

Isolamento de microRNAs de Tick Ex Vivo Culturas de Glândulas Salivares e Vesículos Extracelulares

Ticks are important ectoparasites that can vector multiple pathogens. The salivary glands of ticks are essential for feeding as their saliva contains many ...

Este protocolo nos permite usar um número reduzido de carrapatos que reduz o custo de manutenção da colônia e diminui o número de animais vertebrados necessários para a alimentação de carrapatos. Este protocolo requer aproximadamente 20 carrapatos. No entanto, a principal vantagem além de usar um pequeno tamanho amostral é que este protocolo pode ser aplicado a múltiplas espécies de carrapatos e diferentes estágios de vida.Além das dissecções de carrapatos ou da aplicação para interações hospedeira-parasita, o efeito da infecção por patógenos na secreção de microRNA e o efeito das alterações fisiológicas no microRNA secretados por carrapatos. Para começar, prepare a mídia sem vesícula adicionando soro bovino fetal, broto de fosfato de tryptose, concentrado de colesterol de lipoproteína de 10%, 5% de bicarbonato de sódio, HEPES e meio L15C300 em uma garrafa de centrífuga de policarbonato de 26,3 mililitros e ajuste o volume conforme necessário. Agora ultracentrize o meio a 100.000 vezes G a quatro graus Celsius por 18 horas.Remova cuidadosamente o supernatante sem perturbar a pelota e transfira o supernatante para um tubo de centrífuga fresco. Ultracentrizar o tubo mais uma vez. Pegue o supernascer e passe por um filtro de 0,22 micrômetro para remover contaminantes.Pipeta o supernante em um tubo de centrífuga de 50 mililitros e armazene-o a menos 20 graus Celsius até que seja necessário ou até três anos. Adicione uma quantidade apropriada de antibióticos a 500 microliters do meio livre de vesículas em cada poço de uma placa de cultura de 24 poços. Agora, adicione PBS com rifampicina aos poços que não contêm meio livre de vesículas para evitar o crescimento bacteriano.Coloque os carrapatos em um slide de vidro com fita adesiva de dois lados sob um microscópio dissecando. Antes da dissecção, adicione PBS contendo rifampicina ao carrapato e usando uma tesoura vannas de quatro milímetros, faça uma incisão de aproximadamente um milímetro ao lado de cada fêmea. Agora, remova o lado dorsal do carrapato e as glândulas salivares, em seguida, coloque 20 a 40 glândulas salivares de carrapato em 500 microliters de meio livre de vesícula adicionado a um único poço em uma placa tratada de cultura tecidual de 24 poços.Incubar as amostras da glândula salivar a 32 graus Celsius durante 24 horas para permitir a secreção das vesículas extracelulares. No final da incubação, pipeta todo o meio contendo as glândulas salivares em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro e centrífuga a 300 vezes G a quatro graus Celsius por 10 minutos. Transfira o supernatante para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.Resuspenha a pelota contendo as glândulas salivares no RNA mais tarde e armazene a menos 80 graus Celsius até ser usada ou indefinidamente. Agora, remova os detritos celulares centrifugando o supernadante a 2.000 vezes G a 4 graus Celsius por 10 minutos e pipeta o supernascido em um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Em seguida, centrífuga a 10.000 vezes G por 30 minutos a quatro graus Celsius para remover corpos apoptóticos e vesículas extracelulares maiores e transferir o supernatante para um tubo fresco de microcentrífugo de 1,5 mililitro.Em seguida, monte um filtro de seringa de nylon de um micrômetro em uma seringa de 10 mililitros e mantenha-a em um tubo ultracentrífuga. Em seguida, adicione a amostra e encha a seringa com 10 mililitros de PBS. Passe o sobrenatante através do filtro para dentro do tubo.Depois de filtrar e equilibrar os tubos, coloque-os em um rotor de 70 Ti e ultracentrize os tubos a 100.000 vezes G durante 18 horas a quatro graus Celsius. As vesículas extracelulares concentradas formam uma pelota após a ultracentrifugação. Remova o supernatante sem perturbar a pelota e resuspense a pelota na PBS.Pipeta 500 microliters da vesícula extracelular em um filtro centrífugo de 300 K e centrífuga a 8.000 vezes G por 10 minutos a temperatura ambiente e repita este procedimento até que todas as vesículas extracelulares sejam filtradas. Por fim, adicione 400 microliters de PBS esterilizados à coluna e misture bem para remover vesículas extracelulares ligadas à membrana. Em seguida, coloque a amostra em um tubo livre DNAase RNAse de 1,5 mililitro.A concentração e o tamanho das vesículas extracelulares variaram dependendo do sexo e da fase de vida dos carrapatos entre as réplicas biológicas para fêmeas, machos e ninfas. Para todas as réplicas biológicas combinadas, foram observados resultados semelhantes. A análise de pequenas RNAs isoladas da glândula salivar mostrou bandas correspondentes ao RNA ribossômico e microRNAs.No entanto, os RNAs ribossômicos estavam ausentes nas vesículas isoladas das glândulas salivares, e amostras de microRNA purificadas de vesículas extracelulares mostraram mais degradação. Após o enriquecimento, as amostras de microRNA purificadas dos EVs mostraram degradação mínima e concentração de microRNA suficiente para síntese da biblioteca cDNA. O tamanho esperado da banda de aproximadamente 150 pares de base após a preparação da biblioteca cDNA significa pequenas bibliotecas cDNA RNA.Durante a preparação sem vesículas, certifique-se de seguir os passos para evitar a contaminação externa da vesícula. Durante a preparação da placa, certifique-se de adicionar antibióticos para evitar a contaminação bacteriana do microbioma do carrapato. As microRNAs extraídas usando este protocolo podem ser usadas para perfis e experimentos funcionais para validar funções de microRNA, como prever alvos de via microRNA, inibição e experimentos de imitação.

Research

JoVE Journal

Biology

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Isolamento de Células-Tronco do rato das Glândulas Salivares

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Biologia

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The genetically tractable model organism C. elegans has provided insights into a myriad of biological questions, enabled by its short generation time, ...

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Isolamento de células basais e células Duct submucosa Glândulas de Rato Traquéia

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NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

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