Name: a heterotopic mouse model for studying laryngeal transplantation
Uploaded: 2023-01-13T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Heterotopic Mouse Model for Studying Laryngeal Transplantation at JoVE.com

Wir danken Randall Raish für seine hervorragende Videographie und Bearbeitungshilfe.

Diese Forschung wurde in Übereinstimmung mit dem Mayo Clinic Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) durchgeführt. BalbC-Mäuse (10-12 Wochen alt) wurden als Spender verwendet und C57/BL6-Mäuse (10-12 Wochen alt) wurden als Empfänger verwendet, da ihre Haupthistokompatibilitätskomplexe H-2Db bzw. H-2Kb immunologisch inkompatibel sind und daher die Immunantwort auf das Transplantat weiter untersucht werden kann. Alle Instrumente, die während der Operation verwendet wurden, wurden sterilisiert (siehe Erg?...

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	<li>Strome, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laryngeal+transplantation+and+40-month+follow-up.">Laryngeal transplantation and 40-month follow-up.</a> The New England Journal of Medicine. 344 (22), 1676-1679 (2001).</li><li>Hilgers, F. J. M., Ackerstaff, A. H., Aaronson, N. K., Schouwenburg, P. F., Zandwijk, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+and+psychosocial+consequences+of+total+laryngectomy.">Physical and psychosocial consequences of total laryngectomy.</a> Clinical Otolaryngology. 15 (5), 421-425 (1990).</li><li>Heyes, R., Iarocci, A., Tchoukalova, Y., Lott, D. 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Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+mouse+model+for+studying+laryngeal+transplantation.">New mouse model for studying laryngeal transplantation.</a> Annals of Otology, Rhinology &amp; Laryngology. 118 (6), 465-468 (2009).</li><li>Strome, M., Wu, J., Strome, S., Brodsky, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+preservation+techniques+in+a+vascularized+rat+laryngeal+transplant+model.">A comparison of preservation techniques in a vascularized rat laryngeal transplant model.</a> The Laryngoscope. 104 (6), 666-668 (1994).</li><li>Nocini, R., Molteni, G., Mattiuzzi, C., Lippi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Updates+on+larynx+cancer+epidemiology.">Updates on larynx cancer epidemiology.</a> Chinese Journal of Cancer Research. 32 (1), 18-25 (2020).</li><li>Strome, S., Sloman-Moll, E., Wu, J., Samonte, B. R., Strome, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+model+for+a+vascularized+laryngeal+allograft.">Rat model for a vascularized laryngeal allograft.</a> Annals of Otology, Rhinology &amp; Laryngology. 101 (11), (1992).</li><li>Work, W. P., Boles, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Larynx:+Replantation+in+the+dog.">Larynx: Replantation in the dog.</a> Archives of Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 82 (4), 401-402 (1965).</li><li>Birchall, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+for+experimental+revascularized+laryngeal+allotransplantation.">Model for experimental revascularized laryngeal allotransplantation.</a> British Journal of Surgery. 89 (11), 1470-1475 (2002).</li><li>Nakai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+model+of+laryngeal+transplantation+with+normal+circulation+maintained+by+combination+with+the+tongue.">Rat model of laryngeal transplantation with normal circulation maintained by combination with the tongue.</a> Microsurgery. 23 (2), 135-140 (2003).</li><li>Lott, D. G., Dan, O., Lu, L., Strome, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+laryngeal+allograft+survival+using+low-dose+everolimus.">Long-term laryngeal allograft survival using low-dose everolimus.</a> Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 142 (1), 72-78 (2010).</li><li>Lott, D. G., Russell, J. O., Khariwala, S. S., Dan, O., Strome, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ten-month+laryngeal+allograft+survival+with+use+of+pulsed+everolimus+and+anti-&#945;&#946;+T-cell+receptor+antibody+immunosuppression.">Ten-month laryngeal allograft survival with use of pulsed everolimus and anti-&#945;&#946; T-cell receptor antibody immunosuppression.</a> Annals of Otology, Rhinology &amp; Laryngology. 120 (2), 131-136 (2011).</li><li>Lott, D. G., Dan, O., Lu, L., Strome, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoy+NF-&#954;B+fortified+immature+dendritic+cells+maintain+laryngeal+allograft+integrity+and+provide+enhancement+of+regulatory+T+cells.">Decoy NF-&#954;B fortified immature dendritic cells maintain laryngeal allograft integrity and provide enhancement of regulatory T cells.</a> The Laryngoscope. 120 (1), 44-52 (2010).</li></ol>

Die Inzidenz und Prävalenz von Kehlkopfkrebs ist in den letzten drei Jahrzehnten um 12% bzw. 24% gestiegen, und viele dieser Patienten unterziehen sich einer Laryngektomie zur Behandlung10. Dieses Verfahren verschlechtert die Lebensqualität einer Person erheblich, und daher ist eine alternative Behandlung wünschenswert. Vaskularisierte Komposit-Allotransplantation des Kehlkopfes kann die Fähigkeit eines Patienten zu atmen und zu sprechen verbessern; Es ist jedoch noch Forschung erforderlich, b...

Bei Patienten mit irreparablen Kehlkopfschäden oder Kehlkopfkrebs ist eine totale Laryngektomie oft die einzige Option1. Die totale Laryngektomie lässt Patienten ohne die Fähigkeit, selbstständig zu atmen und zu sprechen, zusätzlich zu sozialer und psychischer Belastung2. Patienten mit Kehlkopfkrebs, die eine totale Laryngektomie benötigen, sind ausgezeichnete potenzielle Kandidaten für eine Kehlkopftransplantation. Während eine menschliche Kehlkopftransplantation im Rahmen irreparabler Kehlkopfschäden durchgeführt wurde, wird bei diesen Patienten derzeit eine Allotransplantation des Kehlkopfes aufgrund der Angst vor einem erneuten Tumorauftreten, der Möglichkeit einer chronischen Abstoßung und von Spendern abgeleiteten Infektionen vermieden3. Immunsuppression ist die Hauptursache für diese Bedenken. Der dramatische Verlust des ersten partiellen Kehlkopftransplantationspatienten aufgrund eines Tumorrezidivs nach konventioneller immunsuppressiver Behandlung ist ein Beweis dafür, dass ein geeignetes immunsuppressives Regime entwickelt werden sollte, bevor weitere Versuche zur Transplantation bei Kehlkopfkrebspatienten unternommen werden 4,5.
Um die Immunantwort des Wirts auf einen transplantierten Kehlkopf besser zu verstehen, wurde 1992 von Strome das erste Kehlkopftransplantationsmodell bei Ratten entwickelt, und 2002 wurden Verbesserungen an der Operationstechnik vorgenommen 6,7. Obwohl dieses Modell für die Untersuchung der Kehlkopftransplantation wirksam ist, führten der Mangel an rattenspezifischen immunologischen Wirkstoffen und die höheren Kosten, die mit Rattenmodellen verbunden sind, 2009 zur Entwicklung eines neuen Mausmodells zur Untersuchung der Kehlkopftransplantation8.
Die Hauptanwendung der beschriebenen Technik besteht darin, verschiedene immunsuppressive Medikamentenregime bei der Kehlkopftransplantation zu untersuchen. Die Verbesserung der derzeitigen immunsuppressiven Therapien könnte den Kandidatenpool erweitern und zu einer sicheren Transplantation bei Krebspatienten führen. Die Vorteile dieses Mausmodells sind seine Kosteneffizienz und die breite Verfügbarkeit immunologischer Daten und Reagenzien.
Teams, die an immunsuppressiven Behandlungsschemata für Kehlkopftransplantationen arbeiten, können diese Methode verwenden, um eine große Menge immunologischer Daten zu sammeln, und verschiedene Medikamentenregime können schnell getestet und verglichen werden. Andere mögliche Behandlungsmodalitäten, die die Immunantwort auf das Transplantat modulieren können, wie Stammzellinjektionen, können ebenfalls mit diesem Modell getestet werden. Schließlich können Experimente entwickelt werden, um langfristige systemische Effekte der Kehlkopftransplantation durch Verlängerung der Nachbeobachtungszeit zu beobachten.
Die hier beschriebene Technik verwendet End-to-Side-Anastomosen, um einen arteriellen und venösen Fluss zu einem heterotopen Kehlkopftransplantat bereitzustellen. Das Transplantat ist ein Laryngotracheoösophageal (LTE) -Komplex, der den Kehlkopf, die Schilddrüsen, die Nebenschilddrüsen, die Luftröhre und die Speiseröhre des Spenders umfasst, wobei die beidseitigen Halsschlagadern und Stiele intakt sind. Eine Spender-Halsschlagader ist zur Empfänger-Halsschlagader anastomosiert und sorgt für den arteriellen Blutfluss, während die andere Spender-Halsschlagader zur äußeren Jugularvene des Empfängers anastomosiert ist und venösen Blutfluss gewährleistet (Abbildung 1).
Mehrere Modifikationen wurden an der Operationstechnik des Rattenmodells vorgenommen, um den Erfolg im Mausmodell sicherzustellen. Zum Beispiel wurde ein inhalatives Anästhetikum anstelle eines injizierbaren Mittels verwendet, um die Kontrolle über die Tiefe der Anästhesie zu erhöhen und Komplikationen zu reduzieren. Kontinuierliches Nähen wird bei der arteriell-arteriellen Anastomose bei Ratten verwendet; Aufgrund der geringeren Größe der Mausgefäße ist dies jedoch technisch schwierig und kann zu einer Verengung des Gefäßlumensführen 7. Dadurch werden im Mausmodell unterbrochene Nähte verwendet, die zu einer verbesserten Gefäßdurchgängigkeit führen. Zusätzlich wird im Rattenmodell der Pedikel der Schilddrüsenarterie superior (STA) seziert und visualisiert. Angesichts der geringeren Größe der STA bei Mäusen könnte diese Dissektion zu einer Schädigung und sogar Durchtrennung der STA führen. Daher wird es im Mausmodell nicht seziert. Stattdessen bleibt die nahe gelegene Faszie erhalten, um sicherzustellen, dass die STA intakt bleibt.
Zu den wichtigsten möglichen Fallstricken dieser Technik gehören die Beschädigung der LTE-Komplexstiele des Spenders, eine falsch dimensionierte Arteriotomie oder Venotomie, ein Gefäßverschluss an den Anastomosestellen oder das Hinterlassen von Lücken an den Anastomosestellen, die Blutungen verursachen können. Um diese Fehltritte zu vermeiden, ist bei der Beschaffung des Spendertransplantats Vorsicht geboten, indem eine Gewebemanschette um den STA-Stiel herum belassen wird. Die Arteriotomie und Venotomie sollte groß genug sein, um den Blutfluss zu ermöglichen, aber klein genug, um ein Auslaufen zu verhindern. Eine angemessene Anzahl von Nähten sollte für die Anastomosen verwendet werden, um Lücken zu schließen, aber nicht zu viele, um die Gefäße zu verschließen.
Wenn Sie mit den mikrochirurgischen Techniken vertraut sind, kann dieses Verfahren in ca. 3 h durchgeführt werden. Dieses Kehlkopftransplantationsmodell kann zuverlässig an Mäusen durchgeführt und zur Untersuchung der Immunantwort des Wirts nach vaskularisierter Komposit-Allotransplantation verwendet werden.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>#1 Paperclips</td>
			<td>Staples</td>
			<td>OP-7404</td>
			<td>Clips are shaped manually to be used as retractors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 cc Insulin Syringes&#160;</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>329412</td>
			<td>27 G 5/8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-0 Ethilon Nylon Suture</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>2870G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 G Precision Glide Needle</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>305125</td>
			<td>1 in</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL Luer-Lok Tip Syringe</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G Sterile Standard Blunt Needles</td>
			<td>Cellink</td>
			<td>NZ5300505001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-0 Monocryl Suture</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>Y822G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-0 Ethilon Nylon Suture</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>2815G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adson Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11027-12</td>
			<td>Straight, 1 x 2 teeth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adventitia scissors</td>
			<td>S&#38;T</td>
			<td>SAS-10</td>
			<td>19 mm, 10 cm, straight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angled Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>00109-11</td>
			<td>45/11 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artifical Tears Lubricant Opthalmic Ointment</td>
			<td>Akorn Animal Health</td>
			<td>59399-162-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bandaid Fabric Fingertip</td>
			<td>Cardinal Healthcare</td>
			<td>299399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine Solution Swabsticks</td>
			<td>Purdue Products</td>
			<td>67618-153-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenex Injection</td>
			<td>CIII</td>
			<td>12495-0757-1</td>
			<td>0.3 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clamp applying forceps without lock</td>
			<td>Accurate Surgical &#38; Scientific Instruments</td>
			<td>ASSI.CAF5</td>
			<td>14 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Swabs</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>10806-001-PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DeBakey forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dermabond Mini</td>
			<td>Cardinal Healthcare</td>
			<td>315999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Boards</td>
			<td>Mopec</td>
			<td>22-444-314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Sterile Disposable Petri Dish&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25373-041</td>
			<td>35 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scisssors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14029-10</td>
			<td>Curved Sharp-Blunt 10 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Golden A5 2-Speed Blade Clipper&#160;</td>
			<td>Oster</td>
			<td>008OST-78005-140</td>
			<td>#10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair Remover Sensitive Formula</td>
			<td>Nair</td>
			<td>2260000033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin&#160;</td>
			<td>Meitheal Pharmaceuticals</td>
			<td>71288-4O2-10</td>
			<td>10,000 USP units per 10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Piramal Healthcare</td>
			<td>66794-013-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-Temp Micro Fine Tip Cautery</td>
			<td>Bovie Medical</td>
			<td>AA90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mercian Visibility Background Material</td>
			<td>Synovis Micro Companies</td>
			<td>VB3</td>
			<td>Green</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvascular Approximator Clamp without Frame</td>
			<td>Accurate Surgical &#38; Scientific Instruments</td>
			<td>ASSI.ABB11V</td>
			<td>0.4-1 mm Vessel Diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse face mask kit</td>
			<td>Xenotec</td>
			<td>XRK-S</td>
			<td>Small</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle holder</td>
			<td>S&#38;T</td>
			<td>C-14 W</td>
			<td>5.5&#34;, 8 mm, 0.4 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Press n&#39; Seal</td>
			<td>Glad</td>
			<td>70441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Braun</td>
			<td>BA210</td>
			<td>10 blade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Mini Vessel Clamp</td>
			<td>Accurate Surgical &#38; Scientific Instruments</td>
			<td>ASSI.ABB11M</td>
			<td>.31 (8 mm), 3 x 1 mm Rnd. Bl., Black Pair</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Alcohol Prep Pads</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>06-669-62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Disposable Drape Sheets</td>
			<td>Dynarex</td>
			<td>DYN4410-CASE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Gauze Pads</td>
			<td>Dukal</td>
			<td>1212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Saline&#160;</td>
			<td>Hospira</td>
			<td>236173</td>
			<td>NaCl 0.9%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Surgical Gloves</td>
			<td>Gammex</td>
			<td>851_A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>00108-11</td>
			<td>11 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue forceps</td>
			<td>Accurate Surgical &#38; Scientific Instruments</td>
			<td>ASSI.JFLP3</td>
			<td>13.5 cm, 8 mm, 0.3 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Pattern Scissors&#160;</td>
			<td>Accurate Surgical &#38; Scientific Instruments</td>
			<td>ASSI.SDC15RV</td>
			<td>15 cm, 8 mm, curved 7mm blade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-10</td>
			<td>3 mm cutting edge, curved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vessel Dilator Tip&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>00126-11</td>
			<td>Diameter 0.1 mm/Angled 10/11 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vessel Dilator, Classic line</td>
			<td>S&#38;T</td>
			<td>D-5a.3 W</td>
			<td>9 mm, 0.3 mm, angled 10</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a heterotopic mouse model for studying laryngeal transplantation

Die heterotope Larynxtransplantation ist zwar ein technisch anspruchsvolles Verfahren, bietet aber im Vergleich zu anderen Tiermodellen mehr wissenschaftliche Analyse und Kostenvorteile. Obwohl diese Technik erstmals 2009 von Shipchandler et al. beschrieben wurde, ist sie nicht weit verbreitet, möglicherweise aufgrund der Schwierigkeiten beim Erlernen der mikrochirurgischen Technik und der Zeit, die erforderlich ist, um sie zu beherrschen. Dieses Papier beschreibt die chirurgischen Schritte im Detail sowie mögliche Fallstricke, die es zu vermeiden gilt, um eine effektive Anwendung dieser Technik zu fördern.
In diesem Modell sind die bilateralen Halsschlagadern des Spenderkehlkopfes an die Empfänger-Halsschlagader und die äußere Halsvene anastomosiert, wodurch der Blutfluss durch das Transplantat ermöglicht wird. Der Blutfluss kann intraoperativ durch die Visualisierung der Blutfüllung in den bilateralen Halsschlagadern des Transplantats, der Rötung der Schilddrüsen des Transplantats und der Blutung aus Mikrogefäßen im Transplantat bestätigt werden. Zu den entscheidenden Elementen für den Erfolg gehören die schonende Konservierung der Transplantatgefäße, die richtige Arteriotomie und Venotomie sowie die Verwendung der entsprechenden Anzahl von Nähten an den arteriell-arteriellen und arteriell-venösen Anastomosen, um Gefäße ohne Leckagen zu sichern und Verschlüsse zu verhindern. 
Jeder kann dieses Modell mit ausreichender Ausbildung beherrschen und das Verfahren in ca. 3 h durchführen. Bei erfolgreicher Durchführung ermöglicht dieses Modell die einfache und kostengünstige Durchführung immunologischer Studien.

Bestätigung der erfolgreichen Transplantation Mit dem oben beschriebenen Protokoll ist es möglich, den Blutfluss zum LTE-Komplex zu beurteilen, indem die Pulsation der Spender-Halsschlagader nach Entfernung der Gefäßklemmen beobachtet wird. Die Pulsation ist typischerweise sichtbar, und die sofortige rote Färbung der Spenderarterie bestätigt den aktiven Blutfluss (Abbildung 4A). Wenn die Anastomose nicht wirksam ist, hat die Arterie keine Pulsation, sieht teilweise ...

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A Heterotopic Mouse Model for Studying Laryngeal Transplantation

Das Ziel dieses Manuskripts ist es, die mikrochirurgischen Schritte zu beschreiben, die erforderlich sind, um eine heterotope Kehlkopftransplantation bei Mäusen durchzuführen. Die Vorteile dieses Mausmodells im Vergleich zu anderen Tiermodellen der Kehlkopftransplantation sind seine Kosteneffizienz und die Verfügbarkeit immunologischer Assays und Daten.

Ein heterotopisches Mausmodell zur Untersuchung der Kehlkopftransplantation

Laryngeal heterotopic transplantation, although a technically challenging procedure, offers more scientific analysis and cost benefits compared to other ...

Kehlkopftransplantationsmodelle wurden bei Mäusen und Ratten beschrieben. Die frühere Arbeit von Senior Alter konzentrierte sich auf die Entwicklung einer effizienteren Methode unter Verwendung der Spender-Halsschlagadern für Anastomose, wodurch die Notwendigkeit entfällt, die oberen Schilddrüsenarterien zu sezieren. In diesem Video haben wir dieses Verfahren bei Mäusen beschrieben.Dieses Maus-Kehlkopftransplantationsmodell ermöglicht die einfache und kostengünstige Durchführung immunologischer Studien. Obwohl dieses Verfahren aufgrund der geringeren Größe der Gefäße im Vergleich zu einem Rattenmodell technisch anspruchsvoller ist, kann es in etwa drei Stunden durchgeführt werden, wenn man mit den chirurgischen Schritten vertraut ist. Nachdem das Tier vollständig betäubt ist, bringen Sie die Maus in den Rasierbereich, wo 1,5% Isofluran mit einem Liter Sauerstofffluss pro Minute über eine Gesichtsmaske zur Aufrechterhaltung der Anästhesie abgegeben wird.Bestätigen Sie die Tiefe der Anästhesie mit einer Zehenklemme. Rasieren Sie Brust und Hals der Maus bis zum Kiefer und tragen Sie eine Haarentfernungscreme auf. Wischen Sie die Creme nach 30 Sekunden ab und übertragen Sie die Maus in den Operationsbereich.Immobilisieren Sie die Maus und bereiten Sie den chirurgischen Bereich dreimal mit Povidon-Jod und Alkohol vor, dann drapieren Sie die Maus. Machen Sie einen kleinen horizontalen Einschnitt, der der suprasternalen Kerbe knapp überlegen ist. Heben Sie die Haut mit einer feinen Schere bilateral durch diesen Schnitt bis zum Unterkiefer an und schneiden Sie ein trapezförmiges Hautsegment heraus.Schneiden Sie die bilateralen Speicheldrüsen mit Kauter am oberen Teil heraus, wo eine kleine Vene durch die Drüse verläuft. Sezieren Sie die bilateralen sternocleidomastoideus Muskeln aus dem umgebenden Gewebe und ziehen Sie sie seitlich zurück. Machen Sie einen Mittellinienschnitt an den Riemenmuskeln und schneiden Sie sie bilateral aus, achten Sie darauf, die darunter liegende Schilddrüse nicht zu beschädigen und sie auf dem Laryngotracheal-Ösophagus- oder LTE-Komplex zu belassen.Nach diesem Schritt sind bilaterale Halsschlagadern sichtbar. Circumferentiell sezieren Sie die gemeinsamen Halsschlagadern auf die Ebene des Schlüsselbeins inferior und auf die Ebene der Carotisbifurkation superior. Der Vagusnerv und die Vena jugularis interna werden frei von den Halsschlagadern seziert und nicht in das beschaffte Transplantat einbezogen.Sezieren Sie die inneren und äußeren Halsschlagadern weit genug überlegen, um ligieren und teilen zu können. Mit einer 10-0-Nylonnaht ligieren Sie die inneren Halsschlagadern zwei bis drei Millimeter über der Karotisbifurkation. Ligieren Sie die äußeren Halsschlagadern mindestens drei Millimeter über dem Verzweigungspunkt der oberen Schilddrüsenarterie und ligieren Sie die gemeinsamen Halsschlagadern auf Höhe des Brustbeins.Schneiden Sie alle Likatgefäße bilateral ab. Halten Sie die Gefäßstiele auf dem LTE-Komplex, um versehentliche Schäden während der weiteren Dissektion zu vermeiden. Um Gasleckagen oder versehentlichen Verlust der Anästhesie zu vermeiden, stellen Sie sicher, dass das Tier abgelaufen ist, bevor Sie Atemwegsschnitte vornehmen.Transektieren Sie die Luftröhre unterhalb des fünften Trachealrings und tragen Sie den Schnitt durch die Speiseröhre hinunter zur prävertebralen Faszie, um den LTE-Komplex minderwertig zu befreien. Befreien Sie die Luftröhre und die Speiseröhre von der darunter liegenden prävertebralen Faszie von inferior bis superior. Erstellen Sie eine vordere Pharyngektomie, die dem Zungenbein unterlegen ist.Tragen Sie den Schnitt bis zur prävertebralen Faszie, um den LTE-Komplex besser zu befreien. Teilen Sie alle verbleibenden lymphatischen oder Bindegewebsansätze zwischen dem LTE-Komplex und dem umgebenden Gewebe auf. Und schließlich entfernen Sie das Transplantat.Legen Sie das beschaffte Transplantat in eine sterile Petrischale und waschen Sie es mit normaler Kochsalzlösung, um Blutgerinnsel loszuwerden. Erweitern Sie die bilateralen Halsschlagadern mit einem Millimeter Mikrodilatatoren. Injizieren Sie mit einer 30-Gauge-Nadel mit stumpfer Spitze etwa zwei Milliliter heparinisierte Kochsalzlösung in jede Halsschlagader, um das Transplantat zu spülen.Blut und Kochsalzlösung werden aus der kontralateralen Halsschlagader und den kleinen freien Gefäßenden gespült, was die intakten oberen Schilddrüsenarterien bestätigt. Das Transplantat kann in heparinisierter Kochsalzlösung belassen werden und eine kurze Pause kann bis zu drei Stunden eingelegt werden, bevor es in den Empfänger transplantiert wird. Bereiten Sie die Empfängermaus auf genau die gleiche Weise vor, wie sie für den Spender nach der Anästhesieeinleitung, der Rasur und der chirurgischen Vorbereitung beschrieben wurde.Injizieren Sie der Empfängermaus 30 Minuten vor Beginn der Operation subkutan ein Analgetikum mit verlängerter Freisetzung. Machen Sie mit einem Skalpell einen Mittellinien-Halsschnitt, der sich von der Kieferlinie überlegen bis zum Brustbein unterlegen erstreckt. Heben Sie die Haut auf der linken Seite an und ziehen Sie sie seitlich zurück.Schneiden Sie die linke Speicheldrüse heraus, die die oberen Gefäße wie zuvor beschrieben kauterisiert. Entfernen Sie das Fett- und Lymphgewebe, indem Sie alle sichtbaren Gefäße mit niedriger Temperatur kauterisieren. Achten Sie darauf, die darunter liegende äußere Halsvene nicht zu beschädigen.Sezieren Sie die äußere Halsvene umlaufend. Verwenden Sie mindestens fünf Millimeter klare Länge des Gefäßes für Anastomose. Sezieren Sie den Sternomastoideusmuskel und ziehen Sie ihn seitlich zurück.Circumferentiell sezieren Sie die Arteria carotis communis vom Schlüsselbein inferior bis zur Carotisbifurkation superior. Führen Sie das Hintergrundmaterial unter die äußere Halsvene und legen Sie die doppelt annähernden B-3-Gefäßklemmen an. Legen Sie eine 10-0-Nylonnaht durch die Vorderwand der äußeren Jugularvene an der Stelle der gewünschten Monotomie und verwenden Sie die Naht, um das Gefäß nach vorne zu ziehen.Schneiden Sie mit einer Mikroschere nur tief in die Naht, um die Erstellung der richtigen Einzelspaltvenotomie zu erleichtern und sicherzustellen, dass der Schnitt vollständig durch die Venenwand erfolgt. Spülen Sie das Innere der Vene mit einer 30-Gauge-Stumpfnadel mit heparinisierter Kochsalzlösung aus. Platzieren Sie den Spender-LTE-Komplex zwischen der linken Halsschlagader des Empfängers und der linken äußeren Halsvene.Richten Sie das freie Ende der linken Halsschlagader des Spenders auf die linke äußere Halsvene des Empfängers aus und fasen Sie das Ende mit einer scharfen Schere ab. Mit vier unterbrochenen 10-0-Nylonnähten anastomosierte der Spender die linke Halsschlagader und der Empfänger die äußere Halsvene Ende-zu-Seite. Schieben Sie das Hintergrundmaterial unter die gemeinsame Halsschlagader des Empfängers und wenden Sie die doppelten A-3-Gefäßklemmen an.Erstellen Sie eine Arteriotomie auf die gleiche Weise wie die Venotomie. Anastomose der rechten Halsschlagader des Spenders zur linken Halsschlagader des Empfängers in einer End-to-Side-Weise. Die Verwendung von sechs unterbrochenen Nähten mit 10-0 Nylon ist ideal für die arterielle Anastomose.Entfernen Sie die Klemmen auf der Venenseite. Wenn Blutungen auftreten, üben Sie sanften Druck mit Baumwollspitzen aus. Entfernen Sie die Klemmen an der Arterie und üben Sie sofort sanften Druck mit Baumwollspitzen aus.Es wird eine gewisse Blutung an der Stufe erwartet, die normalerweise nach einer Minute mit leichtem Druck aufhört. Überprüfen Sie die Integrität des Blutflusses in der Arterie in der Vene. Bei intaktem arteriellen Fluss ist normalerweise eine Pulsation der Spender-Halsschlagader zu sehen und die Schilddrüse des Spenders ändert sich von ihrer geröteten transparenten Farbe zurück zu ihrer ursprünglichen rötlichen Farbe.Auch eine rote Färbung der kleinen Gefäße auf dem LTE-Komplex ist zu beobachten. Schließen Sie den Hautschnitt mit 5-0 Monofilament-Naht laufend. Tragen Sie einen Hautkleber auf den Schnitt auf.Injizieren Sie einen Milliliter warme Kochsalzlösung subkutan, um den Flüssigkeitsverlust während der Operation zu berücksichtigen. Stoppen Sie die Anästhesie und bringen Sie die Maus in einen Erholungskäfig. Beobachten Sie die Maus auf einem Heizkissen, bis sie vollständig wach ist, um Unterkühlung zu vermeiden.Der Operationserfolg kann unmittelbar nach dem Entfernen der Gefäßklemmen beurteilt werden. Abbildung A ist repräsentativ für eine erfolgreiche Operation, da der Blutfluss in den Halsschlagadern des Spenderkehlkopfes sichtbar gemacht werden kann und die Schilddrüsen rot werden. Abbildung B ist repräsentativ für eine erfolglose Operation, da der Blutfluss in den Halsschlagadern des Spenderkehlkopfes nicht sichtbar ist und die Schilddrüsen blass blieben.Nach 15 Tagen ohne Immunsuppression haben die meisten Empfänger keinen Blutfluss zum Transplantat. Die Durchgängigkeit der Arterie kann makroskopisch beurteilt werden, indem der Laryngotracheal-Komplex frei vom umgebenden Empfängergewebe seziert und die End-to-Side-Anastomose sichtbar gemacht wird. Danke. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie verstehen, wie Sie einen laryngealen tracheoösophagealen Komplex in etwa drei Stunden heterotopisch von einer Maus zur anderen transplantieren können.Dieses praktikable und relativ kostengünstige Modell bietet ein erhebliches Potenzial bei der Untersuchung der Rolle des Immunsystems bei der Abstoßung des Laryngotracheal-Komplexes und bietet damit das Potenzial für neue Therapien bei der Organtransplantation.

Research

JoVE Journal

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