Name: analysis of fecal microbiota dynamics in lupus-prone mice using a simple, cost-effective dna isolation method
Uploaded: 2022-05-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Fecal Microbiota Dynamics in Lupus-Prone Mice Using a Simple, Cost-Effective DNA Isolation Method at JoVE.com

Wir schätzen die Hilfe des Argonne National Laboratory und unserer kooperierenden Bioinformatiker. Diese Arbeit wird durch verschiedene NIH- und interne Zuschüsse unterstützt.

Der Cx3cr1 gfp/gfp-Locus von B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J-Mäusen wurde für 10 Generationen zu MRL/MpJ-Fas lpr/J (MRL/lpr) zurückgekreuzt, um MRL/lpr-CX 3 CR1gfp/gfp-Mäuse zu erzeugen. Das Genom-Screening mit Einzelnukleotid-Polymorphismus (SNP)-Panels bestätigte, dass der genetische Hintergrund neu erzeugter Mäuse zu mehr als 97% mit dem von MRL/LPR identisch war. Danach wurden Mäuse in einer spezifischen pathogenfreien Umgebung gezüchtet un...

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	<li>Lee, Y. K., Mazmanian, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Has+the+microbiota+played+a+critical+role+in+the+evolution+of+the+adaptive+immune+system.">Has the microbiota played a critical role in the evolution of the adaptive immune system.</a> Science. 330 (6012), 1768-1773 (2010).</li><li>Lee, Y. K., Menezes, J. S., Umesaki, Y., Mazmanian, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proinflammatory+T-cell+responses+to+gut+microbiota+promote+experimental+autoimmune+encephalomyelitis.">Proinflammatory T-cell responses to gut microbiota promote experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 4615-4622 (2011).</li><li>Yeoh, N., Burton, J. P., Suppiah, P., Reid, G., Stebbings, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+microbiome+in+rheumatic+diseases.">The role of the microbiome in rheumatic diseases.</a> Current Rheumatology Reports. 15 (3), 314 (2013).</li><li>Larsen, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+microbiota+in+human+adults+with+type+2+diabetes+differs+from+non-diabetic+adults.">Gut microbiota in human adults with type 2 diabetes differs from non-diabetic adults.</a> PLoS One. 5 (2), 9085 (2010).</li><li>Alam, M. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burden+of+serious+infections+in+adults+with+systemic+lupus+erythematosus:+a+national+population-based+study.">Burden of serious infections in adults with systemic lupus erythematosus: a national population-based study.</a> Arthritis Care &amp; Research. 67 (8), 1078-1085 (2015).</li><li>Mu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+lupus+nephritis+by+changes+of+gut+microbiota.">Control of lupus nephritis by changes of gut microbiota.</a> Microbiome. 5 (1), 73 (2017).</li><li>Panek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodology+challenges+in+studying+human+gut+microbiota+-+effects+of+collection,+storage,+DNA+extraction+and+next+generation+sequencing+technologies.">Methodology challenges in studying human gut microbiota - effects of collection, storage, DNA extraction and next generation sequencing technologies.</a> Scientific Reports. 8 (1), 5143 (2018).</li><li>Fiedorov&#225;, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+dna+extraction+methods+on+stool+bacterial+and+fungal+microbiota+community+recovery.">The impact of dna extraction methods on stool bacterial and fungal microbiota community recovery.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 821 (2019).</li><li>Gerasimidis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+DNA+extraction+methodology+on+gut+microbiota+research+applications.">The effect of DNA extraction methodology on gut microbiota research applications.</a> BMC Research Notes. 9, 365 (2016).</li><li>Bukin, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+16S+rRNA+region+choice+on+bacterial+community+metabarcoding+results.">The effect of 16S rRNA region choice on bacterial community metabarcoding results.</a> Scientific Data. 6 (1), 190007 (2019).</li><li>Galloway-Pe&#241;a, J., Hanson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+analysis+of+the+microbiome.">Tools for analysis of the microbiome.</a> Digestive Diseases and Sciences. 65 (3), 674-685 (2020).</li><li>Sharpton, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+the+analysis+of+shotgun+metagenomic+data.">An introduction to the analysis of shotgun metagenomic data.</a> Frontiers in Plant Science. 5, 209 (2014).</li></ol>

Eine ausgewogene Darmmikrobiota kann den menschlichen Körper vor Krankheiten schützen. Sobald dieses Gleichgewicht durch externe oder interne Auslöser gestört wird, können die Folgen verheerend sein. Diese Methode bietet eine Möglichkeit, die Dynamik der Darmmikrobiota in Mausmodellen zu analysieren. Die Methode eignet sich nicht nur für Vergleiche zwischen Gruppen, sondern auch für die Verfolgung der Darmmikrobiota im Zeitverlauf, um zeitabhängige Faktoren, die die Darmmikrobiota stören, besser zu identifizier...

Mensch und Bakterien existieren schon lange nebeneinander. Sie haben eine co-abhängige Beziehung mit gegenseitig vorteilhaften Effekten aufgebaut, die die Immunantwort des Wirts quantitativ und qualitativ beeinflusst1. Neuere Studien deuten auf einen Zusammenhang zwischen der Zusammensetzung der Darmmikrobiota und der Pathogenese von Autoimmunerkrankungen hin, zu denen Multiple Sklerose 2, rheumatoide Arthritis3,Typ-2-Diabetes 4, entzündliche Darmerkrankungen5 und systemischer Lupus erythematodes (SLE) gehören6. Ob die Darmmikrobiota jedoch die Hauptursache oder eine Nebenwirkung dieser Autoimmunerkrankungen ist, ist noch unklar7. Möglicherweise könnte die Darmmikrobiota die Krankheit während der Effektorphase von Autoimmunerkrankungen verschlimmern oder eine Rolle bei der Regulierung der Induktion dieser Krankheiten spielen8.
Intestinale Dysbiose wurde bei weiblichen Lupus-anfälligen MRL / Mp-Faslpr (MRL / lpr) Mäusen berichtet, und Darmmikrobiota-Veränderungen mit einer signifikanten Erschöpfung von Laktobazillen wurden beobachtet9. Wenn eine Mischung aus fünf Lactobacillus-Stämmen oral verabreicht wurde, wurden die lupusähnlichen Symptome bei diesen Mäusen weitgehend abgeschwächt, was auf eine wesentliche Rolle der Mikrobiota bei der Regulierung der SLE-Pathogenese hindeutet.
Die folgende Technik der DNA-Extraktion ermöglicht es, Mikrobiota-Fluktuationen zu verfolgen und sie qualitativ und quantitativ im Verlauf der murinen SLE-ähnlichen Erkrankung bei zu Lupus neigenden Mäusen zu analysieren. Unabhängig davon, ob die gesunde Darmmikrobiota untersucht oder Dysbiose definiert werden soll, ist es wichtig, kritisch zu untersuchen, wie Daten gesammelt werden und ob sie genau und reproduzierbar sind10. Jeder Schritt ist in diesem Prozess entscheidend. Eine geeignete Methodik muss verwendet werden, um mikrobielle DNA zu extrahieren, da jedes mögliche Problem, das Verzerrungen während des DNA-Extraktionsprozesses einführt, zu einer ungenauen mikrobiellen Repräsentation führen könnte. Während die Phenol-Chloroform-Methode hier beschrieben wird, gibt es kommerziell erhältliche Kits zur Extraktion von DNA aus Bakterien, die in bestimmten Fällen gut funktionieren11. Ihre Verwendbarkeit ist jedoch durch die Kosten und die erforderliche Probenmenge begrenzt.
Das hier vorgestellte Protokoll ist kostengünstig und erfordert nur eine geringe Probenmenge. Es funktioniert gut mit jeder Art von Stuhlprobe und ist nützlich bei der Untersuchung der Dynamik der Darmmikrobiota im Laufe der Zeit sowie bei Vergleichen zwischen Gruppen. DNA wird mit einer Methode der Alkoholreinigung isoliert, die Phenol, Chloroform und Isoamylalkohol verwendet. Die alkoholbasierte Extraktion hilft, die Probe von Proteinen und Lipiden zu reinigen und zu entfernen, wo im letzten Schritt DNA ausgefällt wird. Die vorgeschlagene Methode hat eine signifikant hohe Effizienz und Qualität und hat sich bei der Identifizierung von Bakterienpopulationen als genau erwiesen. Ein kritischer Hinweis während des Verfahrens ist, dass DNA-Kontaminationen auftreten können und daher eine angemessene Probenhandhabung erforderlich ist12.
Die DNA wird dann von den Next Generation Sequencing-Plattformen auf das 16S rRNA-Gen, wie das Illumina MiSeq, analysiert. Insbesondere wird die hypervariable Region V4 analysiert, um eine bessere Quantifizierung für hochrangige Taxa13 zu ermöglichen. Die anschließende bioinformatische Analyse wird ausgelagert, gefolgt von einer Inhouse-Analyse mit statistischen Standardmethoden. Es gibt zahlreiche Open-Source-Bioinformatik-Softwareprogramme für die nachgelagerte Sequenzierung, und die Art der durchgeführten Analysen hängt stark von der spezifischen biologischen Fragestellung von Interesseab 14. Dieses Protokoll konzentriert sich speziell auf die experimentellen Schritte vor der Sequenzierung und bietet eine vielseitigere, kostengünstigere, vergleichbare und effizientere Methode zur Gewinnung von DNA aus Stuhlproben.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1 mm glass beads</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>11079101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL screw cap tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>3488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% SDS</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>BP1311-1</td>
			<td>SDS 20%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96% Ethanol, Molecular Biology Grade</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T032021000CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Acetate (5 M)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9071</td>
			<td>NH4AC 5M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>005582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bullet Blender storm 24</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>4116-BBY24M</td>
			<td>Homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>C298-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC-Treated Water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine Tetraacetic Acid</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>BP118-500</td>
			<td>EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foil plate seal</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>NC0302491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes-Kimtech 34256</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>06-666C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRL/MpJ-Faslpr/J (MRL/lpr) mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>000485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 2000 spectrophotomer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND2000CLAPTOP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol: chloroform: isoamylalchohol (25:24:1)</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>BP1752I-400</td>
			<td>PCI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale with 4 decimals</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>MS205DU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skirted 96-well plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AB-0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>15528154</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Hydrochloride</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>BP1757-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of fecal microbiota dynamics in lupus-prone mice using a simple, cost-effective dna isolation method

Die Darmmikrobiota spielt eine wichtige Rolle bei der Aufklärung des Immunsystems. Diese Beziehung ist äußerst wichtig für das Verständnis von Autoimmunerkrankungen, die nicht nur durch genetische Faktoren angetrieben werden, sondern auch durch Umweltfaktoren, die den Ausbruch auslösen und/oder den Krankheitsverlauf verschlimmern können. Eine zuvor veröffentlichte Studie über die Dynamik der Darmmikrobiota bei lupusanfälligen MRL / lpr-weiblichen Mäusen zeigte, wie Veränderungen der Darmmikrobiota das Fortschreiten der Krankheit verändern können. Hier wird ein Protokoll zur Extraktion repräsentativer Proben aus der Darmmikrobiota für Studien der Autoimmunität beschrieben. Mikrobiota-Proben werden aus dem Anus entnommen und verarbeitet, aus denen die DNA mit einem Phenol-Chloroform-Verfahren extrahiert und durch Alkoholfällung gereinigt wird. Nach der PCR werden gereinigte Amplicons mit einer Next Generation Sequencing-Plattform am Argonne National Laboratory sequenziert. Schließlich werden die 16S ribosomalen RNA-Gensequenzierungsdaten analysiert. Als Beispiel werden Daten aus Darmmikrobiota-Vergleichen von MRL/lpr-Mäusen mit oder ohne CX3CR1 gezeigt. Die Ergebnisse zeigten signifikante Unterschiede in Gattungen, die pathogene Bakterien enthalten, wie die im Stamm Proteobacteria sowie in der Gattung Bifidobacterium, die als Teil der gesunden kommensalen Mikrobiota gilt. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese einfache, kostengünstige DNA-Isolierungsmethode zuverlässig ist und bei der Untersuchung von Darmmikrobiota-Veränderungen im Zusammenhang mit Autoimmunerkrankungen helfen kann.

Die Ergebnisse des Argonne National Laboratory werden von einem qualifizierten Bioinformatiker analysiert, gefolgt von einer internen Analyse der Daten mit statistischen Standardmethoden. Typische Mikrobiomanalysen beinhalten die Clusterung ähnlicher Sequenzen in operationelle taxonomische Einheiten (OTUs) oder Amplikonsequenzvarianten (ASVs) als Proxy für verschiedene Mikroorganismen in einer Probe. Die Anzahl der OTUs oder ASVs über Stichproben hinweg kann dann verwendet werden, um auf Änderungen der Diversität in...

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Analysis of Fecal Microbiota Dynamics in Lupus-Prone Mice Using a Simple, Cost-Effective DNA Isolation Method

Dieses Protokoll bietet eine einfache, kostengünstige DNA-Isolationsmethode für die Analyse von Veränderungen der Mikrobiota des murinen Darms während der Entwicklung von Autoimmunerkrankungen.

Analyse der Dynamik fäkaler Mikrobiota in Lupus-anfälligen Mäusen mit einer einfachen, kostengünstigen DNA-Isolierungsmethode

Gut microbiota has an important role in educating the immune system. This relationship is extremely important for understanding autoimmune diseases that ...

Die vorgeschlagene DNA-Isolierungsmethode kann dazu dienen, die Darmmikrobiotadynamik in Mausmodellen für Autoimmunerkrankungen zu untersuchen. Eine vielseitigere, kostengünstigere und effizientere Methode wird vorgeschlagen, um DNA aus Stuhlproben zu gewinnen, die mit kommerziell erhältlichen Kits vergleichbar sind. Nehmen Sie zunächst jede Maus einzeln aus ihrem Käfig, sammeln Sie ein Kotpellet direkt aus dem Anus und lagern Sie es bei minus 80 Grad Celsius, bis es verarbeitet wird.Verarbeiten Sie die Proben mit sterilen und sauberen Pinzetten, Röhrchen und Handschuhen. Fügen Sie ein gefrorenes Pellet zu einem vorgewogenen Schraubverschlussrohr mit zwei Milliliter hinzu und notieren Sie das Kotgewicht in Gramm, das zwischen 0,02 und 0,05 Gramm pro Kotpellet liegen sollte. Fügen Sie dem Pellet eine dünne Schicht aus 0,1 Millimeter Glasperlen, 500 Mikroliter Lysepuffer und 200 Mikroliter 20% Natriumdodecylsulfat hinzu.Bead schlug die Röhre vier Minuten lang in einem Homogenisator, gefolgt von drei bis fünf Minuten Wirbel. Zentrifugieren Sie die Röhrchen für kurze Zeit, um die Blasen und den Schaum zu entfernen. Um DNA aus den Mikrobiota-Proben zu extrahieren, übertragen Sie 350 Mikroliter Probenüberstand in ein neues 1,5-Milliliter-Schnappverschlussrohr ohne Ablagerungen.Fügen Sie 500 Mikroliter Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol im Verhältnis 25: 24: 1 hinzu und wirbeln Sie für eine Minute. Nach der Zentrifugation werden 180 Mikroliter der oberen wässrigen Phase in ein neues 1,5-Milliliter-Schnappverschlussrohr überführt. Fügen Sie 180 Mikroliter Chloroform hinzu, invertieren Sie es und mischen Sie.Daraus werden 180 Mikroliter der wässrigen Phase in ein neues Schnappverschlussrohr überführt. In einer Biosicherheitswerkbank 180 Mikroliter kaltes Isopropanol und 36 Mikroliter fünf molares Ammoniumacetat hinzufügen. Drehen Sie es ein paar Mal um, um zu mischen, und legen Sie die Tube für 20 Minuten auf Eis.Entsorgen Sie den Überstand, waschen Sie die Pellets anschließend mehrmals mit 500 Mikrolitern kaltem 70% Ethanol. Entsorgen Sie den Überstand und trocknen Sie das Röhrchen 20 Minuten lang kopfüber auf Seidenpapier, bis das Pellet klar wird. Suspendieren Sie das Pellet in 50 Mikroliter molekularem Wasser und erhitzen Sie die Flüssigkeit bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten, um große DNA-Pellets vollständig aufzulösen.Nach dem Erhitzen zentrifugieren Sie diese Röhrchen bei 3.400 Mal G für eine Minute, um die Kondensationströpfchen aus dem Deckel zurückzugewinnen. Messen Sie die Konzentration und erhalten Sie das Verhältnis 260/280 mit einem Spektralphotometer. Ein Verhältnis für qualitativ hochwertige DNA liegt im Allgemeinen zwischen 1,8 und zwei.Zentrifugieren Sie die vorbereiteten Proben bei 600 mal G für eine Minute bei Raumtemperatur, bevor Sie 24 Stunden lang bei minus 80 Grad Celsius einfrieren. Dann senden Sie 20 Mikroliter Proben mit Konzentrationen von einem bis 50 Nanogramm pro Mikroliter zur Sequenzierung an das Argonne National Laboratory. Der Mausstamm, dem der Rezeptor CX3CR1 fehlt, hat eine andere Darmmikrobiota-Zusammensetzung als Wildtyp-MRL/lpr, MRL/lpr-CX3CR1 GFP/GFP-Mäuse, zeigt signifikante Unterschiede in bestimmten Gattungen, die für potenziell pathogene Bakterien wie die im Stamm Proteobacteria relevant sind.Seien Sie vorsichtig mit der Verunreinigung der Probe. Es muss steril sein. Außerdem ist es wichtig, genau zu pipettieren, wenn der Überstand in ein neues Röhrchen übertragen wird.Diese Methode eignet sich für molekulare Analysen wie PCR, Restriktionsenzymverdauung oder genomischen Bibliotheksaufbau. Bei Lupus haben wir eine starke Beziehung zwischen der Darmmikrobiota und der Lupusprogression nachgewiesen.

Research

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