Name: preparation and characterization of graphene-based 3d biohybrid hydrogel bioink for peripheral neuroengineering
Uploaded: 2022-05-16T14:00:00
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Das in dieser Studie verwendete Graphen wurde an der Kirklareli University, Fakultät für Maschinenbau, entwickelt. Es wurde von Dr. Karabeyoğlu gespendet. Finanziert wurde der Graphen-Toxizitätstest durch das Projekt "Printing and Differentiation of Mesenchymal Stem Cells on 3D Bioprinters with Graphene Doped Bioinks" (Antrags-Nr.: 1139B411802273), das im Rahmen des TÜBİTAK 2209-B-Industry-Oriented Undergraduate Thesis Support Program durchgeführt wurde. Der andere Teil der Studie wurde durch den Forschungsfonds der Yildiz Technical University Scientific Research Projects (TSA-2021-4713) unterstützt. Mesenchymale Stammzellen mit GFP, die in der Zeitraffer-Bildgebung verwendet wurden, wurden von Virostem Biotechnology gespendet. Die Autoren danken dem Darıcı LAB und dem YTU The Cell Culture and Tissue Engineering LAB Team für die produktiven Diskussionen.

1. Kultivierung von mesenchymalen Stammzellen des Wharton-Gelees
<ol><li>Nehmen Sie die mesenchymalen Stammzellen des Wharton-Gelees (WJ-MSCs, aus ATCC) aus einem −80 °C heißen Gefrierschrank. Kultivieren Sie WJ-MSCs in DMEM-F12-Medium, das 10 % fetales Kälberserum (FBS), 1 % Pen-Streptokokken und 1 % L-Glutamin enthält, in einem sterilen laminaren Fluss bei Raumtemperatur, wie in Yurie et al.20 beschrieben.</li>
	<li>Kryokonservieren Sie einige der Zellen bei 1 x 106...

<ol>
	<li>Kamasak, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+Nerve+Injuries+and+Physiotherapy.">Peripheral Nerve Injuries and Physiotherapy.</a> Clinical Physiotherapy. 19, (2019).</li><li>Yegiyants, S., Dayicioglu, D., Kardashian, G., Panthaki, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traumatic+peripheral+nerve+injury:+A+wartime+review.">Traumatic peripheral nerve injury: A wartime review.</a> Journal of Craniofacial Surgery. 21 (4), 998-1001 (2010).</li><li>Mushtaq, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency+of+peripheral+nerve+injury+in+trauma+in+emergency+settings.">Frequency of peripheral nerve injury in trauma in emergency settings.</a> Cureus. 13 (3), 14195 (2021).</li><li>Allahverdiyev, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Basic Principles of Somatic and Stem Cell Culture Systems, 1st Edition. , (2018).</li><li>Allahverdiyev, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue-derived+mesenchymal+stem+cells+as+a+new+host+cell+in+latent+leishmaniasis.">Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells as a new host cell in latent leishmaniasis.</a> The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 85 (3), 535-539 (2011).</li><li>Schofield, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+between+the+spleen+colony-forming+cell+and+the+hemopoietic+stem+cell.">The relationship between the spleen colony-forming cell and the hemopoietic stem cell.</a> Blood Cells. 4 (1-2), 7-25 (1978).</li><li>Goodman, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+Cells+and+Regenerative+Medicine+(Chapter+13).">Stem Cells and Regenerative Medicine (Chapter 13).</a> Goodman's Medical Cell Biology, Fourth Edition. , 361-380 (2021).</li><li>Kaya, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineering.">Tissue engineering.</a> International Journal of Medical Sciences. 1 (48), 165-169 (2018).</li><li>Sensharma, P., Madhumathi, R. G., Jayant, R. D., Jaiswal, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomaterials+and+cells+for+neural+tissue+engineering:+Current+choices.">Biomaterials and cells for neural tissue engineering: Current choices.</a> Materials Science and Engineering: C. 7, 1302-1315 (2017).</li><li>H&#246;lzl, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioink+properties+before,+during,+and+after+3D+bioprinting.">Bioink properties before, during, and after 3D bioprinting.</a> Biofabrication. 8 (3), 032002 (2016).</li><li>Zheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2D+nanomaterials+for+tissue+engineering+and+regenerative+nanomedicines:+Recent+advances+and+future+challenges.">2D nanomaterials for tissue engineering and regenerative nanomedicines: Recent advances and future challenges.</a> Advanced Healthcare Materials. 10 (7), 2001743 (2021).</li><li>Shin, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graphene-based+materials+for+tissue+engineering.">Graphene-based materials for tissue engineering.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 105, 255-274 (2016).</li><li>Chen, M., Qin, X., Zeng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradation+of+carbon+nanotubes,+graphene,+and+their+derivatives.">Biodegradation of carbon nanotubes, graphene, and their derivatives.</a> Trends in Biotechnology. 35 (9), 836-846 (2017).</li><li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAM/GO/Gel/SA+composite+hydrogel+conduit+with+bioactivity+for+repairing+peripheral+nerve+injury.">PAM/GO/Gel/SA composite hydrogel conduit with bioactivity for repairing peripheral nerve injury.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 107, 1273-1283 (2019).</li><li>Chiriac, S., Facca, S., Diaconu, M., Gouzou, S., Liverneaux, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experience+of+using+the+bioresorbable+copolyester+poly(DL-lactide-&#949;-caprolactone)+nerve+conduit+guide+Neurolac&#8482;+for+nerve+repair+in+peripheral+nerve+defects:+Report+on+a+series+of+28+lesions.">Experience of using the bioresorbable copolyester poly(DL-lactide-&#949;-caprolactone) nerve conduit guide Neurolac&#8482; for nerve repair in peripheral nerve defects: Report on a series of 28 lesions.</a> Journal of Hand Surgery (European Volume). 37 (4), 342-349 (2011).</li><li>Karaaltin, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+olfactory+stem+cells+for+injured+facial+nerve+reconstruction+in+a+rat+model).">Human olfactory stem cells for injured facial nerve reconstruction in a rat model).</a> Head &amp; Neck. 38, 2011-2020 (2016).</li><li>Bingham, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+therapy+to+promote+limb+function+recovery+in+peripheral+nerve+damage+in+a+rat+model.">Stem cell therapy to promote limb function recovery in peripheral nerve damage in a rat model.</a> Annals of Medicine and Surgery. 41, 20-28 (2019).</li><li>Zhuang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gelatin-methacrylamide+gel+loaded+with+microspheres+to+deliver+GDNF+in+bilayer+collagen+conduit+promoting+sciatic+nerve+growth.">Gelatin-methacrylamide gel loaded with microspheres to deliver GDNF in bilayer collagen conduit promoting sciatic nerve growth.</a> International Journal of Nanomedicine. 11, 1383-1394 (2016).</li><li>Scheib, J., Hoke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+peripheral+nerve+regeneration.">Advances in peripheral nerve regeneration.</a> Nature Reviews: Neurology. 9 (12), 668-676 (2013).</li><li>Yurie, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficacy+of+a+scaffold-free+bio+3D+conduit+developed+from+human+fibroblasts+on+peripheral+nerve+regeneration+in+a+rat+sciatic+nerve+model.">The efficacy of a scaffold-free bio 3D conduit developed from human fibroblasts on peripheral nerve regeneration in a rat sciatic nerve model.</a> PLOS ONE. 12 (2), 0171448 (2017).</li><li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+the+green+florescence+protein+labeling+method+for+tracking+implanted+mesenchymal+stem+cells.">Assessment of the green florescence protein labeling method for tracking implanted mesenchymal stem cells.</a> Cytotechnology. 64 (4), 391-401 (2012).</li><li>Kose, C., Kacar, R., Zorba, A. P., Bagirova, M., Allahverdiyev, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+CO2+laser+beam+welded+AISI+316L+austenitic+stainless+steel+on+the+viability+of+fibroblast+cells,+in+vitro.">The effect of CO2 laser beam welded AISI 316L austenitic stainless steel on the viability of fibroblast cells, in vitro.</a> Materials Science and Engineering: C. 60, 211-218 (2016).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bio-adenine-bridged+molecular+design+approach+toward+non-covalent+functionalized+graphene+by+liquid-phase+exfoliation.">Bio-adenine-bridged molecular design approach toward non-covalent functionalized graphene by liquid-phase exfoliation.</a> Journal of Materials Science. 55, 140-150 (2020).</li><li>Rehman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+graphene+oxide+incorporated+GelMA+hydrogel+promotes+angiogenesis+for+wound+healing+applications.">Reduced graphene oxide incorporated GelMA hydrogel promotes angiogenesis for wound healing applications.</a> International Journal of Nanomedicine. 14, 9603-9617 (2019).</li><li>Bei, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graphene-based+nanocomposites+for+neural+tissue+engineering.">Graphene-based nanocomposites for neural tissue engineering.</a> Molecules. 24 (4), 658 (2019).</li><li>Othman, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alginate-gelatin+bioink+for+bioprinting+of+HeLa+spheroids+in+alginate-gelatin+hexagon-shaped+scaffolds.">Alginate-gelatin bioink for bioprinting of HeLa spheroids in alginate-gelatin hexagon-shaped scaffolds.</a> Polymer Bulletin. 78, 6115-6135 (2021).</li><li>Peng, X. L., Li, Y., Zhang, G., Zhang, F., Fan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionalization+of+graphene+with+nitrile+groups+by+cycloaddition+of+tetracyanoethylene+oxide.">Functionalization of graphene with nitrile groups by cycloaddition of tetracyanoethylene oxide.</a> Journal of Nanomaterials. 2013, 841789 (2013).</li><li>Zorba Yildiz, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+therapeutic+approaches+for+peripheral+nerve+damage.">3D therapeutic approaches for peripheral nerve damage.</a> 9th International Molecular Biology and Biotechnology Congress Abstract Book. , (2020).</li><li>Liau, L. L., Ruszymah, B. H. I., Ng, M. H., Law, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+and+clinical+applications+of+Wharton's+jelly-derived+mesenchymal+stromal+cells.">Characteristics and clinical applications of Wharton's jelly-derived mesenchymal stromal cells.</a> Current Research in Translational Medicine. 68 (1), 5-16 (2020).</li><li>Yoo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Augmented+peripheral+nerve+regeneration+through+elastic+nerve+guidance+conduits+prepared+using+a+porous+PLCL+membrane+with+a+3D+printed+collagen+hydrogel.">Augmented peripheral nerve regeneration through elastic nerve guidance conduits prepared using a porous PLCL membrane with a 3D printed collagen hydrogel.</a> Biomaterials Science. 22, 1-12 (2020).</li><li>Jansen, K., Meek, M. F., vander Werff, J. F. A., van Wachem, P. B., van Luyn, M. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+regeneration+of+the+rat+sciatic+nerve+through+a+biodegradable+poly+(DL-lactide-&#400;-caprolactone)+nerve+guide:+Tissue+reactions+with+a+focus+on+collagen+III/IV+reformation.">Long-term regeneration of the rat sciatic nerve through a biodegradable poly (DL-lactide-&#400;-caprolactone) nerve guide: Tissue reactions with a focus on collagen III/IV reformation.</a> Journal of Biomedical Materials Research. 69 (2), 334-341 (2016).</li><li>Pathre, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTP1B+regulates+neurite+extension+mediated+by+cell-cell+and+cell-matrix+adhesion+molecules.">PTP1B regulates neurite extension mediated by cell-cell and cell-matrix adhesion molecules.</a> Journal of Neuroscience Research. 15, 143-150 (2001).</li><li>Qing, L., Chen, H., Tang, J., Jia, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+their+microRNA+cargo:+New+players+in+peripheral+nerve+regeneration.">Exosomes and their microRNA cargo: New players in peripheral nerve regeneration.</a> Neurorehabilitation and Neural Repair. 32 (9), 765-776 (2018).</li></ol>

Die Vorteile von Behandlungen, die mit technischen 3D-Gerüsten gegenüber herkömmlichen 2D-Methoden angewendet werden, werden von Tag zu Tag deutlicher. Stammzellen, die allein in diesen Therapien oder zusammen mit Gerüsten aus verschiedenen Biomaterialien mit geringer Biokompatibilität und biologischer Abbaubarkeit hergestellt werden, sind in der Regel unzureichend für die periphere Nervenregeneration. Die mesenchymalen Stammzellen des Wharton-Gelees (WJ-MSCs) scheinen eine geeignete Kandidatenzelllinie zu sein, in...

Das Nervensystem, der Mechanismus, der die innere Struktur des Organismus und die Umwelt verbindet, ist in zwei Teile unterteilt: das zentrale und das periphere Nervensystem. Periphere Nervenschäden sind ein globales Problem, das 1,5 % bis 5 % der Patienten ausmacht, die sich in der Notaufnahme vorstellen und sich aufgrund verschiedener Traumata entwickeln, was zu einem erheblichen Verlust des Arbeitsplatzes führt 1,2,3.
Heute sind zelluläre Ansätze des peripheren Neuro-Engineerings von großem Interesse. Stammzellen stehen bei diesen Ansätzen an erster Stelle. Unter normalen Bedingungen sind Stammzellen die regenerativen Zellen des Körpers, und ihre Anzahl und Funktionen nehmen mit der Zeit nicht ab, um ihre Populationen zu schützen. Diese Zellen sind spezialisiert, können sich aber bei entsprechender Stimulation als Reaktion auf eine Verletzung differenzieren 4,5. Nach der Stammzellhypothese steht das Stammzellsystem unter dem Einfluss seiner Mikroumgebung, der sogenannten Stammzellnische. Die Konservierung und Differenzierung von Stammzellen ist ohne das Vorhandensein ihrer Mikroumgebung6 nicht möglich, die durch Tissue Engineering mit Hilfe von Zellen und Scaffolds7 rekonstituiert werden kann. Tissue Engineering ist ein multidisziplinäres Gebiet, das sowohl ingenieurwissenschaftliche als auch biologische Prinzipien umfasst. Tissue Engineering bietet Werkzeuge für die Herstellung von künstlichem Gewebe, das lebendes Gewebe ersetzen kann und bei der Regeneration dieses Gewebes verwendet werden kann, indem das beschädigte Gewebe entfernt und funktionsfähiges Gewebe bereitgestellt wird8. Gewebegerüste, einer der drei Eckpfeiler des Tissue Engineering, werden mit unterschiedlichen Methoden aus natürlichen und synthetischen Materialien hergestellt9. Der dreidimensionale (3D) Druck ist eine aufstrebende additive Fertigungstechnologie, die häufig eingesetzt wird, um defektes Gewebe durch die einfache, aber vielseitige Herstellung komplexer Formen mit verschiedenen Methoden zu ersetzen oder wiederherzustellen. Bioprinting ist ein additives Fertigungsverfahren, das die Koexistenz von Zellen und Biomaterialien ermöglicht, sogenannte Biotinten10. Unter Berücksichtigung der Interaktion von Nervenzellen untereinander haben sich die Studien auf leitfähige Biomaterialkandidaten wie Graphen verlagert. Graphen-Nanoplatten, die Eigenschaften wie flexible Elektronik, Superkondensatoren, Batterien, Optiken, elektrochemische Sensoren und Energiespeicherung aufweisen, sind ein bevorzugtes Biomaterial im Bereich des Tissue Engineering11. Graphen wurde in Studien verwendet, in denen die Proliferation und Regeneration von geschädigten Geweben und Organen durchgeführt wurde12,13.
Tissue Engineering besteht aus drei Grundbausteinen: Gerüst, Zellen und Biosignalmoleküle. Es gibt Defizite in den Studien zur peripheren Nervenschädigung in Bezug auf die vollständige Bereitstellung dieser drei Strukturen. Bei den in den Studien hergestellten und verwendeten Biomaterialien sind verschiedene Probleme aufgetreten, wie z. B. dass sie nur Stammzellen oder Biosignalmoleküle enthalten, das Fehlen eines bioaktiven Moleküls, das die Differenzierung von Stammzellen ermöglicht, die mangelnde Biokompatibilität des verwendeten Biomaterials und die geringe Auswirkung auf die Proliferation von Zellen in der Gewebenische. und somit wird die Nervenleitung nicht vollständig realisiert 2,13,14,15,16. Dies erfordert die Optimierung der Nervenregeneration, die Verringerung des Muskelschwunds 17,18 und die Schaffung der notwendigen Zielsuche19 mit Wachstumsfaktoren gegen solche Probleme. An dieser Stelle ist die Charakterisierung und Analyse der Neuroaktivität eines chirurgischen Biomaterial-Prototyps, der in die Klinik übertragen werden soll, sehr wichtig.
Dementsprechend untersucht diese Methodenstudie die Biotinten-Hydrogel-Strukturierung mit Graphen-Nanoplatten, die von einem 3D-Biodrucker gebildet werden, und ihre Wirksamkeit auf die neurogene Differenzierung der darin enthaltenen Stammzellen. Außerdem werden die Auswirkungen von Graphen auf die Bildung und Differenzierung von Neurosphären untersucht.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td> 
			Centrifugal</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td></td>
			<td>Used in cell culture and biomaterial step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1N CaCl2</td>
			<td>HD Bioink</td>
			<td></td>
			<td>Used for crosslinker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m membrane filter</td>
			<td>A&#953;s&#953;mo</td>
			<td></td>
			<td>Used for sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m syringe filter</td>
			<td>A&#953;s&#953;mo</td>
			<td></td>
			<td>Used for sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5mL conic tube</td>
			<td>Eppendorfa</td>
			<td></td>
			<td>Used for bioink drop</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15mL Falcon tube</td>
			<td>Nest</td>
			<td></td>
			<td>Used in cell culture step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks</td>
			<td>Nest</td>
			<td></td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D Bioprinting</td>
			<td>Axolotl Biosystems Bio A2 (Turkey)</td>
			<td></td>
			<td>Bioprinting Step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tube</td>
			<td>Nest</td>
			<td></td>
			<td>Used in cell culture step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6/24/48/96 well plates (Falcon, TPP microplates)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td></td>
			<td>Used in cell culture step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks</td>
			<td>Nest</td>
			<td></td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti mouse IgG-FTIC-rabbit</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>J1514</td>
			<td>Seconder antibody, used for dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti mouse IgG-SC2781-goat</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>C3109</td>
			<td>Seconder antibody, used for dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Au coating device EM ACE600</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>for gold plating of biomaterial section before SEM imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>NUVE-OT 90L</td>
			<td></td>
			<td>Used for the sterilization process.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>NUVE-OT 90L</td>
			<td></td>
			<td>Used for the sterilization process.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Cultre Cabine</td>
			<td>Hera Safe KS</td>
			<td></td>
			<td>Used for the cell culture process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium/Nutrient Mixture-F12</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>RNBJ7249</td>
			<td>Used as cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FEI QUANTA 450 FEG ESEM SEM</td>
			<td>Quanta</td>
			<td>FEG 450</td>
			<td>for SEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum-FBS</td>
			<td>Capricorn</td>
			<td>FBS-16A</td>
			<td>It was used by adding to the cell culture medium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer -80&#176;C</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MDF-U5386S-PE</td>
			<td>We were used to store cells and the resulting exosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatine-Alginate bioink powder</td>
			<td>HD Bioink</td>
			<td></td>
			<td>Used for produced bioink step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP labelled-WJ-MSCs</td>
			<td>Virostem</td>
			<td></td>
			<td>Used for imaging to cell-bioink interaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphene nanoplatelets (Graphene-IGP2)</td>
			<td>Grafen Chemical Industries Co.</td>
			<td></td>
			<td>Used for production 3D-G bioink</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunofluorescence antibodies (N-CAD; &#946;-III Tubulin)</td>
			<td>Cell Signalling and Santa Cruz</td>
			<td></td>
			<td>Used for dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JASCO 6600</td>
			<td>Tetra</td>
			<td></td>
			<td>for FTIR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTT Assay</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td>Viability testing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin/Streptomycin Solution</td>
			<td>Capricorn</td>
			<td>PB-S</td>
			<td>It was added to the medium to prevent contamination in cell culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thoma slide</td>
			<td>Isolab</td>
			<td></td>
			<td>Used for counting the cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Time-Lapse Imaging System</td>
			<td>Zeiss Axio.Observer.Z1</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tripsin-EDTA</td>
			<td>Multicell</td>
			<td></td>
			<td>The flask was used to remove the cells covering the surface.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vorteks</td>
			<td>Biobase</td>
			<td></td>
			<td>For produced bioink step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WJ-MSCs</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td>Used for the cell culture process</td>
		</tr>
	</tbody>
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preparation and characterization of graphene-based 3d biohybrid hydrogel bioink for peripheral neuroengineering

Periphere Neuropathien können als Folge einer axonalen Schädigung und gelegentlich aufgrund von demyelinisierenden Erkrankungen auftreten. Periphere Nervenschäden sind ein globales Problem, das bei 1,5 % bis 5 % der Notfallpatienten auftritt und zu erheblichen Arbeitsplatzverlusten führen kann. Heute sind auf Tissue Engineering basierende Ansätze, die aus Gerüsten, geeigneten Zelllinien und Biosignalen bestehen, mit der Entwicklung dreidimensionaler (3D) Bioprinting-Technologien anwendbarer geworden. Die Kombination verschiedener Hydrogel-Biomaterialien mit Stammzellen, Exosomen oder Biosignalmolekülen wird häufig untersucht, um die bestehenden Probleme bei der peripheren Nervenregeneration zu überwinden. Dementsprechend hat die Herstellung von injizierbaren Systemen, wie z.B. Hydrogelen, oder implantierbaren Conduit-Strukturen, die durch verschiedene Bioprinting-Methoden gebildet werden, im peripheren Neuro-Engineering an Bedeutung gewonnen. Unter normalen Bedingungen sind Stammzellen die regenerativen Zellen des Körpers, und ihre Anzahl und Funktionen nehmen mit der Zeit nicht ab, um ihre Populationen zu schützen. Dabei handelt es sich nicht um spezialisierte Zellen, sondern sie können sich bei entsprechender Stimulation als Reaktion auf eine Verletzung differenzieren. Das Stammzellsystem steht unter dem Einfluss seiner Mikroumgebung, der sogenannten Stammzellnische. Bei peripheren Nervenverletzungen, insbesondere bei Neurotmesis, kann dieses Mikromilieu auch nach chirurgischer Bindung durchtrennter Nervenenden nicht vollständig gerettet werden. Der Ansatz von Verbundbiomaterialien und kombinierten zellulären Therapien erhöht die Funktionalität und Anwendbarkeit von Materialien in Bezug auf verschiedene Eigenschaften wie biologische Abbaubarkeit, Biokompatibilität und Verarbeitbarkeit. Dementsprechend zielt diese Studie darauf ab, die Herstellung und Verwendung von Graphen-basiertem biohybridem Hydrogel-Patterning zu demonstrieren und die Differenzierungseffizienz von Stammzellen zu Nervenzellen zu untersuchen, was eine effektive Lösung bei der Nervenregeneration sein kann.

Graphen-Toxizität und 2D-Bildgebung Die statistische Analyse der erhaltenen MTT-Ergebnisse wurde mit einer einfaktoriellen ANOVA mit dem Tukey-Test in einer statistischen Analysesoftware durchgeführt, und die erhaltene Grafik ist in Abbildung 2 dargestellt. Der Graphenanteil im Vergleich zur Kontrollgruppe zeigte nur für die Graphenkonzentration von 0,001 % (**p < 0,01) eine signifikante Abnahme. Es zeigten sich keine signifikanten Unterschiede zwischen den anderen Gru...

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Preparation and Characterization of Graphene-Based 3D Biohybrid Hydrogel Bioink for Peripheral Neuroengineering

In diesem Manuskript demonstrieren wir die Herstellung einer biohybriden Hydrogel-Biotinte, die Graphen für den Einsatz im peripheren Tissue Engineering enthält. Unter Verwendung dieses 3D-Biohybridmaterials wird das neuronale Differenzierungsprotokoll von Stammzellen durchgeführt. Dies kann ein wichtiger Schritt sein, um ähnliche Biomaterialien in die Klinik zu bringen.

Herstellung und Charakterisierung von Graphen-basierter 3D-Biohybrid-Hydrogel-Biotinte für das periphere Neuroengineering

Peripheral neuropathies can occur as a result of axonal damage, and occasionally due to demyelinating diseases. Peripheral nerve damage is a global ...

Das Stammzellsystem steht unter dem Einfluss seiner wichtigen Bestandteile. Die Erhaltung und Differenzierung von Stammzellen ist ohne die Anwesenheit ihrer Mikroumgebung undenkbar. Diese Mikroumgebung, die als Stammzellnische bezeichnet wird, besteht aus Zellen und Gerüsten.Periphere Neuropathie kann sein, und gelegentlich können sie wie eine Verletzung des Brachii-Plexus, verschiedene Traumata, Tumore, autonome Anomalien, Immundefinition und Stoffwechselerkrankungen auftreten. Es wurden verschiedene 3D-Kulturmethoden entwickelt, um eine bessere und natürlichere Nische für die Stammzellen zu schaffen. Sphäroidbildung und 3D-Bioprinting sind relativ neue und vielversprechende Methoden für 3D-Kulturen.Der 3D-Biodruck kann auch in neurotechnischen Studien eingesetzt werden. Folglich wurden im Rahmen dieser Studie Graphen- und Alginat/Gelatine-basierte Biotinten entwickelt und auf ihre regenerativen Eigenschaften hin untersucht. Kultivieren Sie zunächst mesenchymale Stammzellen oder WJMSCs von Wharton's Jelly in DMEM F12-Medium, das 10 % fetales Kälberserum oder FBS, 1 % Pen/Streptokokken und 1 % L-Glutamin enthält, unter einem sterilen laminaren Fluss bei Raumtemperatur.Wenn die kultivierten Zellen im Kolben zu 80 % konfluent sind, gießen Sie das Medium ein und waschen Sie die Zellen mit fünf Millilitern PBS. Dann fünf Milliliter 0,25%iges Trypsin und 2,21 millimolare Natrium-EDTA zugeben und bei 37 Grad Celsius inkubieren. Geben Sie nach fünf Minuten 10 Milliliter DMEM F12 Medium mit 10 % FBS in die Zellen.Suspendieren Sie die Zellen, sammeln Sie das Medium und füllen Sie es in ein Zentrifugenröhrchen. Als nächstes zentrifugieren Sie die Zellen und entsorgen den Überstand, bevor Sie die Zellen in einem neuen Kolben mit einem frischen Nährmedium mit 10 % FBS neu aussäen. Um die Biotinte der Kontrollgruppe ohne Graphen herzustellen, wiegen Sie 4,5 Milligramm Alginat und 1,5 Milligramm Gelatine ab und überführen Sie sie in ein Zentrifugenröhrchen.Geben Sie dann 50 Milliliter DMEM F12 Medium mit 10 % FBS in das Röhrchen. Wiegen Sie erneut 4,5 Milligramm Alginat und 1,5 Milligramm Gelatine ab und geben Sie sie in ein Zentrifugenröhrchen. Geben Sie dann 50 Mikroliter 0,1%Graphen in das Röhrchen und machen Sie das Volumen auf 50 Milliliter mit DMEM F12 Medium mit 10%FBS.Mischen Sie die Biotinten durch Pipettieren und Vortexen, bevor Sie sie bei 121 Grad Celsius unter 1,5 Grad autoklavieren. atmosphärischen Druck für 20 Minuten. Zentrifugieren Sie die Lösung nach dem Autoklavieren, um gebildete Blasen zu entfernen, und platzieren Sie die Biotinten bei 37 Grad Celsius, bis die Zellen vorbereitet sind.Erstellen Sie für die Interaktion mit der Zell-Biotinte die Biotintengruppen. Gruppe eins umfasst 3D-B und 3D-G, die mit Biotinte für das Bioprinting gedruckt wurden. Gruppe zwei umfasst 3D-BS- und 3D-GS-Biotinten, auf denen nach dem Bioprinting Sphäroide gebildet wurden.Zählen Sie für Gruppe eins die Zellen auf eins mal 10 bis zur siebten Zelle in 0,5 Milliliter Medium. Fügen Sie dann 4,5 Milliliter Biotinte hinzu. Übertragen Sie die Mischung mit Spritzen in die Kartuschen im sterilen Schrank.Setzen Sie die Kartuschen in den entsprechenden Extruderabschnitt des Bioprinters ein. Für die zweite Gruppe entnehmen Sie fünf Milliliter Biotinte aus jeder der Biotintengruppen und überführen sie mit Hilfe eines Injektors in sterile Kartuschen. Nutzen Sie den Bioprinter mit zwei koaxialen Druckköpfen und der pneumatisch angetriebenen Extrusionstechnologie.Stellen Sie die XYZ-Auflösung pro Mikroschritt auf 1,25 Mikrometer, die Extrusionsbreite auf 400 Mikrometer und die Extrusionshöhe auf 200 Mikrometer ein. Verwenden Sie ein Raster von 20 x 20 x 5 Millimetern, um 3D-Modelle zu erstellen. Erstellen Sie 3D-Modelle mit webbasierten Open-Source-CAD-Programmen.Stellen Sie für den 3D-Bioprinting-Prozess den durchschnittlichen Druck des Druckers auf 7,5 psi ein. Stellen Sie dann die Patronen- und Betttemperatur auf 37 Grad Celsius und die Geschwindigkeit auf 60 % einBringen Sie das System während der Schreibphase in die Ausgangsposition. Positionieren Sie die Achsen automatisch und wählen Sie den Extruder aus und stellen Sie ihn ein, bevor Sie den Bioprinting-Prozess starten.Nehmen Sie die Probe nach dem Druck heraus und legen Sie sie unter eine Laminar-Flow-Kabine. Als nächstes sprühen Sie die Biotinten mit 0,1 normaler Calciumchloridlösung oder fügen Sie einen Milliliter Lösung mit einer Pipette bei Raumtemperatur hinzu und warten Sie 10 bis 20 Sekunden. Waschen Sie dann die gedruckten Muster zweimal mit PBS, das Kalzium und Magnesium enthält.Auf jede Zelle, die die Biotintengruppe enthält, werden zwei Milliliter DMEM F12 Medium mit 10 % FBS gegeben und die Platten bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid 30 Minuten lang inkubiert. Als nächstes fügen Sie jeder Gruppe zwei Milliliter Suspensionsmedium hinzu, das eine bis 10 bis sechste Zellen enthält, und inkubieren Sie die Platten. Beobachten und fotografieren Sie nach 24 Stunden alle Chargen von Biotinte für die Sphäroidbildung unter einem inversen Mikroskop für die Differenzierung von WJMSCs zu neuronenähnlichen Zellen mit Ausnahme der Kontrollgruppe.Fügen Sie zwei Milliliter neurogenes Differenzierungsmedium pro Vertiefung hinzu und erneuern Sie es alle zwei Tage. Sieben Tage lang beobachten, um die neuronale Differenzierung zu beobachten. Untersuchen Sie anschließend mithilfe von Zeitrafferaufnahmen die Auswirkungen von Graphen auf Stammzellen und überwachen Sie die Zellinteraktionen innerhalb der Biotinte.Der Einfluss der Graphenkonzentration auf die Zellproliferation wird hier demonstriert. Im Vergleich zur Kontrolle wurde eine signifikante Abnahme der Graphenkonzentration von 0,001 % beobachtet. Es gab keine signifikanten Unterschiede zwischen den anderen Gruppen und der Kontrolle.Die Zell-Graphen-Interaktionen zeigten, dass Graphen im 2D-System toleriert wurde und von den Zellen durch Endozytose aufgenommen wurde. Zeitrafferaufnahmen zeigten, dass Zellen, die im 3D-Graphenmedium überlebten, ihre Vitalität durch GFP-Helligkeit bis zum Ende der Inkubation beibehielten. REM-Bilder und FIIR-Analysen der 3D-B- und 3D-G-Biotintengruppen werden hier gezeigt.Interaktionen mit Biotintenzellen wurden sowohl an der Oberfläche als auch im Inneren demonstriert. Die Zellen waren morphologisch rund und mit dem Material verbunden. Bei der neuronalen 3D-Differenzierung wurde angenommen, dass die Grenzen der Sphäroidzellen in beiden Gruppen transparent und lebendig waren und die Sphäroide in der Graphengruppe relativ größer waren und das Graphen in der Zelle einfingen.Die Immunfärbung von 2D- und 3D-Zellen wird hier gezeigt. Die grünen Bilder stellen neuronenähnliche Strukturen dar. Die 2D-Positivkontrollprobe exprimierte weniger neuronenähnliche Strukturmarker als die 3D-Proben.Wir entdeckten, dass Graphen-basierte Biotinten erfolgreicher in Bezug auf die Differenzierung von Stammzellen in neuronenähnliche Zellen waren. Wir schlagen vor, dass Graphen-basierte Biotinten in weiteren Studien hervorragende Werkzeuge für die Behandlung peripherer Nervenerkrankungen sein würden. Heute kann das Stammzellsystem durch Tissue Engineering mit natürlichen und synthetischen Biomaterialien hergestellt werden. Die Herstellung von künstlichem Gewebe, das lebendes Gewebe ersetzen kann, das zur Regeneration dieser Gewebe, zur Beseitigung des Schadens und zur Bereitstellung von Funktion verwendet werden kann, wird durch Tissue Engineering bereitgestellt.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation

3D-Hydrogel Scaffolds für Articular Chondrozyten-Kultur und Knorpel-Generation

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer ...

Forschung

Biotechnik

Construction of Modular Hydrogel Sheets for Micropatterned Macro-scaled 3D Cellular Architecture

Bau von Modular Hydrogel Blätter für mikrostrukturierten Makro skaliert 3D Cellular Architektur

Hydrogels can be patterned at the micro-scale using microfluidic or micropatterning technologies to provide an in vivo-like three-dimensional (3D) tissue ...

Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink

Bioprinting cellularized Konstruiert unter Verwendung eines gewebespezifischen Hydrogel Bioink

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting von Knorpel und Haut-Gewebe-Analoga nutzen eine neuartige Passive Einheit Mischtechnik für Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Microhoneycomb Monoliths Prepared by the Unidirectional Freeze-drying of Cellulose Nanofiber Based Sols: Method and Extensions

Microhoneycomb Monolithen vorbereitet durch die unidirektionale Gefriertrocknung von Zellulose Nanofaser basierte Sols: Methode und Erweiterungen

Monolithic honeycomb structures have been attractive to multidisciplinary fields due to their high strength-to-weight ratio. Particularly, microhoneycomb ...

3D Printed Porous Cellulose Nanocomposite Hydrogel Scaffolds

3D-Druck poröse Zellulose Nanocomposites Hydrogel Gerüste

This work demonstrates the use of three-dimensional (3D) printing to produce porous cubic scaffolds using cellulose nanocomposite hydrogel ink, with ...

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

Pankreasgewebe-abgeleitete extrazelluläre Matrix Bioink für den Druck 3D-Zell-Laden Pankreasgewebe Konstrukte

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

Protocols of 3D Bioprinting of Gelatin Methacryloyl Hydrogel Based Bioinks

Protokolle des 3D-Bioprintings von Gelatine Methacryloyl Hydrogel-basierten Bioinks

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed ...

Using Multilayered Hydrogel Bioink in Three-Dimensional Bioprinting for Homogeneous Cell Distribution

Verwendung von mehrschichtigem Hydrogel Bioink im dreidimensionalen Bioprinting für homogene Zellverteilung

During the extrusion-based three-dimensional bioprinting process, liquid-like bioinks with low viscosity can protect cells from membrane damage induced by ...

Quantitative Characterization of Bioink Properties for Continuous DLP Printing

Quantitative Characterization of Liquid Photosensitive Bioink Properties for Continuous Digital Light Processing Based Printing

Quantitative Characterization of Liquid Photosensitive Bioink Properties for Continuous Digital Light Processing Based Printing (Video) | JoVE 

Quantitative Charakterisierung der Eigenschaften von flüssigen lichtempfindlichen Biotinten für den kontinuierlichen digitalen Lichtverarbeitungsdruck

Precise printing fabrication of bioinks is a prerequisite for tissue engineering; the Jacobs working curve is the tool to determine the precise printing ...