Name: isolation of micrornas from tick ex vivo salivary gland cultures and extracellular vesicles
Uploaded: 2022-04-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles at JoVE.com

Edinburg, Teksas'taki Sığır Ateşi Kene Laboratuvarı'nın yardımı için çok minnettarız. Michael Moses, Jason Tidwell, James Hellums, Cesario Agado ve Homer Vasquez'e teşekkür ederiz. Proje boyunca Sarah Sharpton, Elizabeth Lohstroh, Amy Filip, Kelsey Johnson, Kelli Kochcan, Andrew Hillhouse, Charluz Arocho Rosario ve Stephanie Guzman Valencia'nın yardımlarına da teşekkür ederiz. Texas A&M Aggie Women in Entomology (AWE) Writing Group'a bu makalenin yazılması sırasındaki yardım ve tavsiyeleri için teşekkür ederiz. Aşağıdaki reaktifler BEI Resources, NIAID, NIH tarafından dağıtılmak üzere Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezleri tarafından sağlanmıştır: Ixodes scapularis Adult (Live), NR-42510. Dişi I. scapularis keneleri de Oklahoma Eyalet Üniversitesi'ndeki Kene Yetiştirme Tesisi'nden alındı. Bu proje Texas A & M Üniversitesi T3 tarafından finanse edildi: dönüşüm hibesi için üçlü ve USDA-ARS tarafından AOC'ye yapılan işbirliği anlaşması #58-3094-1-003.

Tüm hayvan deneyleri, Texas A & M Üniversitesi'ndeki kurumsal hayvan bakımı ve kullanım komitesi (AICUC) tarafından onaylanan hayvan kullanım protokolünü (AUP # 2020-0026) izleyerek gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmada kene türleri, Ixodes scapularis ve Rhipicephalus (Boophilus) microplus ve 42-72 günlük Yeni Zelanda Erkek Beyaz Tavşanları kullanılmıştır. I. scapularis, patojensiz olarak sertifikalandırılan Hastalık Kontrol Merkezi (CDC) ve Oklahoma Eyalet Üniversitesi...

Mevcut protokol, tükürük bezlerinden ve EV'lerden miRNA'nın çıkarılması için ayrıntılı bir metodoloji sunmaktadır. Bununla birlikte, hepsi bu protokolün her bölümünün notlarında ayrıntılı olarak açıklanan önemli hususlar vardır. Kenelerin kaçmasını önlemek için kene besleme sırasında kapsül ve ağ ağı sabitlenmelidir. Kapsül hazırlama ve yerleştirme Koga ve ark.40'ta açıklanmıştır. Uygun olmayan bir numune atılırsa, kene diseksiyonlarının birkaç kop...

Keneler, birçok patojeni vahşi yaşama, hayvancılığa, insanlara ve evcil hayvanlarına vektör eden ektoparazitlerdir 1,2. Kene besleme, saklanmaya zarar vererek, şiddetli anemi nedeniyle kilo ve süt üretimini azaltarak ve potansiyel olarak ölümcül hastalığa neden olan patojenlerin bulaşmasına neden olarak önemli ekonomik kayıplara neden olur 1,3,4,5. Kene popülasyonlarını yönetmek için mevcut kontrol uygulamaları, akarisitlerin kullanımına odaklanmıştır. Bununla birlikte, hayvancılıkta parazitleştiren kenelerde akarisit direncinin sürekli ortaya çıkması5,6, kene ısırığı insidansının artması 7 ve yerleşim bölgelerinde patojen bulaşması8,9, benzersiz kene kontrol alternatiflerine ihtiyaç duyulmasına neden olmuştur.
Kene tükürük bezleri, bir kenenin biyolojik başarısını sağlayan temel organlardır. Çeşitli fizyolojik fonksiyonlara sahip farklı acinus tipleri (I, II, III ve IV) tarafından oluşturulurlar. Tükürük bezleri, tükürüksalgısı 2,10 yoluyla su fazlalığını ve demir içeriğini konakçıya geri döndürerek hem kapalı hem de konakçı üzerinde ozmoregülasyondan sorumludur. Tip I acini ayrıca higroskopik tükürük10,11 salgılanmasıyla atmosferden su alımında da rol oynar. Çimento ve sistatinler gibi tükürük efektör proteinleri, tip II ve III acini10,12'de salgı hücreleri içinde üretilir. Tip I acini kene beslenmesini etkilemez, bu da kan unu alımının bu acini tip13,14'te morfolojik ve fizyolojik değişiklikleri tetiklemediğini gösterir. Öte yandan, Acini tip II ve III beslenme sırasında aktive edilir ve bağlanma öncesi çok az aktivite gösterir. Bu nedenle, tip II acini içindeki salgı hücrelerinin genişlemesini ve biyoaktif bileşiklerin üretimini tetiklemek için besleme gereklidir. Tip III acini, salgı granülleri12 içindeki sekresyon nedeniyle beslenme sırasında küçültülür.
Tükürük bezleri ayrıca kene ve bulaşma yolunda patojen enfeksiyonun yeridir. Beslenme sırasında, keneler kan unu10,15,16'nın başarılı bir şekilde tamamlanması için gerekli olan farmasötik etkileri olan birkaç bileşik salgılarlar. Bu bileşikler anti-enflamatuar, immünsüpresif ve vazodilatatör özelliklere sahiptir10,15,17. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, kene tükürük bezlerinden türetilen hücre dışı veziküllerin (EV'ler) bu bileşiklerin birkaçını barındırdığını ve anti-enflamatuar ve immüno-modülatör etkileri indüklediğini göstermiştir18,19,20. "Hücre dışı veziküller", boyutlarına ve biyogenezlerine göre eksozomlar ve mikro-parçacıklar olarak sınıflandırılan vezikülleri tanımlamak için kullanılan bir şemsiye terimdir. Genel olarak, EV'ler,21 boyutunda ~ 40 nm-1 μm olan çift katmanlı membranlara sahip lipit blebleridir; Genel olarak, eksozomlar 40-150 nm boyutundayken, mikro-parçacıklar 21,22,23 boyutunda 150 nm-1 μm arasındadır. Bununla birlikte, boyut EV'lerin biyogenez yolu22'nin göstergesi değildir.
Eksozomların biyogenezi, plazma zarının sıralı invaginasyonu ile başlar. Bu invaginasyon, multiveziküler cisimlerin oluşumuna yol açar ve son olarak ESCRT komplekslerinin veya sfingomiyelinazların (sMases) etkisiyle veziküler membranın deformasyonuna neden olur24,25. Eksozomlar, hücresel homeostazı korumak için lizozomlar içinde lizozomlar içinde lize edilebilir veya alıcı hücrelere hücresel bileşenler vermek için veziküler füzyon yoluyla plazma zarına çıkabilir21,24. Öte yandan, mikro-parçacıklar, plazma zarındaki lipitlerin konformasyonunu değiştiren flopassların ve flipassların etkisiyle oluşur26. EV'ler hücreden hücreye iletişim için gereklidir ve lipitler, proteinler, nükleik asitler ve mikroRNA'lar (miRNA'lar) gibi hücre içi kargolar için bir taşıma sistemi görevi görür21,27,28. Taşındıktan sonra, bu veziküller yüklerini alıcı hücrelerin sitoplazmasına teslim eder ve alıcı hücrede fenotipik değişiklikler üretir22,29. Kene beslenmesinde hücre dışı veziküllerin önemi ve konakçı immün ve yara iyileşmesi yanıtlarının manipülasyonu18,20 nedeniyle, hücre dışı veziküller içindeki kargo, kene önleyici terapötiklerin gelişimi için potansiyel hedefler ve kene beslenmesini bozmak için benzersiz bir mekanizma sunmaktadır. Bu, kene tükürük bezleri içindeki miRNA'ları ve tükürük bezi kaynaklı hücre dışı vezikülleri içerir.
miRNA'lar, mRNA dizilerini30,31 post-transkripsiyonel olarak düzenleyebilen, bozabilen veya susturabilen ~ 18-22 nükleotid (nt) uzunluğunda kısa kodlamayan dizilerdir. Transkripsiyon sırasında, pri-miRNA'lar Dicer (RNA polimeraz III) tarafından ayrılarak ayırt edici bir saç tokası benzeri yapı oluşturur ve bir pre-miRNA haline gelir. Pre-miRNA, olgun bir miRNA dubleks oluşturmak için Drosha (RNA polimeraz III) tarafından bir kez daha kesilir. Olgun dizi, mRNA dizisini tamamlayan RNA kaynaklı susturma kompleksine (RISC) entegre olur ve translasyon baskısına veya mRNA bozulmasına neden olur 28,30,32. Konakçı beslenmesi sırasında, kene tükürüğü içindeki miRNA'lar, bağışıklık tepkilerini baskılamak ve patojen iletimini arttırmak için konakçı gen ekspresyonunu modüle edebilir 33,34,35,36,37. EV'ler ve miRNA'lar üzerinde kapsamlı çalışmalar olmasına rağmen, kene-konakçı arayüzünde beslenme sırasındaki rolleri hala tam olarak anlaşılamamıştır. Yüksek kaliteli miRNA'ların izolasyonu ve saflaştırılmasıyla kolayca sonuçlanabilecek protokollerin optimize edilmesi, bu konulardaki bilgimizi ilerletmek için çok önemlidir.
EV'leri izole etmek için ultrasantrifüjleme, eksozom çökeltme, polimer çökeltme, immünoaffinite kromatografisi ve boyut tabanlı dışlama teknikleri gibi çoklu seçenekler kullanılabilir38. Bununla birlikte, bu teknikler eksozomlar veya mikro-parçacıklar arasında ayrım yapamaz. Bu nedenle, daha önce de belirtildiği gibi, EV, EV'leri farklı örneklerden izole ederken şemsiye bir terim olarak kullanılır. Burada açıklanan deneylerde izole edilen veziküller, farklı biyogenez yollarından türetilen veziküllerin bir karışımını temsil eder. Belirli bir hücre dışı vezikül popülasyonunun daha fazla saflaştırılması, ilgilenilen vezikül popülasyonuna özgü belirteçlere (yani, ekzozomal belirteçler, tümör belirteçleri) karşı antikorlarla kaplanmış boncuklar kullanılarak immünopresipitasyon ile sağlanabilir39,40. miRNA'lar ayrıca ticari olarak temin edilebilen farklı izolasyon kitleri 7,41,42 aracılığıyla da ekstrakte edilebilir.
Bu projenin amacı, EV'leri izole etmek ve miRNA'yı hem EV'lerden hem de beslenen kene tükürük bezlerinden çıkarmak için yaygın olarak uygulanan yöntemleri birleştiren bir protokol geliştirmekti. Biyoaktif bileşiklerin salgılanması12 besleme ile aktive edildiğinden, konakçı immün ve yara iyileşme yanıtlarını manipüle etmek için önemli olabilecek miRNA'ları tanımlamak için kenelerin beslenmesine izin verilmelidir. Mevcut protokol, EV'leri ve ilgili miRNA'larını izole etmek için az sayıda kene (20 kene) gerektirir, 2000 kene gerektiren daha önce tanımlanmış diğer çalışmalara kıyasla43. Ayrıca, tükürük sekresyonlarının pilokarpin44 ile kirlenmesini önler, bu da EV'lerin ve miRNA'larının konakçı hücreler üzerindeki etkisini inceleyen deneyleri etkileyebilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m syringe filter</td>
			<td>GenClone</td>
			<td>25-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 &#181;m nylon syringe filter</td>
			<td>Tisch Scientific</td>
			<td>283129028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 inch black adhesive</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B00FQ937NM</td>
			<td>Capsule</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL needeless syringe</td>
			<td>Exelint</td>
			<td>26265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#39; and 5&#39; Adapters</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 mm vannas scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.1523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>337922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-003-CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beads</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5425</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Macron</td>
			<td>UN1888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyverse Discovery Enviornment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://cyverse.org/discovery-environment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sideded carpet tape</td>
			<td>amazon</td>
			<td>&#8206;286373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Tubes, 50 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>FBS-02-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fine forceps</td>
			<td>Excelta</td>
			<td>5-S-SE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foamies, 2 mm</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B004M5QGBQ</td>
			<td>Capsule</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Phoenix Pharmaceuticals manfactured</td>
			<td>193.33165.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ixodes scaplaris</td>
			<td>CDC, Oklahoma State University</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L15C300 medium</td>
			<td>In-lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lipoprotein-cholesterol concentrate</td>
			<td>MPI</td>
			<td>02191476-CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10118-596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRDeep2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/rajewsky-lab/mirdeep2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-MuLV Reverse Transcriptase</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>molecular grade ethanol</td>
			<td>Fischer Bioreagents</td>
			<td>UN1170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multi-well 24 well tissue culture treated plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanopaticle Tracking Analyzer machine</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosep with 300K Omega filter</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>OD3003C33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit v3</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq 500/550 High Output Kit (75 cycles)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XPN 90 Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>Thermofischer Scientific</td>
			<td>ICN19453780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pippettes</td>
			<td>Ependorff</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polycarbonate centrifuge bottle</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen miRNeasy kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAzol lysis reagent</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>Q32880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit kit</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>Q10212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbits</td>
			<td>Charles River</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Universal Primer</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhipicephalus microplus</td>
			<td>Cattle Fever Tick Research Labratoty</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Fischer Bioreagents</td>
			<td>215544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>833280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse free tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse inhibitor</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>11111729</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse/DNAse free water</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Minelute spin column</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217084</td>
			<td>Qiagen miRNeasy kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPE Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217084</td>
			<td>Qiagen miRNeasy kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT Buffer</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-seq kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT Forward Primer</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-seq kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTE Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217084</td>
			<td>Qiagen miRNeasy kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6014-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall ST16</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>75004380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized Gauze sponges</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>2187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized PBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>RNBK0694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>streptomycin</td>
			<td>thermofischer Scientific</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TapeStation</td>
			<td>Aligent</td>
			<td>G2991BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tear Mender Instant Fabric and Leather Adhesive</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>7.42836E+11</td>
			<td>Capsule</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Adhesive</td>
			<td>3M VetBond</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triple Antibiotics</td>
			<td>dechra</td>
			<td>17033-122-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptose phosphate broth</td>
			<td>BD</td>
			<td>BD 260300</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of micrornas from tick ex vivo salivary gland cultures and extracellular vesicles

Keneler, çoklu patojenleri vektörleştirebilen önemli ektoparazitlerdir. Kenelerin tükürük bezleri beslenme için gereklidir, çünkü tükürükleri konakçı bağışıklık tepkilerini azaltabilen ve patojen iletimini artırabilen farmasötik özelliklere sahip birçok efektör içerir. Bu tür efektörlerin bir grubu mikroRNA'lardır (miRNA'lar). miRNA'lar, kene-konakçı arayüzünde ve kene organlarında konakçı gen ekspresyonunu düzenleyen kısa kodlamayan dizilerdir. Bu küçük RNA'lar, kene tükürüğünde, hücreler arası ve hücre içi iletişime hizmet eden hücre dışı veziküller (EV'ler) aracılığıyla taşınır. Kenelerin tükürüğünde miRNA'lar içeren veziküller tanımlanmıştır. Bununla birlikte, miRNA'ların kene tükürük vezikülleri ve bezlerindeki rolleri ve profilleri hakkında çok az şey bilinmektedir. Ayrıca, kene tükürüğündeki veziküllerin ve miRNA'ların incelenmesi, kene tükürüğünü toplamak için sıkıcı prosedürler gerektirir. Bu protokol, miRNA'ları ex vivo organ kültürleri tarafından üretilen saflaştırılmış hücre dışı veziküllerden izole etmek için bir yöntem geliştirmeyi ve doğrulamayı amaçlamaktadır. MiRNA'ları hücre dışı veziküllerden ve tükürük bezlerini kene tükürük bezlerinden çıkarmak için gereken materyaller ve metodoloji burada açıklanmıştır.

Mevcut protokol, miRNA'ları tükürük bezlerinden ve EV'lerden çıkarmak için ayrıntılı bir metodoloji sunmaktadır. Sonuçlara göre, bu protokol miRNA'nın iki farklı kene türünün, I. scapularis ve R. microplus'ın yetişkinlerinden izolasyonu için etkilidir ve potansiyel olarak diğer kene türlerinde de kullanılabilir. EV'lerin konsantrasyonu (partiküller / mL) NTA ile ölçüldü. R. microplus için, her cinsiyet ve yaşam aşaması, üç teknik kopyada ölçülen ü...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles at JoVE.com

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

Mevcut protokol, mikroRNA'ların kene tükürük bezlerinden ve saflaştırılmış hücre dışı veziküllerden izolasyonunu tanımlamaktadır. Bu, yaygın olarak kullanılan reaktifleri ve sarf malzemelerini birleştiren evrensel bir prosedürdür. Yöntem aynı zamanda az sayıda kene kullanımına izin verir, bu da kolayca sıralanabilen kaliteli mikroRNA'larla sonuçlanır.

MikroRNA'ların Kene Ex Vivo Tükürük Bezi Kültürlerinden ve Hücre Dışı Veziküllerden İzolasyonu

Ticks are important ectoparasites that can vector multiple pathogens. The salivary glands of ticks are essential for feeding as their saliva contains many ...

Bu protokol, koloni bakım maliyetini düşüren ve kene beslenmesi için gereken omur hayvanlarının sayısını azaltan daha az sayıda kene kullanmamıza izin verir. Bu protokol yaklaşık 20 kene gerektirir. Bununla birlikte, küçük bir örneklem büyüklüğü kullanmanın yanı sıra ana avantaj, bu protokolün birden fazla kene türüne ve farklı yaşam aşamalarına uygulanabilmesidir.Kene diseksiyonları veya konakçı-parazit etkileşimlerine yönelik uygulamanın yanı sıra, patojen enfeksiyonun mikroRNA sekresyonuna etkisi ve fizyolojik değişikliklerin keneler tarafından salgılanan mikroRNA üzerindeki etkisi. Başlamak için, 26.3 mililitrelik bir polikarbonat santrifüj şişesine fetal sığır serumu, triptoz fosfat suyu,% 10 lipoprotein kolesterol konsantresi,% 5 sodyum bikarbonat, HEPES ve L15C300 ortamı ekleyerek vezikülsüz ortam hazırlayın ve hacmi gerektiği gibi ayarlayın. Şimdi ortamı 18 saat boyunca dört santigrat derecede 100.000 kez G'de ultrasantrifüj yapın.Peleti rahatsız etmeden süpernatantı dikkatlice çıkarın ve süpernatantı taze bir santrifüj tüpüne aktarın. Tüpü bir kez daha ultrasantrifüj yapın. Süpernatantı alın ve kirleticileri gidermek için 0,22 mikrometrelik bir filtreden geçirin.Süpernatantı 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne pipetleyin ve gerekene kadar veya üç yıla kadar eksi 20 santigrat derecede saklayın. 24 delikli bir kültür plakasının her bir kuyucuğundaki 500 mikrolitre vezikülsüz ortama uygun miktarda antibiyotik ekleyin. Şimdi, bakteriyel büyümeyi önlemek için vezikülsüz ortam içermeyen kuyucuklara rifampisin içeren PBS ekleyin.Keneler, diseksiyon mikroskobu altında çift taraflı halı bandı ile bir cam slayt üzerine yerleştirin. Diseksiyondan önce, kene rifampisin içeren PBS ekleyin ve dört milimetre Vannas makası kullanarak, her dişinin yanında yaklaşık bir milimetrelik bir kesi yapın. Şimdi, kenenin sırt tarafını ve tükürük bezlerini çıkarın, ardından 24 kuyucuklu doku kültürü ile muamele edilmiş bir plakada tek bir kuyucuğa eklenen 500 mikrolitre vezikülsüz ortama 20 ila 40 kene tükürük bezi koyun.Hücre dışı veziküllerin salgılanmasına izin vermek için tükürük bezi örneklerini 24 saat boyunca 32 santigrat derecede inkübe edin. Kuluçkanın sonunda, tükürük bezlerini içeren tüm ortamları 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne pipetleyin ve 10 dakika boyunca dört santigrat derecede 300 kez G'de santrifüj yapın. Süpernatantı yeni bir 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpe aktarın.Tükürük bezlerini içeren peleti RNA'da daha sonra yeniden askıya alın ve kullanılıncaya kadar veya süresiz olarak eksi 80 santigrat derecede saklayın. Şimdi, süpernatantı 10 dakika boyunca dört santigrat derecede 2.000 kez G'de santrifüj yaparak hücresel kalıntıları çıkarın ve süpernatantı yeni bir 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne pipetleyin. Daha sonra, apoptotik cisimleri ve daha büyük hücre dışı vezikülleri çıkarmak ve süpernatantı taze bir 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarmak için dört santigrat derecede 30 dakika boyunca 10.000 kez G'de santrifüj yapın.Daha sonra 10 mililitrelik bir şırınga üzerine bir mikrometre naylon şırınga filtresi monte edin ve ultrasantrifüj tüpünde tutun. Ardından numuneyi ekleyin ve şırıngayı 10 mililitre PBS ile doldurun. Süpernatantı filtreden tüpe geçirin.Tüpleri filtreledikten ve dengeledikten sonra, bunları 70 Ti'lik bir rotora yerleştirin ve tüpleri dört santigrat derecede 18 saat boyunca 100.000 kez G'de ultrasantrifüj yapın. Konsantre hücre dışı veziküller, ultrasantrifüjlemeden sonra bir pelet oluşturur. Peleti rahatsız etmeden süpernatantı çıkarın ve peleti PBS'de yeniden askıya alın.Hücre dışı vezikülün 500 mikrolitresini 300 K santrifüj filtreye pipetleyin ve ortam sıcaklığında 10 dakika boyunca 8.000 kez G'de santrifüj yapın ve tüm hücre dışı veziküller filtrelenene kadar bu prosedürü tekrarlayın. Son olarak, kolona 400 mikrolitre sterilize PBS ekleyin ve membrana bağlı hücre dışı vezikülleri çıkarmak için iyice karıştırın. Daha sonra numuneyi 1.5 mililitrelik DNAaz RNAse serbest tüpüne koyun.Hücre dışı veziküllerin konsantrasyonu ve büyüklüğü, cinsiyete ve kadınlar, erkekler ve nimfler için biyolojik kopyalar arasındaki kenelerin yaşam aşamasına bağlı olarak değişmiştir. Tüm kombine biyolojik replikalar için benzer sonuçlar gözlenmiştir. Tükürük bezinden izole edilen küçük RNA'ların analizi, ribozomal RNA ve mikroRNA'lara karşılık gelen bantları gösterdi.Bununla birlikte, tükürük bezlerinden izole edilen veziküllerde ribozomal RNA'lar yoktu ve hücre dışı veziküllerden saflaştırılmış mikroRNA örnekleri daha fazla bozulma gösterdi. Zenginleştirmeden sonra, EV'lerden saflaştırılan mikroRNA örnekleri, cDNA kütüphanesi sentezi için minimum bozulma ve yeterli mikroRNA konsantrasyonu gösterdi. cDNA kütüphanesi hazırlığı elde edildikten sonra yaklaşık 150 baz çiftinin beklenen bant boyutu, küçük RNA cDNA kütüphanelerini gösterir.Vezikülsüz hazırlık sırasında, dış vezikül kontaminasyonunu önlemek için adımları izlediğinizden emin olun. İyi plaka hazırlığı sırasında, kene mikrobiyomundan bakteriyel kontaminasyonu önlemek için antibiyotik eklediğinizden emin olun. Bu protokol kullanılarak ekstrakte edilen mikroRNA'lar, mikroRNA yol hedeflerini tahmin etme, inhibisyon ve taklit deneyleri gibi mikroRNA rollerini doğrulamak için profilleme ve fonksiyonel deneyler için kullanılabilir.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells

Fare Tükürük Bezi Kök Hücre İzolasyonu

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of ...

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

Dan Ekstrasellüler Akışkan Vampiric İzolasyonu<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The genetically tractable model organism C. elegans has provided insights into a myriad of biological questions, enabled by its short generation time, ...

Isolation of Basal Cells and Submucosal Gland Duct Cells from Mouse Trachea

Fare Trakea gelen Bazal Hücre ve Submukozal Bezi Kanal Hücre İzolasyonu

The large airways are directly in contact with the environment and therefore susceptible to injury from toxins and infectious agents that we breath in 1. ...

Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures

Tükürük Bezi Organ Kültürleri Genetik Modifikasyon ve Rekombinasyon

Branching  morphogenesis occurs during the development of many organs, and the embryonic  mouse submandibular gland (SMG) is a classical model for the ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

İlköğretim İnsan fibroblast Kültürler gelen naif Erişkin Kök Hücre İzolasyon

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Isolation of Intact, Whole Mouse Mammary Glands for Analysis of Extracellular Matrix Expression and Gland Morphology

Sağlam, Bütün fare meme dokuları yalıtım hücre dışı matriks ifade ve bezi Morfoloji analizi için

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal ...

Isolation of Retinal Arterioles for Ex Vivo Cell Physiology Studies

Isolation of Retinal Arterioles for Ex Vivo Cell Physiology Studies

Retina arteriyoller yalıtım Ex Vivo Hücre fizyolojisi çalışmaları için

The retina is a highly metabolically active tissue that requires a substantial blood supply. The retinal circulation supports the inner retina, while the ...

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

Hücre şartına ortamdan hücre dışı veziküller sitometrik analizinde akışı

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Arınma ve Caenorhabditis elegans Ekstrasellüler Veziküllerin Analizi

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Ölçeklenebilir İzolasyon ve Escherichia coli ve Diğer Bakterilerden Hücre Dışı Veziküllerin Saflaştırılması

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...