Name: isolation of micrornas from tick ex vivo salivary gland cultures and extracellular vesicles
Uploaded: 2022-04-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles at JoVE.com

Мы очень признательны за помощь лаборатории клещей лихорадки крупного рогатого скота в Эдинбурге, штат Техас. Мы хотели бы поблагодарить Майкла Мозеса, Джейсона Тидуэлла, Джеймса Хеллумса, Сезарио Агадо и Гомера Васкеса. Мы также хотели бы отметить помощь Сары Шарптон, Элизабет Лостро, Эми Филип, Келси Джонсон, Келли Кохкан, Эндрю Хиллхауса, Шарлуса Арочо Росарио и Стефани Гусман Валенсия на протяжении всего проекта. Мы хотели бы поблагодарить Texas A&M Aggie Women in Entomology (AWE) Writing Group за помощь и советы во время написания этой рукописи. Следующие реагенты были предоставлены Центрами по контролю и профилактике заболеваний для распространения BEI Resources, NIAID, NIH: Ixodes scapularis Adult (Live), NR-42510. Самки клещей I. scapularis также были получены из Центра выращивания клещей в Университете штата Оклахома. Этот проект был профинансирован Техасским университетом A & M T3: триады для гранта на трансформацию и соглашение о сотрудничестве No 58-3094-1-003 USDA-ARS для AOC.

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с протоколом использования животных (AUP# 2020-0026), одобренным институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (AICUC) в Техасском университете A & M. Для настоящего исследования использовались виды клещей, Ixodes scapula...

Текущий протокол предоставляет подробную методологию извлечения миРНК из слюнных желез и EV. Однако существуют важные соображения, все из которых подробно изложены в примечаниях к каждому разделу этого протокола. Капсула и сетка должны быть закреплены во время кормления клещей, чтобы ?...

Клещи — это эктопаразиты, которые переносят многие патогены в дикую природу, домашний скот, людей и их домашних животных 1,2. Кормление клещей приводит к значительным экономическим потерям, вызывая повреждение шкуры, снижая вес и производство молока из-за тяжелой анемии и передачу потенциально смертельных болезнетворных патогенов 1,3,4,5. Современные методы контроля для управления популяциями клещей сосредоточены на использовании акарицидов. Тем не менее, непрерывное появление устойчивости к акарицидам у клещей, паразитирующих на поголовье 5,6, увеличение числа укусов клещей7 и передача патогенов в жилых районах 8,9 привели к необходимости уникальных альтернатив борьбы с клещами.
Клещевые слюнные железы являются важными органами, которые обеспечивают биологический успех клеща. Они образованы различными типами ацинуса (I, II, III и IV) с различными физиологическими функциями. Слюнные железы отвечают за осморегуляцию, как вне, так и на хозяине, возвращая избыток воды и содержание железа хозяину через слюноотделение 2,10. Ацины I типа также участвуют в поглощении воды из атмосферы путем секреции гигроскопичной слюны10,11. Слюнные эффекторные белки, такие как цемент и цистатины, продуцируются в секреторных клетках в ацинусах II и III типа10,12. Ацины I типа не влияют на кормление клещей, что указывает на то, что прием в кровь не вызывает морфологических и физиологических изменений в этих ацинах типа13,14. С другой стороны, Acini типа II и III активируются во время кормления и проявляют очень небольшую активность до прикрепления. Таким образом, кормление необходимо для того, чтобы вызвать увеличение секреторных клеток в пределах ацинов II типа и выработку биологически активных соединений. Ацины III типа уменьшаются в размерах во время кормления из-за секреции внутри секреторных гранул12.
Слюнные железы также являются местом патогенной инфекции в клеще и пути передачи. Во время кормления клещи выделяют несколько соединений с фармацевтическим эффектом, которые необходимы для успешного завершения кровяноймуки 10,15,16. Эти соединения обладают противовоспалительными, иммуносупрессивными и сосудорасширяющими свойствами 10,15,17. Недавние исследования показали, что внеклеточные везикулы (EV), полученные из клещевых слюнных желез, содержат несколько из этих соединений, вызывая противовоспалительные и иммуномодулирующие эффекты 18,19,20. «Внеклеточные везикулы» - это общий термин, используемый для описания везикул, классифицируемых как экзосомы и микровезикулы на основе их размера и биогенеза. В целом, EV представляют собой липидные блебы с двухслойными мембранами, которые составляют ~ 40 нм-1 мкм в размере21; как правило, экзосомы описываются как имеющие размер 40-150 нм, тогда как микровезикулы имеют размер от 150 нм до 1 мкм 21,22,23. Однако размер не указывает на путь биогенеза EV22.
Биогенез экзосом начинается с последовательной инвагинации плазматической мембраны. Эта инвагинация приводит к образованию мультивезикулярных тел и в конечном итоге приводит к деформации везикулярной мембраны под действием комплексов ESCRT или сфингомиелиназ (sMases)24,25. Экзосомы могут либо лизироваться внутри лизосом для поддержания клеточного гомеостаза, либо выходить через везикулярное слияние с плазматической мембраной для доставки клеточных компонентов к клеткам-реципиентам21,24. С другой стороны, микровезикулы образуются под действием флоапсов и флипсов, изменяя конформацию липидов в плазматической мембране26. EV необходимы для межклеточной связи, служа транспортной системой для внутриклеточных грузов, таких как липиды, белки, нуклеиновые кислоты и микроРНК (миРНК)21,27,28. После транспортировки эти везикулы доставляют свой груз в цитоплазму клеток-реципиентов, вызывая фенотипические изменения в принимающей клетке22,29. Из-за важности внеклеточных везикул в кормлении клещей и манипулирования иммунными и ранозаживляющими реакциями хозяина18,20, груз во внеклеточных везикулах представляет собой потенциальные цели для разработки антиклещевых терапевтических средств и уникального механизма для нарушения кормления клещей. Это включает в себя микроРНК в клещевых слюнных железах и внеклеточных везикулах, полученных из слюнных желез.
миРНК представляют собой короткие некодирующие последовательности, длиной ~ 18-22 нуклеотида (nt), которые могут посттранскрипционно регулировать, ухудшать или заглушать последовательности мРНК30,31. Во время транскрипции примиРНК расщепляются Dicer (РНК-полимераза III) с образованием отличительной шпилькообразной структуры, становясь премирнкальной РНК. ПремиРНК снова разрезается Дрошей (РНК-полимеразой III) с образованием зрелого дуплекса миРНК. Зрелая последовательность интегрируется в РНК-индуцированный комплекс глушения (RISC), комплементарный последовательности мРНК, вызывая подавление трансляции или деградацию мРНК 28,30,32. Во время кормления хозяина миРНК в слюне клеща могут модулировать экспрессию гена хозяина для подавления иммунных реакций иусиления передачи патогена 33,34,35,36,37. Хотя существуют обширные исследования ev и miRNAs, их роль во время кормления на интерфейсе клещ-хозяин все еще плохо изучена. Оптимизация протоколов, которые могут легко привести к изоляции и очистке высококачественных микроРНК, имеет решающее значение для продвижения наших знаний по этим темам.
Для выделения электромобилей могут быть использованы несколько вариантов, таких как ультрацентрифугирование, осаждение экзосом, осаждение полимеров, иммуноаффинная хроматография и методы исключения на основе размера38. Однако эти методы не могут различать экзосомы или микровезикулы. Таким образом, как упоминалось ранее, EV используется в качестве зонтичного термина при выделении электромобилей из разных образцов. Везикулы, выделенные в экспериментах, описанных в настоящем описании, представляют собой смесь везикул, полученных из различных путей биогенеза. Дальнейшая очистка специфической популяции внеклеточных везикул может быть достигнута путем иммунопреципитации с использованием шариков, покрытых антителами против маркеров (т.е. экзосомальных маркеров, опухолевых маркеров), уникальных для везикул, представляющих интерес39,40. miRNAs также могут быть извлечены с помощью различных коммерчески доступных изоляционных наборов 7,41,42.
Цель этого проекта состояла в том, чтобы разработать протокол, который сочетает в себе широко применяемые методы выделения EV и извлечения миРНК как из EV, так и из слюнных желез. Поскольку секреция биологически активных соединений активируется при кормлении12, клещам следует разрешить питаться для выявления миРНК, которые могут быть важны для манипулирования иммунными реакциями хозяина и заживления ран. Настоящий протокол требует небольшого количества клещей (20 клещей) для изоляции EV и их соответствующих микроРНК по сравнению с другими ранее описанными исследованиями, которые требовали 2000 тиков43. Кроме того, он позволяет избежать загрязнения секреции слюны пилокарпином44, что может повлиять на эксперименты, изучающие влияние EV и их миРНК на клетки-хозяева.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m syringe filter</td>
			<td>GenClone</td>
			<td>25-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 &#181;m nylon syringe filter</td>
			<td>Tisch Scientific</td>
			<td>283129028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 inch black adhesive</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B00FQ937NM</td>
			<td>Capsule</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL needeless syringe</td>
			<td>Exelint</td>
			<td>26265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#39; and 5&#39; Adapters</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 mm vannas scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.1523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>337922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-003-CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beads</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5425</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Macron</td>
			<td>UN1888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyverse Discovery Enviornment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://cyverse.org/discovery-environment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sideded carpet tape</td>
			<td>amazon</td>
			<td>&#8206;286373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Tubes, 50 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>FBS-02-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fine forceps</td>
			<td>Excelta</td>
			<td>5-S-SE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foamies, 2 mm</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B004M5QGBQ</td>
			<td>Capsule</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Phoenix Pharmaceuticals manfactured</td>
			<td>193.33165.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ixodes scaplaris</td>
			<td>CDC, Oklahoma State University</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L15C300 medium</td>
			<td>In-lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lipoprotein-cholesterol concentrate</td>
			<td>MPI</td>
			<td>02191476-CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10118-596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRDeep2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/rajewsky-lab/mirdeep2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-MuLV Reverse Transcriptase</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>molecular grade ethanol</td>
			<td>Fischer Bioreagents</td>
			<td>UN1170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multi-well 24 well tissue culture treated plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanopaticle Tracking Analyzer machine</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosep with 300K Omega filter</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>OD3003C33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit v3</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq 500/550 High Output Kit (75 cycles)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XPN 90 Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>Thermofischer Scientific</td>
			<td>ICN19453780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pippettes</td>
			<td>Ependorff</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polycarbonate centrifuge bottle</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen miRNeasy kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAzol lysis reagent</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>Q32880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit kit</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>Q10212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbits</td>
			<td>Charles River</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Universal Primer</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhipicephalus microplus</td>
			<td>Cattle Fever Tick Research Labratoty</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Fischer Bioreagents</td>
			<td>215544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>833280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse free tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse inhibitor</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>11111729</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse/DNAse free water</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Minelute spin column</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217084</td>
			<td>Qiagen miRNeasy kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPE Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217084</td>
			<td>Qiagen miRNeasy kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT Buffer</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-seq kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT Forward Primer</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-seq kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTE Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217084</td>
			<td>Qiagen miRNeasy kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6014-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall ST16</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>75004380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized Gauze sponges</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>2187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized PBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>RNBK0694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>streptomycin</td>
			<td>thermofischer Scientific</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TapeStation</td>
			<td>Aligent</td>
			<td>G2991BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tear Mender Instant Fabric and Leather Adhesive</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>7.42836E+11</td>
			<td>Capsule</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Adhesive</td>
			<td>3M VetBond</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triple Antibiotics</td>
			<td>dechra</td>
			<td>17033-122-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptose phosphate broth</td>
			<td>BD</td>
			<td>BD 260300</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of micrornas from tick ex vivo salivary gland cultures and extracellular vesicles

Клещи являются важными эктопаразитами, которые могут переносить несколько патогенов. Слюнные железы клещей необходимы для кормления, поскольку их слюна содержит много эффекторов с фармацевтическими свойствами, которые могут уменьшить иммунные реакции хозяина и усилить передачу патогенов. Одной из групп таких эффекторов являются микроРНК (миРНК). miRNAs представляют собой короткие некодирующие последовательности, которые регулируют экспрессию генов хозяина на границе клеща и хозяина и в органах клеща. Эти небольшие РНК транспортируются в слюне клеща через внеклеточные везикулы (EV), которые служат меж- и внутриклеточной связи. Везикулы, содержащие микроРНК, были идентифицированы в слюне клещей. Тем не менее, мало что известно о роли и профилях микроРНК в пузырьках и железах слюны клещей. Кроме того, изучение везикул и миРНК в слюне клещей требует утомительных процедур по сбору слюны клещей. Этот протокол направлен на разработку и валидацию метода выделения миРНК из очищенных внеклеточных везикул, продуцируемых культурами органов ex vivo . Материалы и методология, необходимые для извлечения миРНК из внеклеточных пузырьков и клещевых слюнных желез, описаны в настоящем описании.

Настоящий протокол предоставляет подробную методологию извлечения миРНК из слюнных желез и EV. Согласно результатам, этот протокол эффективен для выделения миРНК от взрослых особей двух разных видов клещей, I. scapularis и R. microplus, и потенциально может быть использован и у других ви?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles at JoVE.com

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

Настоящий протокол описывает выделение микроРНК из клещевых слюнных желез и очищенных внеклеточных везикул. Это универсальная процедура, которая сочетает в себе широко используемые реагенты и расходные материалы. Метод также позволяет использовать небольшое количество клещей, что приводит к качественным микроРНК, которые могут быть легко секвенированы.

Выделение микроРНК из клещей Ex vivo Культуры слюнных желез и внеклеточных везикул

Ticks are important ectoparasites that can vector multiple pathogens. The salivary glands of ticks are essential for feeding as their saliva contains many ...

Этот протокол позволяет использовать уменьшенное количество клещей, что снижает затраты на содержание колонии и уменьшает количество позвонков животных, необходимых для кормления клещей. Этот протокол требует приблизительно 20 тиков. Однако основным преимуществом, помимо использования небольшого размера выборки, является то, что этот протокол может быть применен к нескольким видам клещей и различным стадиям жизни.Помимо вскрытия клещей или применения к взаимодействиям хозяина и паразита, влияние патогенной инфекции на секрецию микроРНК и влияние физиологических изменений на микроРНК, секретируемую клещами. Для начала приготовьте среду без пузырьков, добавив фетальную бычью сыворотку, триптозофосфатный бульон, 10% концентрат холестерина липопротеинов, 5% бикарбонат натрия, HEPES и среду L15C300 в бутылку с поликарбонатной центрифугой объемом 26,3 миллилитра и отрегулируйте объем по мере необходимости. Теперь ультрацентрифугируйте среду в 100 000 раз G при четырех градусах Цельсия в течение 18 часов.Осторожно удалите супернатант, не нарушая гранулу, и перенесите супернатант в свежую трубку центрифуги. Еще раз ультрацентрифугируйте трубку. Возьмите супернатант и пропустите его через фильтр 0,22 микрометра, чтобы удалить загрязняющие вещества.Пипетка супернатанта в 50-миллилитровую центрифужную трубку и храните его при минус 20 градусах Цельсия до тех пор, пока потребуется или до трех лет. Добавьте соответствующее количество антибиотиков к 500 микролитрам среды без пузырьков в каждую лунку 24-луночной культуральной пластины. Теперь добавьте PBS с рифампицином в лунки, которые не содержат среду без пузырьков, чтобы предотвратить рост бактерий.Поместите клещей на стеклянную горку с помощью двусторонней ковровой ленты под рассекающим микроскопом. Перед рассечением добавьте pBS, содержащий рифампицин, к клещу и, используя четырехмиллиметровые ножницы Vannas, сделайте разрез примерно в один миллиметр на стороне каждой самки. Теперь удалите спинную сторону клеща и слюнные железы, затем поместите от 20 до 40 слюнных желез клеща в 500 микролитров среды без пузырьков, добавленных в одну лунку в 24-луночную обработанную ткань.Инкубируйте образцы слюнных желез при 32 градусах Цельсия в течение 24 часов, чтобы обеспечить секрецию внеклеточных везикул. В конце инкубации пипетку всей среды, содержащей слюнные железы, в 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку и центрифугу в 300 раз больше G при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут. Перенесите супернатант в новую 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку.Повторно суспендировать гранулы, содержащие слюнные железы в РНК, позже и хранить при минус 80 градусах Цельсия до использования или неопределенно долго. Теперь удалите клеточный мусор, центрифугируя супернатант в 2000 раз G при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут и пипетку супернатанта в новую 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку. Затем центрифугируют в 10 000 раз G в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия, чтобы удалить апоптотические тела и более крупные внеклеточные везикулы и перенести супернатант в свежую 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку.Затем соберите одномикрометровый нейлоновый шприцевый фильтр на 10-миллилитровом шприце и держите его на ультрацентрифужной трубке. Затем добавьте образец и заполните шприц 10 миллилитрами PBS. Пропустите супернатант через фильтр в трубку.После фильтрации и балансировки труб поместите их в ротор 70 Ti и ультрацентрифугируйте трубы в 100 000 раз G в течение 18 часов при четырех градусах Цельсия. Концентрированные внеклеточные везикулы образуют гранулу после ультрацентрифугирования. Удалите супернатант, не нарушая гранулу, и повторно суспендируйте гранулу в PBS.Пипетка 500 микролитров внеклеточного пузырька в центробежный фильтр 300 К и центрифугу в 8 000 раз G в течение 10 минут при температуре окружающей среды и повторяйте эту процедуру до тех пор, пока все внеклеточные везикулы не будут отфильтрованы. Наконец, добавьте 400 микролитров стерилизованного PBS в колонку и тщательно перемешайте, чтобы удалить внеклеточные везикулы, прикрепленные к мембране. Затем поместите образец в 1,5-миллилитровую трубку, свободную от ДНК.Концентрация и размер внеклеточных пузырьков варьировались в зависимости от пола и стадии жизни клещей между биологическими репликами для самок, самцов и нимф. Для всех комбинированных биологических реплик наблюдались аналогичные результаты. Анализ малых РНК, выделенных из слюнной железы, показал полосы, соответствующие рибосомным РНК и микроРНК.Однако рибосомные РНК отсутствовали в везикулах, выделенных из слюнных желез, а образцы микроРНК, очищенные от внеклеточных везикул, показали большую деградацию. После обогащения образцы микроРНК, очищенные от EV, показали минимальную деградацию и достаточную концентрацию микроРНК для синтеза библиотеки кДНК. Ожидаемый размер полосы около 150 пар оснований после получения библиотеки кДНК означает небольшие библиотеки РНК-кДНК.Во время приготовления без пузырьков следите за действиями по предотвращению наружного загрязнения пузырьков. Во время приготовления колодца обязательно добавляйте антибиотики, чтобы предотвратить бактериальное загрязнение из микробиома клеща. МикроРНК, извлеченные с использованием этого протокола, могут быть использованы для профилирования и функциональных экспериментов по проверке ролей микроРНК, таких как прогнозирование мишеней пути микроРНК, ингибирование и эксперименты по мимикрии.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells

Выделение мышью слюнных желез стволовых клеток

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of ...

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

Vampiric выделение внеклеточной жидкости из<em&gt; Caenorhabditis Элеганс</em

The genetically tractable model organism C. elegans has provided insights into a myriad of biological questions, enabled by its short generation time, ...

Isolation of Basal Cells and Submucosal Gland Duct Cells from Mouse Trachea

Изоляция базальных клеток и подслизистой Клетки Канальные железы от трахеи мыши

The large airways are directly in contact with the environment and therefore susceptible to injury from toxins and infectious agents that we breath in 1. ...

Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures

Генетическая модификация и рекомбинации слюнных желез органной культуры

Branching  morphogenesis occurs during the development of many organs, and the embryonic  mouse submandibular gland (SMG) is a classical model for the ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

Наивные стволовых клеток взрослых Изоляция от первичных человеческих культурах фибробластов

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Isolation of Intact, Whole Mouse Mammary Glands for Analysis of Extracellular Matrix Expression and Gland Morphology

Изоляция нетронутыми, весь мыши молочных желез для анализа выражения внеклеточного матрикса и морфология железы

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal ...

Isolation of Retinal Arterioles for Ex Vivo Cell Physiology Studies

Isolation of Retinal Arterioles for Ex Vivo Cell Physiology Studies

Изоляция артериол сетчатки для исследования физиологии клетки Ex Vivo

The retina is a highly metabolically active tissue that requires a substantial blood supply. The retinal circulation supports the inner retina, while the ...

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

Гранулярных анализ внеклеточного Vesicles из клеток кондиционером СМИ потока

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Очищение и анализ Caenorhabditis elegans Внеклеточные Vesicles

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Масштабируемое выделение и очистка внеклеточных везикул от кишечной палочки и других бактерий

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...