Name: preparation and characterization of graphene-based 3d biohybrid hydrogel bioink for peripheral neuroengineering
Uploaded: 2022-05-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Characterization of Graphene-Based 3D Biohybrid Hydrogel Bioink for Peripheral Neuroengineering at JoVE.com

Il grafene utilizzato in questo studio è stato sviluppato presso l'Università di Kirklareli, Dipartimento di Ingegneria Meccanica. È stato donato dal Dr. Karabeyoğlu. Il test di tossicità del grafene è stato finanziato dal progetto intitolato "Printing and Differentiation of Mesenchymal Stem Cells on 3D Bioprinters with Graphene Doped Bioinks" (Domanda n.: 1139B411802273) completato nell'ambito del TÜBİTAK 2209-B-Industry-Oriented Undergraduate Thesis Support Program. L'altra parte dello studio è stata supportata dal fondo di ricerca fornito da Yildiz Technical University Scientific Research Projects (TSA-2021-4713). Le cellule staminali mesenchimali con GFP utilizzate nella fase di imaging time-lapse sono state donate da Virostem Biotechnology. Gli autori ringraziano Darıcı LAB e il team YTU The Cell Culture and Tissue Engineering LAB per le discussioni produttive.

1. Coltura delle cellule staminali mesenchimali gelatinose di Wharton
<ol><li>Prelevare le cellule staminali mesenchimali gelatinose di Wharton (WJ-MSCs, da ATCC) da un congelatore a -80 °C. WJ-MSCs di coltura in terreno DMEM-F12 contenente il 10% di siero fetale di vitello (FBS), l'1% di Pen-strep e l'1% di L-glutammina in un flusso laminare sterile a temperatura ambiente, come descritto in Yurie et al.20.</li>
	<li>Crioconservare alcune cellule a 1 x 106 cellule/ml...

<ol>
	<li>Kamasak, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+Nerve+Injuries+and+Physiotherapy.">Peripheral Nerve Injuries and Physiotherapy.</a> Clinical Physiotherapy. 19, (2019).</li><li>Yegiyants, S., Dayicioglu, D., Kardashian, G., Panthaki, Z. 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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graphene-based+nanocomposites+for+neural+tissue+engineering.">Graphene-based nanocomposites for neural tissue engineering.</a> Molecules. 24 (4), 658 (2019).</li><li>Othman, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alginate-gelatin+bioink+for+bioprinting+of+HeLa+spheroids+in+alginate-gelatin+hexagon-shaped+scaffolds.">Alginate-gelatin bioink for bioprinting of HeLa spheroids in alginate-gelatin hexagon-shaped scaffolds.</a> Polymer Bulletin. 78, 6115-6135 (2021).</li><li>Peng, X. L., Li, Y., Zhang, G., Zhang, F., Fan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionalization+of+graphene+with+nitrile+groups+by+cycloaddition+of+tetracyanoethylene+oxide.">Functionalization of graphene with nitrile groups by cycloaddition of tetracyanoethylene oxide.</a> Journal of Nanomaterials. 2013, 841789 (2013).</li><li>Zorba Yildiz, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+therapeutic+approaches+for+peripheral+nerve+damage.">3D therapeutic approaches for peripheral nerve damage.</a> 9th International Molecular Biology and Biotechnology Congress Abstract Book. , (2020).</li><li>Liau, L. L., Ruszymah, B. H. I., Ng, M. H., Law, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+and+clinical+applications+of+Wharton's+jelly-derived+mesenchymal+stromal+cells.">Characteristics and clinical applications of Wharton's jelly-derived mesenchymal stromal cells.</a> Current Research in Translational Medicine. 68 (1), 5-16 (2020).</li><li>Yoo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Augmented+peripheral+nerve+regeneration+through+elastic+nerve+guidance+conduits+prepared+using+a+porous+PLCL+membrane+with+a+3D+printed+collagen+hydrogel.">Augmented peripheral nerve regeneration through elastic nerve guidance conduits prepared using a porous PLCL membrane with a 3D printed collagen hydrogel.</a> Biomaterials Science. 22, 1-12 (2020).</li><li>Jansen, K., Meek, M. F., vander Werff, J. F. A., van Wachem, P. B., van Luyn, M. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+regeneration+of+the+rat+sciatic+nerve+through+a+biodegradable+poly+(DL-lactide-&#400;-caprolactone)+nerve+guide:+Tissue+reactions+with+a+focus+on+collagen+III/IV+reformation.">Long-term regeneration of the rat sciatic nerve through a biodegradable poly (DL-lactide-&#400;-caprolactone) nerve guide: Tissue reactions with a focus on collagen III/IV reformation.</a> Journal of Biomedical Materials Research. 69 (2), 334-341 (2016).</li><li>Pathre, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTP1B+regulates+neurite+extension+mediated+by+cell-cell+and+cell-matrix+adhesion+molecules.">PTP1B regulates neurite extension mediated by cell-cell and cell-matrix adhesion molecules.</a> Journal of Neuroscience Research. 15, 143-150 (2001).</li><li>Qing, L., Chen, H., Tang, J., Jia, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+their+microRNA+cargo:+New+players+in+peripheral+nerve+regeneration.">Exosomes and their microRNA cargo: New players in peripheral nerve regeneration.</a> Neurorehabilitation and Neural Repair. 32 (9), 765-776 (2018).</li></ol>

I vantaggi dei trattamenti applicati con scaffold 3D ingegnerizzati rispetto ai metodi 2D convenzionali stanno diventando sempre più evidenti ogni giorno. Le cellule staminali utilizzate da sole in queste terapie o insieme a scaffold prodotti da vari biomateriali con bassa biocompatibilità e biodegradabilità sono solitamente inadeguate nella rigenerazione dei nervi periferici. Le cellule staminali mesenchimali gelatinose di Wharton (WJ-MSCs) sembrano essere una linea cellulare candidata adatta, soprattutto considerand...

Il sistema nervoso, che è il meccanismo che collega la struttura interna dell'organismo e l'ambiente, è diviso in due parti: il sistema nervoso centrale e periferico. Il danno ai nervi periferici è un problema globale che costituisce l'1,5%-5% dei pazienti che si presentano al pronto soccorso e si sviluppa a causa di vari traumi, portando a una significativa perdita del lavoro 1,2,3.
Oggi, gli approcci cellulari alla neuroingegneria periferica sono di grande interesse. Le cellule staminali sono al primo posto tra le cellule utilizzate in questi approcci. In condizioni normali, le cellule staminali sono le cellule rigenerative del corpo e il loro numero e le loro funzioni non diminuiscono con il tempo per proteggere le loro popolazioni; Queste cellule sono specializzate ma possono differenziarsi su stimolazione appropriata in risposta alla lesione 4,5. Secondo l'ipotesi delle cellule staminali, il sistema delle cellule staminali è sotto l'influenza del suo microambiente, chiamato nicchia delle cellule staminali. La conservazione e la differenziazione delle cellule staminali sono impossibili senza la presenza del loro microambiente6, che può essere ricostituito attraverso l'ingegneria tissutale utilizzando cellule e scaffold7. L'ingegneria tissutale è un campo multidisciplinare che include sia principi di ingegneria che di biologia. L'ingegneria tissutale fornisce strumenti per la creazione di tessuti artificiali che possono sostituire i tessuti viventi e possono essere utilizzati nella rigenerazione di questi tessuti rimuovendo i tessuti danneggiati e fornendo tessuti funzionali8. Gli scaffold tissutali, uno dei tre capisaldi dell'ingegneria tissutale, sono prodotti utilizzando metodi diversi da materiali naturali e sintetici9. La stampa tridimensionale (3D) è una tecnologia di produzione additiva emergente ampiamente utilizzata per sostituire o ripristinare i tessuti difettosi attraverso la sua produzione semplice ma versatile di forme complesse utilizzando vari metodi. Il bioprinting è un metodo di produzione additiva che consente la coesistenza di cellule e biomateriali, chiamato bioinks10. Considerando l'interazione delle cellule nervose tra loro, gli studi si sono spostati su candidati biomateriali conduttivi come il grafene. Le nanopiastre di grafene, che hanno proprietà quali elettronica flessibile, supercondensatori, batterie, ottica, sensori elettrochimici e accumulo di energia, sono un biomateriale preferito nel campo dell'ingegneria tissutale11. Il grafene è stato utilizzato in studi in cui sono state eseguite la proliferazione e la rigenerazione di tessuti e organi danneggiati12,13.
L'ingegneria tissutale è costituita da tre elementi costitutivi di base: impalcatura, cellule e molecole di biosegnale. Ci sono carenze negli studi sul danno ai nervi periferici in termini di fornitura completa di queste tre strutture. Sono stati riscontrati vari problemi nei biomateriali prodotti e utilizzati negli studi, come ad esempio contenenti solo cellule staminali o molecole di biosegnale, la mancanza di una molecola bioattiva che consenta la differenziazione delle cellule staminali, la mancanza di biocompatibilità del biomateriale utilizzato e il basso effetto sulla proliferazione delle cellule nella nicchia tissutale, e, quindi, la conduzione nervosa non è pienamente realizzata 2,13,14,15,16. Ciò richiede l'ottimizzazione della rigenerazione nervosa, riducendo l'atrofia muscolare 17,18 e creando il necessario homing19 con fattori di crescita contro tali problemi. A questo punto, la caratterizzazione e l'analisi della neuro-attività di un prototipo di biomateriale chirurgico, da trasferire in clinica, sono molto importanti.
Di conseguenza, questo studio sui metodi studia il pattern dell'idrogel bioink con nanopiastre di grafene formate da un bioprinter 3D e la sua efficacia sulla differenziazione neurogena delle cellule staminali che contiene. Inoltre, vengono studiati gli effetti del grafene sulla formazione e differenziazione della neurosfera.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td> 
			Centrifugal</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td></td>
			<td>Used in cell culture and biomaterial step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1N CaCl2</td>
			<td>HD Bioink</td>
			<td></td>
			<td>Used for crosslinker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m membrane filter</td>
			<td>A&#953;s&#953;mo</td>
			<td></td>
			<td>Used for sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m syringe filter</td>
			<td>A&#953;s&#953;mo</td>
			<td></td>
			<td>Used for sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5mL conic tube</td>
			<td>Eppendorfa</td>
			<td></td>
			<td>Used for bioink drop</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15mL Falcon tube</td>
			<td>Nest</td>
			<td></td>
			<td>Used in cell culture step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks</td>
			<td>Nest</td>
			<td></td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D Bioprinting</td>
			<td>Axolotl Biosystems Bio A2 (Turkey)</td>
			<td></td>
			<td>Bioprinting Step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tube</td>
			<td>Nest</td>
			<td></td>
			<td>Used in cell culture step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6/24/48/96 well plates (Falcon, TPP microplates)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td></td>
			<td>Used in cell culture step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks</td>
			<td>Nest</td>
			<td></td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti mouse IgG-FTIC-rabbit</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>J1514</td>
			<td>Seconder antibody, used for dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti mouse IgG-SC2781-goat</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>C3109</td>
			<td>Seconder antibody, used for dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Au coating device EM ACE600</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>for gold plating of biomaterial section before SEM imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>NUVE-OT 90L</td>
			<td></td>
			<td>Used for the sterilization process.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>NUVE-OT 90L</td>
			<td></td>
			<td>Used for the sterilization process.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Cultre Cabine</td>
			<td>Hera Safe KS</td>
			<td></td>
			<td>Used for the cell culture process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium/Nutrient Mixture-F12</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>RNBJ7249</td>
			<td>Used as cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FEI QUANTA 450 FEG ESEM SEM</td>
			<td>Quanta</td>
			<td>FEG 450</td>
			<td>for SEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum-FBS</td>
			<td>Capricorn</td>
			<td>FBS-16A</td>
			<td>It was used by adding to the cell culture medium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer -80&#176;C</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MDF-U5386S-PE</td>
			<td>We were used to store cells and the resulting exosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatine-Alginate bioink powder</td>
			<td>HD Bioink</td>
			<td></td>
			<td>Used for produced bioink step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP labelled-WJ-MSCs</td>
			<td>Virostem</td>
			<td></td>
			<td>Used for imaging to cell-bioink interaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphene nanoplatelets (Graphene-IGP2)</td>
			<td>Grafen Chemical Industries Co.</td>
			<td></td>
			<td>Used for production 3D-G bioink</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunofluorescence antibodies (N-CAD; &#946;-III Tubulin)</td>
			<td>Cell Signalling and Santa Cruz</td>
			<td></td>
			<td>Used for dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JASCO 6600</td>
			<td>Tetra</td>
			<td></td>
			<td>for FTIR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTT Assay</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td>Viability testing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin/Streptomycin Solution</td>
			<td>Capricorn</td>
			<td>PB-S</td>
			<td>It was added to the medium to prevent contamination in cell culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thoma slide</td>
			<td>Isolab</td>
			<td></td>
			<td>Used for counting the cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Time-Lapse Imaging System</td>
			<td>Zeiss Axio.Observer.Z1</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tripsin-EDTA</td>
			<td>Multicell</td>
			<td></td>
			<td>The flask was used to remove the cells covering the surface.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vorteks</td>
			<td>Biobase</td>
			<td></td>
			<td>For produced bioink step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WJ-MSCs</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td>Used for the cell culture process</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and characterization of graphene-based 3d biohybrid hydrogel bioink for peripheral neuroengineering

Le neuropatie periferiche possono verificarsi a causa di danni assonali e, occasionalmente, a causa di malattie demielinizzanti. Il danno ai nervi periferici è un problema globale che si verifica nell'1,5% -5% dei pazienti di emergenza e può portare a significative perdite di posti di lavoro. Oggi, gli approcci basati sull'ingegneria tissutale, costituiti da scafffold, linee cellulari appropriate e biosegnali, sono diventati più applicabili con lo sviluppo di tecnologie di bioprinting tridimensionale (3D). La combinazione di vari biomateriali idrogel con cellule staminali, esosomi o molecole di bio-segnalazione è spesso studiata per superare i problemi esistenti nella rigenerazione dei nervi periferici. Di conseguenza, la produzione di sistemi iniettabili, come idrogel, o strutture di condotti impiantabili formate da vari metodi di bioprinting ha acquisito importanza nella neuroingegneria periferica. In condizioni normali, le cellule staminali sono le cellule rigenerative del corpo e il loro numero e le loro funzioni non diminuiscono con il tempo per proteggere le loro popolazioni; Queste non sono cellule specializzate, ma possono differenziarsi su stimolazione appropriata in risposta a lesioni. Il sistema delle cellule staminali è sotto l'influenza del suo microambiente, chiamato nicchia delle cellule staminali. Nelle lesioni dei nervi periferici, specialmente nella neurotmesi, questo microambiente non può essere completamente salvato anche dopo aver legato chirurgicamente le terminazioni nervose recise insieme. L'approccio dei biomateriali compositi e delle terapie cellulari combinate aumenta la funzionalità e l'applicabilità dei materiali in termini di varie proprietà come biodegradabilità, biocompatibilità e processabilità. Di conseguenza, questo studio mira a dimostrare la preparazione e l'uso di pattern idrogel bioibridi a base di grafene e ad esaminare l'efficienza di differenziazione delle cellule staminali in cellule nervose, che può essere una soluzione efficace nella rigenerazione nervosa.

Tossicità del grafene e imaging 2D L'analisi statistica dei risultati MTT ottenuti è stata condotta con un ANOVA unidirezionale con il test di Tukey nel software di analisi statistica e il grafico ottenuto è mostrato nella Figura 2. La percentuale di grafene rispetto al controllo ha mostrato una diminuzione significativa solo per la concentrazione di grafene dello 0,001% (**p < 0,01). Non ci sono state differenze significative tra gli altri gruppi e il controllo (p > 0...

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Preparation and Characterization of Graphene-Based 3D Biohybrid Hydrogel Bioink for Peripheral Neuroengineering

In questo manoscritto, dimostriamo la preparazione di un bioink idrogel bioibrido contenente grafene per l'uso nell'ingegneria dei tessuti periferici. Utilizzando questo materiale bioibrido 3D, viene eseguito il protocollo di differenziazione neurale delle cellule staminali. Questo può essere un passo importante per portare biomateriali simili alla clinica.

Preparazione e caratterizzazione di bioink idrogel bioibrido 3D a base di grafene per la neuroingegneria periferica

Peripheral neuropathies can occur as a result of axonal damage, and occasionally due to demyelinating diseases. Peripheral nerve damage is a global ...

Il sistema delle cellule staminali è sotto l'influenza dei suoi componenti importanti. La conservazione e la differenziazione delle cellule staminali è impensabile senza la presenza del loro microambiente. Questo microambiente, chiamato nicchia delle cellule staminali, è costituito da cellule e scaffold.La neuropatia periferica può essere e occasionalmente, possono come lesioni al plesso brachiale, vari traumi, tumori, anomalie autonomiche, definizione immunitaria e malattia metabolica. Sono stati sviluppati vari metodi di coltura 3D per fornire una nicchia migliore e più naturale per le cellule staminali. La formazione di sferoidi e il bioprinting 3D sono metodi relativamente nuovi e promettenti per le colture 3D.Il bioprinting 3D può essere utilizzato anche negli studi di neuroingegneria. Di conseguenza, all'interno di questo studio, sono stati sviluppati e studiati bioink a base di grafene e alginato / gelatina per le loro caratteristiche rigenerative. Per iniziare, colture di cellule staminali mesenchimali gelatinose di Wharton o WJMSC in terreno DMEM F12 contenente il 10% di siero fetale di vitello o FBS, 1% penna / streptococco e 1% L-glutammina sotto un flusso laminare sterile a temperatura ambiente.Quando le cellule coltivate sono confluenti all'80% nel pallone, versare il mezzo e lavare le cellule con cinque millilitri di PBS. Quindi aggiungere cinque millilitri di 0,25% tripsina e 2,21 millimolari di sodio EDTA e incubare a 37 gradi Celsius. Dopo cinque minuti, aggiungere 10 millilitri di terreno DMEM F12 contenente il 10% FBS alle cellule.Sospendere le cellule, raccogliere il mezzo e trasferirlo in una provetta da centrifuga. Quindi, centrifugare le cellule e scartare il surnatante prima di riseminare le cellule in un nuovo pallone con un mezzo nutritivo fresco contenente il 10% di FBS. Per preparare il bioink del gruppo di controllo senza grafene, pesare 4,5 milligrammi di alginato e 1,5 milligrammi di gelatina e trasferirli in una provetta da centrifuga.Quindi aggiungere 50 millilitri di mezzo DMEM F12 contenente il 10% FBS al tubo. Ancora una volta, pesare 4,5 milligrammi di alginato e 1,5 milligrammi di gelatina e trasferirli in una provetta da centrifuga. Quindi aggiungere 50 microlitri di 0,1% di grafene al tubo e rendere il volume 50 millilitri con DMEM F12 mezzo contenente 10% FBS.Mescolare i bioink mediante pipettaggio e vortice prima di autoclavare a 121 gradi Celsius sotto 1,5. pressione atmosferica per 20 minuti. Dopo l'autoclave, centrifugare la soluzione per rimuovere le bolle formate e posizionare i bioink a 37 gradi Celsius fino a quando le cellule non sono pronte.Per l'interazione bioink cellulare, creare i gruppi bioink. Il primo gruppo include 3D-B e 3D-G stampati con bioink per il bioprinting. Il secondo gruppo comprende bioink 3D-BS e 3D-GS su cui si sono formati sferoidi dopo il bioprinting.Per il gruppo uno, contare le cellule a una da 10 alla settima cella in 0,5 millilitri di mezzo. Quindi aggiungere 4,5 millilitri di bioink. Trasferire la miscela nelle cartucce nell'armadio sterile usando siringhe.Installare le cartucce nella sezione estrusore corrispondente del bioprinter. Per il secondo gruppo, prendere cinque millilitri di bioink da ciascuno dei gruppi di bioink e trasferirli in cartucce sterili con l'aiuto di un iniettore. Utilizzare la bioprinter con due testine di stampa coassiali e la tecnologia di estrusione pneumatica.Impostare la risoluzione XYZ per micropasso su 1,25 micrometri, la larghezza di estrusione su 400 micrometri e l'altezza di estrusione su 200 micrometri. Utilizzare una griglia di 20 x 20 x 5 millimetri per creare modelli 3D. Crea modelli 3D utilizzando programmi CAD open source basati sul web.Per il processo di bioprinting 3D, impostare la pressione media della stampante su 7,5 psi. Quindi impostare la temperatura della cartuccia e del letto a 37 gradi Celsius e la velocità al 60%Posizionare il sistema nella posizione iniziale durante la fase di scrittura. Posizionare automaticamente gli assi e selezionare e impostare l'estrusore prima di iniziare il processo di bioprinting.Dopo la stampa, rimuovere il campione e posizionarlo sotto un armadio a flusso laminare. Quindi, spruzzare i bioink con una soluzione normale di cloruro di calcio 0,1 o aggiungere una soluzione da un millilitro con una pipetta a temperatura ambiente e attendere da 10 a 20 secondi. Quindi lavare i modelli stampati due volte con PBS contenente calcio e magnesio.Aggiungere due millilitri di terreno DMEM F12 con il 10% FBS sopra ogni cellula contenente il gruppo bioink e incubare le piastre a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per 30 minuti. Quindi, aggiungere due millilitri di mezzo di sospensione contenente uno per 10 alle cellule sesta per ciascun gruppo e incubare le piastre. Dopo 24 ore, osservare e fotografare tutti i lotti di bioink per la formazione di sferoidi al microscopio invertito per la differenziazione delle WJMSC in cellule simili ai neuroni ad eccezione del gruppo di controllo.Aggiungere due millilitri di mezzo di differenziazione neurogena per pozzetto e aggiornare ogni due giorni. Seguire per sette giorni per osservare la differenziazione neurale. Successivamente, utilizzando l'imaging timelapse, esaminare gli effetti del grafene sulle cellule staminali e monitorare le interazioni cellulari all'interno del bioink.L'effetto della concentrazione di grafene sulla proliferazione cellulare è dimostrato qui. Rispetto al controllo, è stata osservata una diminuzione significativa per la concentrazione di grafene dello 0,001%. Non ci sono state differenze significative tra gli altri gruppi e il controllo.Le interazioni del grafene cellulare hanno mostrato che il grafene è stato tollerato nel sistema 2D ed è stato assunto dalle cellule attraverso l'endocitosi. L'imaging timelapse ha mostrato che le cellule sopravvissute nel mezzo di grafene 3D hanno mantenuto le loro vitalità attraverso la luminosità GFP fino alla fine dell'incubazione. Le immagini SEM e l'analisi FIIR dei gruppi di bioink 3D-B e 3D-G sono mostrate qui.Le interazioni cellulari di Bioink sono state dimostrate sia sulla superficie che internamente. Le cellule erano morfologicamente rotonde e attaccate al materiale. Nella differenziazione neuronale 3D, è stato considerato che i bordi delle cellule sferoidi in entrambi i gruppi erano trasparenti e vivaci, e gli sferoidi nel gruppo del grafene erano relativamente più grandi e intrappolavano il grafene all'interno della cellula.L'immunocolorazione delle cellule 2D e 3D è mostrata qui. Le immagini verdi rappresentano strutture simili a neuroni. Il campione di controllo positivo 2D ha espresso meno marcatori di struttura simili a neuroni rispetto ai campioni 3D.Abbiamo scoperto che i bioink a base di grafene avevano più successo in termini di differenziazione delle cellule staminali in cellule simili ai neuroni. Proponiamo che i bioink a base di grafene sarebbero strumenti eccellenti per il trattamento dei disturbi dei nervi periferici in ulteriori studi. Oggi, il sistema delle cellule staminali può essere creato dall'ingegneria tissutale con biomateriali naturali e sintetici La creazione di tessuti artificiali che possono sostituire i tessuti viventi che possono essere utilizzati nella rigenerazione di questi tessuti, rimuovendo il danno e fornendo la funzione è fornita dall'ingegneria tissutale.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Quantitative Characterization of Liquid Photosensitive Bioink Properties for Continuous Digital Light Processing Based Printing

Quantitative Characterization of Liquid Photosensitive Bioink Properties for Continuous Digital Light Processing Based Printing (Video) | JoVE 

Caratterizzazione quantitativa delle proprietà del bioink fotosensibile liquido per la stampa basata sull'elaborazione continua della luce digitale

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