Name: isolation of micrornas from tick ex vivo salivary gland cultures and extracellular vesicles
Uploaded: 2022-04-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles at JoVE.com

Estamos muy agradecidos por la asistencia del Laboratorio de Garrapatas de la Fiebre del Ganado en Edinburg, Texas. Nos gustaría agradecer a Michael Moses, Jason Tidwell, James Hellums, Cesario Agado y Homer Vasquez. También nos gustaría agradecer la asistencia de Sarah Sharpton, Elizabeth Lohstroh, Amy Filip, Kelsey Johnson, Kelli Kochcan, Andrew Hillhouse, Charluz Arocho Rosario y Stephanie Guzmán Valencia durante todo el proyecto. Nos gustaría agradecer al Grupo de Escritura de Mujeres en Entomología (AWE) de Texas A&M Aggie por su ayuda y consejos durante la redacción de este manuscrito. Los siguientes reactivos fueron proporcionados por los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades para su distribución por BEI Resources, NIAID, NIH: Ixodes scapularis Adult (Live), NR-42510. Las garrapatas hembra de I. scapularis también se recibieron de la Instalación de Cría de Garrapatas en la Universidad Estatal de Oklahoma. Este proyecto fue financiado por Texas A&M University T3: triads for transformation grant y el acuerdo de cooperación #58-3094-1-003 por el USDA-ARS a AOC.

Todos los experimentos con animales se realizaron siguiendo el protocolo de uso de animales (AUP # 2020-0026) aprobado por el comité institucional de cuidado y uso de animales (AICUC) de la Universidad de Texas A & M. Las especies de garrapatas, Ixodes scapularis y Rhipicephalus (Boophilus) microplus, y los conejos blancos machos de Nueva Zelanda, de 42 a 72 días de edad, se utilizaron para el presente estudio. I. scapularis fue recibido del Centro para el Control de Enfermedades (CDC) y la U...

El protocolo actual proporciona una metodología detallada para extraer miRNA de las glándulas salivales y los EV. Sin embargo, hay consideraciones importantes, todas las cuales se detallan en las notas para cada sección de este protocolo. La cápsula y la malla deben asegurarse durante la alimentación con garrapatas para evitar que las garrapatas se escapen. La preparación y colocación de la cápsula se describen en Koga et al.40. Se deben realizar varias réplicas de las disecciones de garr...

Las garrapatas son ectoparásitos que vectorizan muchos patógenos a la vida silvestre, el ganado, los humanos y sus mascotas 1,2. La alimentación con garrapatas resulta en una pérdida económica significativa al causar daños en la piel, reducir el peso y la producción de leche debido a la anemia severa y la transmisión de patógenos potencialmente mortales que causan enfermedades 1,3,4,5. Las prácticas de control actuales para el manejo de las poblaciones de garrapatas se centran en el uso de acaricidas. Sin embargo, la continua aparición de resistencia a los acaricidas en garrapatas que parasitan el ganado 5,6, el aumento de la incidencia de picaduras de garrapatas7 y la transmisión de patógenos dentro de las zonas residenciales 8,9, han llevado a la necesidad de alternativas únicas de control de garrapatas.
Las glándulas salivales de la garrapata son órganos esenciales que aseguran el éxito biológico de una garrapata. Están formados por diferentes tipos de acinos (I, II, III y IV) con diversas funciones fisiológicas. Las glándulas salivales son responsables de la osmorregulación, tanto fuera como sobre el huésped, al devolver el exceso de agua y el contenido de hierro al huésped a través de la salivación 2,10. Los acinos de tipo I también están involucrados en la absorción de agua de la atmósfera por la secreción de saliva higroscópica10,11. Las proteínas efectoras salivales, como el cemento y las cistatinas, se producen dentro de las células secretoras en los acini10,12 de tipo II y III. Los acinos tipo I no afectan la alimentación con garrapatas, lo que indica que la ingesta de harina de sangre no desencadena cambios morfológicos y fisiológicos en estos acinos tipo13,14. Por otro lado, los Acini tipo II y III se activan durante la alimentación y presentan muy poca actividad pre-fijación. Por lo tanto, la alimentación es necesaria para desencadenar el agrandamiento de las células secretoras dentro de los acinos tipo II y la producción de compuestos bioactivos. Los acinos tipo III se reducen de tamaño durante la alimentación debido a la secreción dentro de los gránulos secretores12.
Las glándulas salivales también son el sitio de infección por patógenos en la garrapata y la ruta de transmisión. Durante la alimentación, las garrapatas secretan varios compuestos con efectos farmacéuticos que son necesarios para completar con éxito la harina de sangre 10,15,16. Estos compuestos tienen propiedades antiinflamatorias, inmunosupresoras y vasodilatadoras 10,15,17. Estudios recientes han demostrado que las vesículas extracelulares (EV) derivadas de las glándulas salivales de las garrapatas albergan varios de estos compuestos, induciendo efectos antiinflamatorios e inmunomoduladores 18,19,20. "Vesículas extracelulares" es un término general utilizado para describir vesículas clasificadas como exosomas y microvesículas en función de su tamaño y biogénesis. En general, los EV son ampollas lipídicas con membranas bicapa que son ~ 40 nm-1 μm de tamaño21; en general, los exosomas se describen como de 40-150 nm de tamaño, mientras que las microvesículas tienen entre 150 nm-1 μm de tamaño 21,22,23. Sin embargo, el tamaño no es indicativo de la vía de biogénesis de los EV22.
La biogénesis de los exosomas comienza con la invaginación secuencial de la membrana plasmática. Esta invaginación conduce a la formación de cuerpos multivesiculares y finalmente da lugar a la deformación de la membrana vesicular por la acción de complejos ESCRT o esfingomielinasas (sMasas)24,25. Los exosomas pueden lisarse dentro de los lisosomas para mantener la homeostasis celular o salir a través de la fusión vesicular a la membrana plasmática para entregar constituyentes celulares a las células receptoras21,24. Por otro lado, las microvesículas se forman por la acción de flopasses y flipasses, cambiando la conformación de lípidos en la membrana plasmática26. Los EV son esenciales para la comunicación de célula a célula, ya que sirven como un sistema de transporte para la carga intracelular, como lípidos, proteínas, ácidos nucleicos y microARN (miARN)21,27,28. Una vez transportadas, estas vesículas entregan su carga en el citoplasma de las células receptoras, generando cambios fenotípicos en la célula receptora22,29. Debido a la importancia de las vesículas extracelulares en la alimentación de garrapatas y la manipulación de las respuestas inmunes y de curación de heridas del huésped18,20, la carga dentro de las vesículas extracelulares presenta objetivos potenciales para el desarrollo de terapias antihorques y un mecanismo único para interrumpir la alimentación de garrapatas. Esto incluye miRNAs dentro de las glándulas salivales de garrapatas y vesículas extracelulares derivadas de glándulas salivales.
Los miRNAs son secuencias cortas no codificantes, de ~18-22 nucleótidos (nt) de longitud, que pueden regular, degradar o silenciar secuencias de ARNm post-transcripcionales30,31. Durante la transcripción, los pri-miRNAs son escindidos por Dicer (ARN polimerasa III) para formar una estructura distintiva similar a una horquilla, convirtiéndose en un pre-miRNA. El pre-miRNA es cortado una vez más por Drosha (ARN polimerasa III) para formar un dúplex de miRNA maduro. La secuencia madura se integra en el complejo silenciador inducido por ARN (RISC) complementario a la secuencia de ARNm, causando represión de la traducción o degradación del ARNm 28,30,32. Durante la alimentación del huésped, los miRNAs dentro de la saliva de la garrapata pueden modular la expresión génica del huésped para suprimir las respuestas inmunes y mejorar la transmisión de patógenos 33,34,35,36,37. Aunque existen estudios extensos sobre vehículos eléctricos y miRNAs, sus funciones durante la alimentación en la interfaz garrapata-huésped aún no se conocen bien. Optimizar los protocolos que pueden resultar fácilmente en el aislamiento y la purificación de miRNAs de alta calidad es crucial para avanzar en nuestro conocimiento sobre estos temas.
Se pueden utilizar múltiples opciones para aislar los EV, como la ultracentrifugación, la precipitación de exosomas, la precipitación de polímeros, la cromatografía de inmunoafinidad y las técnicas de exclusión basadas en el tamaño38. Sin embargo, estas técnicas no pueden distinguir entre exosomas o microvesículas. Por lo tanto, como se mencionó anteriormente, EV se utiliza como un término general al aislar EV de diferentes muestras. Las vesículas aisladas en los experimentos descritos aquí representan una mezcla de vesículas derivadas de diferentes vías de biogénesis. La purificación adicional de una población específica de vesículas extracelulares se puede lograr mediante inmunoprecipitación utilizando perlas recubiertas con anticuerpos contra marcadores (es decir, marcadores exosomales, marcadores tumorales) únicos para la población de vesículas de interés39,40. Los miRNAs también se pueden extraer a través de diferentes kits de aislamiento disponibles comercialmente 7,41,42.
El objetivo de este proyecto fue desarrollar un protocolo que combine métodos comúnmente aplicados para aislar los EV y extraer miRNA tanto de los EV como de las glándulas salivales de las garrapatas alimentadas. Debido a que la secreción de compuestos bioactivos se activa al alimentara 12, se debe permitir que las garrapatas se alimenten para identificar miRNAs que pueden ser importantes para manipular las respuestas inmunes y de curación de heridas del huésped. El presente protocolo requiere un pequeño número de garrapatas (20 garrapatas) para aislar los EV y sus respectivos miRNAs, en comparación con otros estudios descritos anteriormente que requirieron 2000 garrapatas43. Además, evita la contaminación de las secreciones salivales con pilocarpina44, lo que podría influir en los experimentos que estudian el efecto de los EV y sus miRNAs en las células huésped.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m syringe filter</td>
			<td>GenClone</td>
			<td>25-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 &#181;m nylon syringe filter</td>
			<td>Tisch Scientific</td>
			<td>283129028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 inch black adhesive</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B00FQ937NM</td>
			<td>Capsule</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL needeless syringe</td>
			<td>Exelint</td>
			<td>26265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#39; and 5&#39; Adapters</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 mm vannas scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.1523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>337922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-003-CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beads</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5425</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Macron</td>
			<td>UN1888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyverse Discovery Enviornment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://cyverse.org/discovery-environment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sideded carpet tape</td>
			<td>amazon</td>
			<td>&#8206;286373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Tubes, 50 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>FBS-02-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fine forceps</td>
			<td>Excelta</td>
			<td>5-S-SE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foamies, 2 mm</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B004M5QGBQ</td>
			<td>Capsule</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Phoenix Pharmaceuticals manfactured</td>
			<td>193.33165.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ixodes scaplaris</td>
			<td>CDC, Oklahoma State University</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L15C300 medium</td>
			<td>In-lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lipoprotein-cholesterol concentrate</td>
			<td>MPI</td>
			<td>02191476-CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10118-596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRDeep2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/rajewsky-lab/mirdeep2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-MuLV Reverse Transcriptase</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>molecular grade ethanol</td>
			<td>Fischer Bioreagents</td>
			<td>UN1170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multi-well 24 well tissue culture treated plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanopaticle Tracking Analyzer machine</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosep with 300K Omega filter</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>OD3003C33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit v3</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq 500/550 High Output Kit (75 cycles)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XPN 90 Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>Thermofischer Scientific</td>
			<td>ICN19453780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pippettes</td>
			<td>Ependorff</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polycarbonate centrifuge bottle</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen miRNeasy kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAzol lysis reagent</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>Q32880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit kit</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>Q10212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbits</td>
			<td>Charles River</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Universal Primer</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhipicephalus microplus</td>
			<td>Cattle Fever Tick Research Labratoty</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Fischer Bioreagents</td>
			<td>215544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>833280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse free tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse inhibitor</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>11111729</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse/DNAse free water</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Minelute spin column</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217084</td>
			<td>Qiagen miRNeasy kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPE Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217084</td>
			<td>Qiagen miRNeasy kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT Buffer</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-seq kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT Forward Primer</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-seq kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTE Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217084</td>
			<td>Qiagen miRNeasy kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6014-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall ST16</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>75004380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized Gauze sponges</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>2187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized PBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>RNBK0694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>streptomycin</td>
			<td>thermofischer Scientific</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TapeStation</td>
			<td>Aligent</td>
			<td>G2991BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tear Mender Instant Fabric and Leather Adhesive</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>7.42836E+11</td>
			<td>Capsule</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Adhesive</td>
			<td>3M VetBond</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triple Antibiotics</td>
			<td>dechra</td>
			<td>17033-122-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptose phosphate broth</td>
			<td>BD</td>
			<td>BD 260300</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of micrornas from tick ex vivo salivary gland cultures and extracellular vesicles

Las garrapatas son ectoparásitos importantes que pueden vectorizar múltiples patógenos. Las glándulas salivales de las garrapatas son esenciales para la alimentación, ya que su saliva contiene muchos efectores con propiedades farmacéuticas que pueden disminuir las respuestas inmunes del huésped y mejorar la transmisión de patógenos. Un grupo de tales efectores son los microARN (miARN). Los miRNAs son secuencias cortas no codificantes que regulan la expresión génica del huésped en la interfaz garrapata-huésped y dentro de los órganos de la garrapata. Estos pequeños ARN se transportan en la saliva de la garrapata a través de vesículas extracelulares (EV), que sirven para la comunicación inter e intracelular. Se han identificado vesículas que contienen miRNAs en la saliva de las garrapatas. Sin embargo, se sabe poco sobre los roles y perfiles de los miRNAs en las vesículas y glándulas salivales de las garrapatas. Además, el estudio de vesículas y miRNAs en la saliva de garrapatas requiere procedimientos tediosos para recolectar saliva de garrapatas. Este protocolo tiene como objetivo desarrollar y validar un método para aislar miRNAs de vesículas extracelulares purificadas producidas por cultivos de órganos ex vivo . Los materiales y la metodología necesarios para extraer miRNAs de vesículas extracelulares y glándulas salivales de garrapatas se describen aquí.

El presente protocolo proporciona una metodología detallada para extraer miRNAs de glándulas salivales y EV. Según los resultados, este protocolo es efectivo para el aislamiento de miRNA de adultos de dos especies diferentes de garrapatas, I. scapularis y R. microplus, y también se puede usar potencialmente en otras especies de garrapatas. La concentración de EV (partículas/ml) se midió a través de NTA. Para R. microplus, cada género y etapa de la vida contenía tres réplicas...

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Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

El presente protocolo describe el aislamiento de microARN de las glándulas salivales de las garrapatas y las vesículas extracelulares purificadas. Este es un procedimiento universal que combina reactivos y suministros de uso común. El método también permite el uso de un pequeño número de garrapatas, lo que resulta en microARN de calidad que se pueden secuenciar fácilmente.

Aislamiento de microARN de cultivos de garrapatas ex vivo de glándulas salivales y vesículas extracelulares

Ticks are important ectoparasites that can vector multiple pathogens. The salivary glands of ticks are essential for feeding as their saliva contains many ...

Este protocolo nos permite utilizar un número reducido de garrapatas, lo que reduce el costo de mantenimiento de la colonia y disminuye el número de vértebras necesarias para la alimentación de garrapatas. Este protocolo requiere aproximadamente 20 ticks. Sin embargo, la principal ventaja, aparte de usar un tamaño de muestra pequeño, es que este protocolo se puede aplicar a múltiples especies de garrapatas y diferentes etapas de la vida.Aparte de las disecciones de garrapatas o la aplicación hacia las interacciones huésped-parásito, el efecto de la infección por patógenos en la secreción de microARN y el efecto de los cambios fisiológicos en el microARN secretado por las garrapatas. Para comenzar, prepare medios libres de vesículas agregando suero bovino fetal, caldo de fosfato de triptosa, concentrado de colesterol de lipoproteína al 10%, bicarbonato de sodio al 5%, HEPES y medio L15C300 en una botella centrífuga de policarbonato de 26.3 mililitros y ajuste el volumen según sea necesario. Ahora ultracentrifugar el medio a 100, 000 veces G a cuatro grados centígrados durante 18 horas.Retire con cuidado el sobrenadante sin alterar el pellet y transfiera el sobrenadante a un tubo de centrífuga nuevo. Ultracentrifugar el tubo una vez más. Tome el sobrenadante y páselo a través de un filtro de 0,22 micrómetros para eliminar los contaminantes.Pipetear el sobrenadante en un tubo de centrífuga de 50 mililitros y almacenarlo a menos 20 grados centígrados hasta que sea necesario o hasta tres años. Agregue una cantidad apropiada de antibióticos a 500 microlitros del medio libre de vesículas en cada pocillo de una placa de cultivo de 24 pocillos. Ahora, agregue PBS con rifampicina a los pocillos que no contienen medio libre de vesículas para prevenir el crecimiento bacteriano.Coloque las garrapatas en un portaobjetos de vidrio con cinta de alfombra de doble cara bajo un microscopio de disección. Antes de la disección, agregue PBS que contenga rifampicina a la garrapata y usando unas tijeras Vannas de cuatro milímetros, haga una incisión de aproximadamente un milímetro en el lado de cada hembra. Ahora, retire el lado dorsal y las glándulas salivales de la garrapata, luego coloque de 20 a 40 glándulas salivales de garrapatas en 500 microlitros de medio libre de vesículas agregado a un solo pocillo en una placa tratada con cultivo de tejido de 24 pocillos.Incubar las muestras de glándulas salivales a 32 grados centígrados durante 24 horas para permitir la secreción de las vesículas extracelulares. Al final de la incubación, pipetear todo el medio que contiene las glándulas salivales en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros y centrifugar a 300 veces G a cuatro grados centígrados durante 10 minutos. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.Vuelva a suspender el pellet que contiene las glándulas salivales en ARN más tarde y guárdelo a menos 80 grados centígrados hasta que se use o indefinidamente. Ahora, retire los desechos celulares centrifugando el sobrenadante a 2, 000 veces G a cuatro grados Celsius durante 10 minutos y pipetear el sobrenadante en un nuevo tubo de microcentrífuga de 1.5 mililitros. A continuación, centrifugar a 10, 000 veces G durante 30 minutos a cuatro grados centígrados para eliminar los cuerpos apoptóticos y vesículas extracelulares más grandes y transferir el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga fresco de 1,5 mililitros.Luego ensamble un filtro de jeringa de nylon de un micrómetro en una jeringa de 10 mililitros y manténgalo en un tubo de ultracentrífuga. Luego agregue la muestra y llene la jeringa con 10 mililitros de PBS. Pase el sobrenadante a través del filtro hasta el tubo.Después de filtrar y equilibrar los tubos, colóquelos en un rotor de 70 Ti y ultracentrifugar los tubos a 100, 000 veces G durante 18 horas a cuatro grados centígrados. Las vesículas extracelulares concentradas forman un gránulo después de la ultracentrifugación. Retire el sobrenadante sin alterar el pellet y vuelva a suspender el pellet en PBS.Pipetear 500 microlitros de la vesícula extracelular en un filtro centrífugo de 300 K y centrifugar a 8, 000 veces G durante 10 minutos a temperatura ambiente y repetir este procedimiento hasta que se filtren todas las vesículas extracelulares. Finalmente, agregue 400 microlitros de PBS esterilizado a la columna y mezcle bien para eliminar las vesículas extracelulares unidas a la membrana. Luego coloque la muestra en un tubo libre de ARNasa de ADN de 1.5 mililitros.La concentración y el tamaño de las vesículas extracelulares variaron dependiendo del género y la etapa de vida de las garrapatas entre las réplicas biológicas para hembras, machos y ninfas. Para todas las réplicas biológicas combinadas, se observaron resultados similares. El análisis de pequeños ARN aislados de la glándula salival mostró bandas correspondientes a ARN ribosómico y microARN.Sin embargo, los ARN ribosómicos estaban ausentes en las vesículas aisladas de las glándulas salivales, y las muestras de microARN purificadas de vesículas extracelulares mostraron más degradación. Después del enriquecimiento, las muestras de microARN purificadas de EV mostraron una degradación mínima y una concentración suficiente de microARN para la síntesis de la biblioteca de ADNc. El tamaño de banda esperado de aproximadamente 150 pares de bases después de que se obtuvo la preparación de la biblioteca de ADNc significa pequeñas bibliotecas de ADNc de ARN.Durante la preparación sin vesículas, asegúrese de seguir los pasos para evitar la contaminación de vesículas externas. Durante la preparación del pozo, asegúrese de agregar antibióticos para prevenir la contaminación bacteriana del microbioma de la garrapata. Los microARN extraídos utilizando este protocolo se pueden utilizar para la elaboración de perfiles y experimentos funcionales para validar las funciones del microARN, como la predicción de objetivos de la vía del microARN, la inhibición y los experimentos de mimetismo.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

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Aislamiento de células de la glándula salival del ratón madre

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Investigación

Biología

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

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Vampiric Aislamiento de líquido extracelular de<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The genetically tractable model organism C. elegans has provided insights into a myriad of biological questions, enabled by its short generation time, ...

Isolation of Basal Cells and Submucosal Gland Duct Cells from Mouse Trachea

Aislamiento de células basales y de células submucosas conducto de la glándula de ratón tráquea

The large airways are directly in contact with the environment and therefore susceptible to injury from toxins and infectious agents that we breath in 1. ...

Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures

Modificación genética y recombinación de las Glándulas Salivales culturas de órganos

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Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

Naïve Adult Stem Cells Aislamiento de Primaria cultivos de fibroblastos humanos

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

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Purificación y análisis de las vesículas extracelulares de Caenorhabditis elegans

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Aislamiento escalable y purificación de vesículas extracelulares de Escherichia coli y otras bacterias

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...