Name: preparation and characterization of graphene-based 3d biohybrid hydrogel bioink for peripheral neuroengineering
Uploaded: 2022-05-16T14:00:00
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El grafeno utilizado en este estudio fue desarrollado en la Universidad de Kirklareli, Departamento de Ingeniería Mecánica. Fue donado por el Dr. Karabeyoğlu. La prueba de toxicidad del grafeno fue financiada por el proyecto titulado "Impresión y diferenciación de células madre mesenquimales en bioimpresoras 3D con biotintas dopadas con grafeno" (Nº de solicitud: 1139B411802273) completado dentro del alcance del Programa de Apoyo a la Tesis de Pregrado TÜBİTAK 2209-B-Industry-Oriented Undergraduate Thesis. La otra parte del estudio fue apoyada por el fondo de investigación proporcionado por los Proyectos de Investigación Científica de la Universidad Técnica de Yildiz (TSA-2021-4713). Las células madre mesenquimales con GFP utilizadas en la etapa de imagen de lapso de tiempo fueron donadas por Virostem Biotechnology. Los autores agradecen a Darıcı LAB y al equipo de YTU The Cell Culture and Tissue Engineering LAB por sus discusiones productivas.

1. Cultivo de células madre mesenquimales gelatinosas de Wharton
<ol><li>Tome las células madre mesenquimales gelatinosas de Wharton (WJ-MSC, de ATCC) de un congelador de -80 °C. Cultivo de WJ-MSCs en medio DMEM-F12 que contiene 10% de suero fetal de ternera (FBS), 1% de Pen-Strep y 1% de L-glutamina en un flujo laminar estéril a temperatura ambiente, como se describe en Yurie et al.20.</li>
	<li>Criopreservar algunas de las células a 1 x 106 células/ml con medi...

<ol>
	<li>Kamasak, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+Nerve+Injuries+and+Physiotherapy.">Peripheral Nerve Injuries and Physiotherapy.</a> Clinical Physiotherapy. 19, (2019).</li><li>Yegiyants, S., Dayicioglu, D., Kardashian, G., Panthaki, Z. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+therapy+to+promote+limb+function+recovery+in+peripheral+nerve+damage+in+a+rat+model.">Stem cell therapy to promote limb function recovery in peripheral nerve damage in a rat model.</a> Annals of Medicine and Surgery. 41, 20-28 (2019).</li><li>Zhuang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gelatin-methacrylamide+gel+loaded+with+microspheres+to+deliver+GDNF+in+bilayer+collagen+conduit+promoting+sciatic+nerve+growth.">Gelatin-methacrylamide gel loaded with microspheres to deliver GDNF in bilayer collagen conduit promoting sciatic nerve growth.</a> International Journal of Nanomedicine. 11, 1383-1394 (2016).</li><li>Scheib, J., Hoke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+peripheral+nerve+regeneration.">Advances in peripheral nerve regeneration.</a> Nature Reviews: Neurology. 9 (12), 668-676 (2013).</li><li>Yurie, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficacy+of+a+scaffold-free+bio+3D+conduit+developed+from+human+fibroblasts+on+peripheral+nerve+regeneration+in+a+rat+sciatic+nerve+model.">The efficacy of a scaffold-free bio 3D conduit developed from human fibroblasts on peripheral nerve regeneration in a rat sciatic nerve model.</a> PLOS ONE. 12 (2), 0171448 (2017).</li><li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+the+green+florescence+protein+labeling+method+for+tracking+implanted+mesenchymal+stem+cells.">Assessment of the green florescence protein labeling method for tracking implanted mesenchymal stem cells.</a> Cytotechnology. 64 (4), 391-401 (2012).</li><li>Kose, C., Kacar, R., Zorba, A. 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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graphene-based+nanocomposites+for+neural+tissue+engineering.">Graphene-based nanocomposites for neural tissue engineering.</a> Molecules. 24 (4), 658 (2019).</li><li>Othman, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alginate-gelatin+bioink+for+bioprinting+of+HeLa+spheroids+in+alginate-gelatin+hexagon-shaped+scaffolds.">Alginate-gelatin bioink for bioprinting of HeLa spheroids in alginate-gelatin hexagon-shaped scaffolds.</a> Polymer Bulletin. 78, 6115-6135 (2021).</li><li>Peng, X. L., Li, Y., Zhang, G., Zhang, F., Fan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionalization+of+graphene+with+nitrile+groups+by+cycloaddition+of+tetracyanoethylene+oxide.">Functionalization of graphene with nitrile groups by cycloaddition of tetracyanoethylene oxide.</a> Journal of Nanomaterials. 2013, 841789 (2013).</li><li>Zorba Yildiz, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+therapeutic+approaches+for+peripheral+nerve+damage.">3D therapeutic approaches for peripheral nerve damage.</a> 9th International Molecular Biology and Biotechnology Congress Abstract Book. , (2020).</li><li>Liau, L. L., Ruszymah, B. H. I., Ng, M. H., Law, J. 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B., van Luyn, M. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+regeneration+of+the+rat+sciatic+nerve+through+a+biodegradable+poly+(DL-lactide-&#400;-caprolactone)+nerve+guide:+Tissue+reactions+with+a+focus+on+collagen+III/IV+reformation.">Long-term regeneration of the rat sciatic nerve through a biodegradable poly (DL-lactide-&#400;-caprolactone) nerve guide: Tissue reactions with a focus on collagen III/IV reformation.</a> Journal of Biomedical Materials Research. 69 (2), 334-341 (2016).</li><li>Pathre, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTP1B+regulates+neurite+extension+mediated+by+cell-cell+and+cell-matrix+adhesion+molecules.">PTP1B regulates neurite extension mediated by cell-cell and cell-matrix adhesion molecules.</a> Journal of Neuroscience Research. 15, 143-150 (2001).</li><li>Qing, L., Chen, H., Tang, J., Jia, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+their+microRNA+cargo:+New+players+in+peripheral+nerve+regeneration.">Exosomes and their microRNA cargo: New players in peripheral nerve regeneration.</a> Neurorehabilitation and Neural Repair. 32 (9), 765-776 (2018).</li></ol>

Las ventajas de los tratamientos aplicados con andamios 3D diseñados sobre los métodos 2D convencionales son cada vez más notables cada día. Las células madre utilizadas solas en estas terapias o junto con andamios producidos a partir de diversos biomateriales con baja biocompatibilidad y biodegradabilidad suelen ser inadecuadas en la regeneración de los nervios periféricos. Las células madre mesenquimales gelatinosas de Wharton (WJ-MSCs) parecen ser una línea celular candidata adecuada, especialmente consideran...

El sistema nervioso, que es el mecanismo que une la estructura interna del organismo y el medio ambiente, se divide en dos partes: el sistema nervioso central y periférico. El daño a los nervios periféricos es un problema global que constituye el 1,5%-5% de los pacientes que acuden al servicio de urgencias y se desarrolla debido a diversos traumatismos, lo que lleva a una pérdida significativa del empleo 1,2,3.
Hoy en día, los enfoques celulares de la neuroingeniería periférica son de gran interés. Las células madre ocupan el primer lugar entre las células utilizadas en estos enfoques. En condiciones normales, las células madre son las células regenerativas del cuerpo, y su número y funciones no disminuyen con el tiempo para proteger a sus poblaciones; Estas células son especializadas, pero pueden diferenciarse con la estimulación adecuada en respuesta a la lesión 4,5. Según la hipótesis de las células madre, el sistema de células madre está bajo la influencia de su microambiente, llamado nicho de células madre. La preservación y diferenciación de las células madre es imposible sin la presencia de su microambiente6, que puede ser reconstituido a través de la ingeniería tisular utilizando células y andamios7. La ingeniería de tejidos es un campo multidisciplinario que incluye principios de ingeniería y biología. La ingeniería de tejidos proporciona herramientas para la creación de tejidos artificiales que pueden reemplazar los tejidos vivos y pueden ser utilizados en la regeneración de estos tejidos mediante la eliminación de los tejidos dañados y la provisión de tejidos funcionales8. Los andamios de tejidos, una de las tres piedras angulares de la ingeniería de tejidos, se producen utilizando métodos diferentes de materiales naturales y sintéticos9. La impresión tridimensional (3D) es una tecnología emergente de fabricación aditiva que se utiliza ampliamente para reemplazar o restaurar tejidos defectuosos a través de su producción simple pero versátil de formas complejas utilizando varios métodos. La bioimpresión es un método de fabricación aditiva que permite la coexistencia de células y biomateriales, llamados biotintas10. Teniendo en cuenta la interacción de las células nerviosas entre sí, los estudios se han desplazado a candidatos a biomateriales conductores como el grafeno. Las nanoplacas de grafeno, que tienen propiedades tales como electrónica flexible, supercondensadores, baterías, óptica, sensores electroquímicos y almacenamiento de energía, son un biomaterial preferido en el campo de la ingeniería de tejidos11. El grafeno ha sido utilizado en estudios donde se realizó la proliferación y regeneración de tejidos y órganos dañados12,13.
La ingeniería de tejidos consta de tres bloques de construcción básicos: andamio, células y moléculas de bioseñal. Existen deficiencias en los estudios sobre el daño a los nervios periféricos en términos de proporcionar estas tres estructuras por completo. Se han encontrado varios problemas en los biomateriales producidos y utilizados en los estudios, como que contienen solo células madre o moléculas de bioseñal, la falta de una molécula bioactiva que permita la diferenciación de células madre, la falta de biocompatibilidad del biomaterial utilizado y el bajo efecto sobre la proliferación de células en el nicho tisular. y, por lo tanto, la conducción nerviosa no se realiza completamente 2,13,14,15,16. Esto requiere la optimización de la regeneración nerviosa, reduciendo la atrofia muscular17,18, y creando el homing necesario 19 con factores de crecimiento contra tales problemas. En este punto, la caracterización y el análisis de la neuroactividad de un prototipo de biomaterial quirúrgico, para ser transferido a la clínica, son muy importantes.
En consecuencia, este estudio de métodos investiga el patrón de hidrogel de biotinta con nanoplacas de grafeno formadas por una bioimpresora 3D y su efectividad en la diferenciación neurogénica de las células madre que contiene. Además, se investigan los efectos del grafeno en la formación y diferenciación de la neuroesfera.

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	<tbody>
		<tr>
			<td> 
			Centrifugal</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td></td>
			<td>Used in cell culture and biomaterial step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1N CaCl2</td>
			<td>HD Bioink</td>
			<td></td>
			<td>Used for crosslinker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m membrane filter</td>
			<td>A&#953;s&#953;mo</td>
			<td></td>
			<td>Used for sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m syringe filter</td>
			<td>A&#953;s&#953;mo</td>
			<td></td>
			<td>Used for sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5mL conic tube</td>
			<td>Eppendorfa</td>
			<td></td>
			<td>Used for bioink drop</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15mL Falcon tube</td>
			<td>Nest</td>
			<td></td>
			<td>Used in cell culture step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks</td>
			<td>Nest</td>
			<td></td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D Bioprinting</td>
			<td>Axolotl Biosystems Bio A2 (Turkey)</td>
			<td></td>
			<td>Bioprinting Step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tube</td>
			<td>Nest</td>
			<td></td>
			<td>Used in cell culture step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6/24/48/96 well plates (Falcon, TPP microplates)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td></td>
			<td>Used in cell culture step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks</td>
			<td>Nest</td>
			<td></td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti mouse IgG-FTIC-rabbit</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>J1514</td>
			<td>Seconder antibody, used for dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti mouse IgG-SC2781-goat</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>C3109</td>
			<td>Seconder antibody, used for dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Au coating device EM ACE600</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>for gold plating of biomaterial section before SEM imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>NUVE-OT 90L</td>
			<td></td>
			<td>Used for the sterilization process.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>NUVE-OT 90L</td>
			<td></td>
			<td>Used for the sterilization process.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Cultre Cabine</td>
			<td>Hera Safe KS</td>
			<td></td>
			<td>Used for the cell culture process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium/Nutrient Mixture-F12</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>RNBJ7249</td>
			<td>Used as cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FEI QUANTA 450 FEG ESEM SEM</td>
			<td>Quanta</td>
			<td>FEG 450</td>
			<td>for SEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum-FBS</td>
			<td>Capricorn</td>
			<td>FBS-16A</td>
			<td>It was used by adding to the cell culture medium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer -80&#176;C</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MDF-U5386S-PE</td>
			<td>We were used to store cells and the resulting exosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatine-Alginate bioink powder</td>
			<td>HD Bioink</td>
			<td></td>
			<td>Used for produced bioink step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP labelled-WJ-MSCs</td>
			<td>Virostem</td>
			<td></td>
			<td>Used for imaging to cell-bioink interaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphene nanoplatelets (Graphene-IGP2)</td>
			<td>Grafen Chemical Industries Co.</td>
			<td></td>
			<td>Used for production 3D-G bioink</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunofluorescence antibodies (N-CAD; &#946;-III Tubulin)</td>
			<td>Cell Signalling and Santa Cruz</td>
			<td></td>
			<td>Used for dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JASCO 6600</td>
			<td>Tetra</td>
			<td></td>
			<td>for FTIR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTT Assay</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td>Viability testing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin/Streptomycin Solution</td>
			<td>Capricorn</td>
			<td>PB-S</td>
			<td>It was added to the medium to prevent contamination in cell culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thoma slide</td>
			<td>Isolab</td>
			<td></td>
			<td>Used for counting the cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Time-Lapse Imaging System</td>
			<td>Zeiss Axio.Observer.Z1</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tripsin-EDTA</td>
			<td>Multicell</td>
			<td></td>
			<td>The flask was used to remove the cells covering the surface.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vorteks</td>
			<td>Biobase</td>
			<td></td>
			<td>For produced bioink step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WJ-MSCs</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td>Used for the cell culture process</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and characterization of graphene-based 3d biohybrid hydrogel bioink for peripheral neuroengineering

Las neuropatías periféricas pueden ocurrir como resultado del daño axonal, y ocasionalmente debido a enfermedades desmielinizantes. El daño a los nervios periféricos es un problema global que ocurre en el 1.5% -5% de los pacientes de emergencia y puede conducir a pérdidas significativas de empleos. Hoy en día, los enfoques basados en la ingeniería de tejidos, que consisten en andamios, líneas celulares apropiadas y bioseñales, se han vuelto más aplicables con el desarrollo de tecnologías de bioimpresión tridimensional (3D). La combinación de varios biomateriales de hidrogel con células madre, exosomas o moléculas de bioseñalización se estudia con frecuencia para superar los problemas existentes en la regeneración de nervios periféricos. En consecuencia, la producción de sistemas inyectables, como hidrogeles, o estructuras de conductos implantables formados por diversos métodos de bioimpresión ha ganado importancia en la neuroingeniería periférica. En condiciones normales, las células madre son las células regenerativas del cuerpo, y su número y funciones no disminuyen con el tiempo para proteger a sus poblaciones; Estas no son células especializadas, pero pueden diferenciarse con la estimulación adecuada en respuesta a una lesión. El sistema de células madre está bajo la influencia de su microambiente, llamado nicho de células madre. En las lesiones de los nervios periféricos, especialmente en la neurotmesis, este microambiente no se puede rescatar por completo incluso después de unir quirúrgicamente las terminaciones nerviosas cortadas. El enfoque de biomateriales compuestos y terapias celulares combinadas aumenta la funcionalidad y aplicabilidad de los materiales en términos de diversas propiedades, como la biodegradabilidad, la biocompatibilidad y la procesabilidad. En consecuencia, este estudio tiene como objetivo demostrar la preparación y el uso de patrones de hidrogel biohíbridos basados en grafeno y examinar la eficiencia de diferenciación de las células madre en células nerviosas, que pueden ser una solución efectiva en la regeneración nerviosa.

Toxicidad del grafeno e imágenes 2D El análisis estadístico de los resultados MTT obtenidos se realizó con un ANOVA unidireccional con la prueba de Tukey en software de análisis estadístico, y el gráfico obtenido se muestra en la Figura 2. El porcentaje de grafeno en comparación con el control mostró una disminución significativa solo para la concentración de grafeno al 0,001% (**p < 0,01). No hubo diferencias significativas entre los otros grupos y el control ...

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Preparation and Characterization of Graphene-Based 3D Biohybrid Hydrogel Bioink for Peripheral Neuroengineering

En este manuscrito, demostramos la preparación de una biotinta de hidrogel biohíbrida que contiene grafeno para su uso en ingeniería de tejidos periféricos. Utilizando este material biohíbrido 3D, se realiza el protocolo de diferenciación neural de las células madre. Este puede ser un paso importante para traer biomateriales similares a la clínica.

Preparación y caracterización de biotinta de hidrogel biohíbrida 3D basada en grafeno para neuroingeniería periférica

Peripheral neuropathies can occur as a result of axonal damage, and occasionally due to demyelinating diseases. Peripheral nerve damage is a global ...

El sistema de células madre está bajo la influencia de sus componentes importantes. La preservación y diferenciación de las células madre es impensable sin la presencia de su microambiente. Este microambiente, llamado nicho de células madre, consiste en células y andamios.La neuropatía periférica puede ser y, ocasionalmente, pueden ser como lesiones en el plexo braquial, diversos traumatismos, tumores, anomalías autonómicas, definición inmune y enfermedad metabólica. Se han desarrollado varios métodos de cultivo 3D para proporcionar un nicho mejor y más natural para las células madre. La formación de esferoides y la bioimpresión 3D son métodos relativamente nuevos y prometedores para los cultivos 3D.La bioimpresión 3D también se puede utilizar en estudios de neuroingeniería. En consecuencia, dentro de este estudio, se desarrollaron y estudiaron biotintas a base de grafeno y alginato / gelatina por sus características regenerativas. Para comenzar, cultive células madre mesenquimales gelatinosas de Wharton o WJMSCs en medio DMEM F12 que contenga 10% de suero fetal de ternera o FBS, 1% de pluma/estreptococo y 1% de L-glutamina bajo un flujo laminar estéril a temperatura ambiente.Cuando las células cultivadas estén 80% confluentes en el matraz, vierta el medio y lave las células con cinco mililitros de PBS. Luego agregue cinco mililitros de 0.25% de tripsina y 2.21 milimolar de sodio EDTA e incube a 37 grados centígrados. Después de cinco minutos, agregue 10 mililitros de medio DMEM F12 que contiene 10% FBS a las células.Suspenda las células, recoja el medio y transfiéralo a un tubo centrífugo. A continuación, centrifugar las células y desechar el sobrenadante antes de volver a sembrar las células en un nuevo matraz con un medio nutriente fresco que contenga 10% de FBS. Para preparar la biotinta del grupo de control sin grafeno, pese 4,5 miligramos de alginato y 1,5 miligramos de gelatina y transfiéralos a un tubo de centrífuga.Luego agregue 50 mililitros de DMEM F12 medio que contiene 10% FBS al tubo. Una vez más, pesar 4,5 miligramos de alginato y 1,5 miligramos de gelatina y transferirlos a un tubo de centrífuga. Luego agregue 50 microlitros de 0.1% de grafeno al tubo y haga el volumen de 50 mililitros con DMEM F12 medio que contiene 10% FBS.Mezcle las biotintas pipeteando y vórtice antes de esterilizarlas en autoclave a 121 grados centígrados por debajo de 1,5. presión atmosférica durante 20 minutos. Después del autoclave, centrifugar la solución para eliminar las burbujas formadas y colocar las biotintas a 37 grados centígrados hasta que las células estén preparadas.Para la interacción de biotinta celular, cree los grupos de biotinta. El grupo uno incluye 3D-B y 3D-G impreso con biotinta para bioimpresión. El grupo dos incluye biotintas 3D-BS y 3D-GS en las que se formaron esferoides después de la bioimpresión.Para el grupo uno, cuente las células de una por 10 a la séptima celda en 0,5 mililitros de medio. Luego agregue 4.5 mililitros de biotinta. Transfiera la mezcla a los cartuchos en el gabinete estéril usando jeringas.Instale los cartuchos en la sección del extrusor correspondiente de la bioimpresora. Para el segundo grupo, tome cinco mililitros de biotinta de cada uno de los grupos de biotinta y transfiéralos a cartuchos estériles con la ayuda de un inyector. Utilice la bioimpresora con dos cabezales de impresión coaxiales y la tecnología de extrusión neumática.Establezca la resolución XYZ por micro paso en 1,25 micrómetros, el ancho de extrusión en 400 micrómetros y la altura de extrusión en 200 micrómetros. Utilice una cuadrícula de 20 por 20 por 5 milímetros para crear modelos 3D. Cree modelos 3D utilizando programas CAD basados en web de código abierto.Para el proceso de bioimpresión 3D, ajuste la presión promedio de la impresora a 7.5 psi. A continuación, ajuste la temperatura del cartucho y de la cama a 37 grados centígrados y la velocidad al 60%. Coloque el sistema en la posición inicial durante la fase de escritura. Coloque los ejes automáticamente y seleccione y configure el extrusor antes de iniciar el proceso de bioimpresión.Después de la impresión, retire la muestra y colóquela debajo de un gabinete de flujo laminar. A continuación, rocíe las biotintas con 0,1 solución normal de cloruro de calcio o agregue una solución de mililitro con una pipeta a temperatura ambiente y espere de 10 a 20 segundos. Luego lave los patrones impresos dos veces con PBS que contenga calcio y magnesio.Agregue dos mililitros de DMEM F12 medio con 10% FBS encima de cada celda que contenga grupo de biotinta e incube las placas a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono durante 30 minutos. A continuación, agregue dos mililitros de medio de suspensión que contenga una por 10 a la sexta celda a cada grupo e incube las placas. Después de 24 horas, observe y fotografíe todos los lotes de biotinta para la formación de esferoides bajo un microscopio invertido para la diferenciación de WJMSCs a células similares a neuronas, excepto para el grupo de control.Añadir dos mililitros de medio de diferenciación neurogénica por pocillo y refrescar cada dos días. Siga durante siete días para observar la diferenciación neuronal. A continuación, utilizando imágenes de lapso de tiempo, examine los efectos del grafeno en las células madre y monitoree las interacciones celulares dentro de la biotinta.El efecto de la concentración de grafeno en la proliferación celular se demuestra aquí. En comparación con el control, se observó una disminución significativa para la concentración de grafeno al 0,001%. No hubo diferencias significativas entre los otros grupos y el control.Las interacciones del grafeno celular mostraron que el grafeno fue tolerado en el sistema 2D y fue tomado por las células a través de endocitosis. Las imágenes de lapso de tiempo mostraron que las células que sobrevivieron en el medio de grafeno 3D mantuvieron sus vitalidades a través del brillo GFP hasta el final de la incubación. Aquí se muestran imágenes SEM y análisis FIIR de los grupos de biotinta 3D-B y 3D-G.Las interacciones de las células de biotinta se demostraron tanto en la superficie como internamente. Las células eran morfológicamente redondas y unidas al material. En la diferenciación neuronal 3D, se consideró que los bordes de las células esferoides en ambos grupos eran transparentes y vivos, y los esferoides en el grupo de grafeno eran relativamente más grandes y atrapaban el grafeno dentro de la célula.Aquí se muestra la inmunotinción de células 2D y 3D. Las imágenes verdes representan estructuras similares a neuronas. La muestra de control positivo 2D expresó menos marcadores de estructura similares a neuronas que las muestras 3D.Descubrimos que las biotintas basadas en grafeno tenían más éxito en términos de diferenciación de células madre en células similares a las neuronas. Proponemos que las biotintas basadas en grafeno serían excelentes herramientas para el tratamiento de trastornos de los nervios periféricos en estudios adicionales. Hoy en día, el sistema de células madre puede ser creado por ingeniería de tejidos con biomateriales naturales y sintéticos La creación de tejidos artificiales que pueden reemplazar los tejidos vivos que se pueden utilizar en la regeneración de estos tejidos, la eliminación del daño y la función es proporcionada por la ingeniería de tejidos.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation

3D hidrogel andamios para articular condrocitos cultura y cartílago Generación

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer ...

Investigación

Bioingeniería

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Bioprinting Cellularized Construye El uso de un Tejidos específicos de hidrogel Bioink

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting de cartílago y piel análogos de tejido utilizando un pasivo novela mezcla de unidad técnica de Bioink Precellularization

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Microhoneycomb Monoliths Prepared by the Unidirectional Freeze-drying of Cellulose Nanofiber Based Sols: Method and Extensions

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Quantitative Characterization of Bioink Properties for Continuous DLP Printing

Quantitative Characterization of Liquid Photosensitive Bioink Properties for Continuous Digital Light Processing Based Printing

Quantitative Characterization of Liquid Photosensitive Bioink Properties for Continuous Digital Light Processing Based Printing (Video) | JoVE 

Caracterización cuantitativa de las propiedades de la biotinta fotosensible líquida para la impresión basada en el procesamiento digital continuo de la luz

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