Name: analysis of fecal microbiota dynamics in lupus-prone mice using a simple, cost-effective dna isolation method
Uploaded: 2022-05-02T14:00:00
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हम आर्गोन नेशनल लेबोरेटरी और हमारे सहयोगी जैव सूचना विज्ञानियों की मदद की सराहना करते हैं। यह काम विभिन्न एनआईएच और आंतरिक अनुदानों द्वारा समर्थित है।

B6.129P2 (Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J चूहों के Cx3cr1 gfp/gfp को MRL/Lpr-CX 3CR1gfp/gfp चूहों को उत्पन्न करने के लिए 10 पीढ़ियों के लिए MRL/MPJ-Fas lpr/J (MRL/lpr) में वापस भेजा गया था। एकल न्यूक्लियोटाइड बहुरूपता (एसएनपी) पैनलों का उपयोग करक?...

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	<li>Lee, Y. K., Mazmanian, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Has+the+microbiota+played+a+critical+role+in+the+evolution+of+the+adaptive+immune+system.">Has the microbiota played a critical role in the evolution of the adaptive immune system.</a> Science. 330 (6012), 1768-1773 (2010).</li><li>Lee, Y. K., Menezes, J. S., Umesaki, Y., Mazmanian, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proinflammatory+T-cell+responses+to+gut+microbiota+promote+experimental+autoimmune+encephalomyelitis.">Proinflammatory T-cell responses to gut microbiota promote experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 4615-4622 (2011).</li><li>Yeoh, N., Burton, J. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+16S+rRNA+region+choice+on+bacterial+community+metabarcoding+results.">The effect of 16S rRNA region choice on bacterial community metabarcoding results.</a> Scientific Data. 6 (1), 190007 (2019).</li><li>Galloway-Pe&#241;a, J., Hanson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+analysis+of+the+microbiome.">Tools for analysis of the microbiome.</a> Digestive Diseases and Sciences. 65 (3), 674-685 (2020).</li><li>Sharpton, T. 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संतुलित आंत माइक्रोबायोटा मानव शरीर को बीमारियों से बचा सकता है। एक बार जब यह संतुलन बाहरी या आंतरिक ट्रिगर्स द्वारा बाधित हो जाता है, तो परिणाम विनाशकारी हो सकते हैं। यह विधि मुराइन मॉडल में आंत माइक?...

मनुष्य और बैक्टीरिया लंबे समय से सह-अस्तित्व में हैं। उन्होंने पारस्परिक लाभकारी प्रभावों के साथ एक सह-निर्भर संबंध स्थापित किया है जो मात्रात्मक और गुणात्मक तरीकों से मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को प्रभावित करताहै। हाल के अध्ययनों से आंत माइक्रोबायोटा संरचना और ऑटोइम्यून बीमारियों के रोगजनन के बीच एक संबंध का सुझाव मिलता है जिसमें मल्टीपल स्केलेरोसिस2, रूमेटोइड गठिया3, टाइप 2 मधुमेह4, सूजन आंत्र रोग5, और प्रणालीगत ल्यूपस एरिथेमेटोसस (एसएलई) 6 शामिल हैं। हालांकि, क्या आंत माइक्रोबायोटा इन ऑटोइम्यून बीमारियों का मुख्य कारण या द्वितीयक प्रभाव है, यह अभीभी स्पष्ट नहीं है। संभावित रूप से, आंत माइक्रोबायोटा ऑटोइम्यून विकारों के प्रभावक चरण के दौरान बीमारी को बढ़ा सकता है या इन बीमारियों के प्रेरण को विनियमित करने में भूमिका निभासकता है।
महिला ल्यूपस-प्रवण एमआरएल / एमपी-फेस्पर (एमआरएल / एलपीआर) चूहों में आंतों के डिस्बिओसिस की सूचना दी गई है, और लैक्टोबैसिली की महत्वपूर्ण कमी के साथ आंत माइक्रोबायोटापरिवर्तन देखा गया था। जब पांच लैक्टोबैसिलस उपभेदों के मिश्रण को मौखिक रूप से प्रशासित किया गया था, तो ल्यूपस जैसे लक्षण इन चूहों में काफी हद तक क्षीण हो गए थे, जो एसएलई रोगजनन को विनियमित करने में माइक्रोबायोटा की एक आवश्यक भूमिका का सुझाव देते थे।
डीएनए निष्कर्षण की निम्नलिखित तकनीक माइक्रोबायोटा के उतार-चढ़ाव का पालन करने और ल्यूपस-प्रवण चूहों में मुराइन एसएलई जैसी बीमारी के दौरान गुणात्मक और मात्रात्मक रूप से उनका विश्लेषण करने की अनुमति देती है। चाहे स्वस्थ आंत माइक्रोबायोटा की जांच करें या डिस्बिओसिस को परिभाषित करें, यह गंभीर रूप से जांचना महत्वपूर्ण है कि डेटा कैसे एकत्र किया जाता है और क्या यह सटीक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्यहै। इस प्रक्रिया में हर कदम महत्वपूर्ण है। माइक्रोबियल डीएनए निकालने के लिए एक उपयुक्त पद्धति का उपयोग किया जाना चाहिए क्योंकि डीएनए निष्कर्षण प्रक्रिया के दौरान पूर्वाग्रहों को पेश करने वाली किसी भी संभावित समस्या के परिणामस्वरूप गलत माइक्रोबियल प्रतिनिधित्व हो सकता है। जबकि फिनोल-क्लोरोफॉर्म विधि यहां वर्णित है, बैक्टीरिया से डीएनए निकालने के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट हैं जोविशेष मामलों में अच्छी तरह से काम करते हैं। हालांकि, उनकी प्रयोज्यता लागत और आवश्यक नमूना मात्रा से सीमित है।
यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल लागत प्रभावी है और केवल थोड़ी मात्रा में नमूने की आवश्यकता होती है। यह किसी भी प्रकार के मल के नमूने के साथ ठीक काम करता है और समय के साथ-साथ समूहों के बीच तुलना के साथ आंत माइक्रोबायोटा की गतिशीलता का अध्ययन करने में उपयोगी है। डीएनए को अल्कोहल शुद्धिकरण की एक विधि के साथ अलग किया जाता है, जो फिनोल, क्लोरोफॉर्म और आइसोएमिल अल्कोहल का उपयोग करता है। अल्कोहल आधारित निष्कर्षण प्रोटीन और लिपिड के नमूने को साफ करने और हटाने में मदद करता है, जहां डीएनए अंतिम चरण में अवक्षेपित होता है। प्रस्तावित विधि में काफी उच्च दक्षता और गुणवत्ता है और बैक्टीरिया की आबादी की पहचान करने में सटीक साबित हुई है। प्रक्रिया के दौरान एक महत्वपूर्ण नोट यह है कि डीएनए संदूषण हो सकता है, और इस प्रकार उचित नमूना हैंडलिंगकी आवश्यकता होती है।
डीएनए का विश्लेषण तब 16 एस आरआरएनए जीन के लिए अगली पीढ़ी के अनुक्रमण प्लेटफार्मों द्वारा किया जाता है, जैसे कि इलुमिना मिसेक। विशेष रूप से, वी 4 हाइपर-वैरिएबल क्षेत्र का विश्लेषण उच्च रैंक टैक्सा13 के लिए बेहतर परिमाणीकरण प्रदान करने के लिए किया जाता है। बाद के जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण को आउटसोर्स किया जाता है, इसके बाद मानक सांख्यिकीय विधियों का उपयोग करके इन-हाउस विश्लेषण किया जाता है। डाउनस्ट्रीम अनुक्रमण के लिए कई ओपन-सोर्स जैव सूचना विज्ञान सॉफ्टवेयर प्रोग्राम उपलब्ध हैं, और किए गए विश्लेषणों का प्रकार रुचि के विशिष्ट जैविक प्रश्न पर बहुत अधिक निर्भर करताहै। यह प्रोटोकॉल अनुक्रमण से पहले प्रयोगात्मक चरणों पर विशेष रूप से केंद्रित है और फेकल नमूनों से डीएनए प्राप्त करने के लिए एक अधिक बहुमुखी, लागत प्रभावी, तुलनीय और कुशल विधि प्रदान करता है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1 mm glass beads</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>11079101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL screw cap tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>3488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% SDS</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>BP1311-1</td>
			<td>SDS 20%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96% Ethanol, Molecular Biology Grade</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T032021000CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Acetate (5 M)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9071</td>
			<td>NH4AC 5M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>005582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bullet Blender storm 24</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>4116-BBY24M</td>
			<td>Homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>C298-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC-Treated Water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine Tetraacetic Acid</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>BP118-500</td>
			<td>EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foil plate seal</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>NC0302491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes-Kimtech 34256</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>06-666C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRL/MpJ-Faslpr/J (MRL/lpr) mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>000485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 2000 spectrophotomer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND2000CLAPTOP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol: chloroform: isoamylalchohol (25:24:1)</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>BP1752I-400</td>
			<td>PCI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale with 4 decimals</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>MS205DU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skirted 96-well plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AB-0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>15528154</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Hydrochloride</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>BP1757-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of fecal microbiota dynamics in lupus-prone mice using a simple, cost-effective dna isolation method

प्रतिरक्षा प्रणाली को शिक्षित करने में आंत माइक्रोबायोटा की महत्वपूर्ण भूमिका है। यह संबंध ऑटोइम्यून बीमारियों को समझने के लिए बेहद महत्वपूर्ण है जो न केवल आनुवंशिक कारकों से प्रेरित होते हैं, बल्कि पर्यावरणीय कारक भी होते हैं जो रोग पाठ्यक्रम की शुरुआत और / या खराब कर सकते हैं। ल्यूपस-प्रवण एमआरएल / एलपीआर मादा चूहों में आंत माइक्रोबायोटा की गतिशीलता पर पहले प्रकाशित एक अध्ययन से पता चला है कि आंत माइक्रोबायोटा के परिवर्तन रोग की प्रगति को कैसे बदल सकते हैं। यहां, ऑटोइम्यूनिटी के अध्ययन के लिए आंत माइक्रोबायोटा से प्रतिनिधि नमूने निकालने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है। माइक्रोबायोटा के नमूने गुदा से एकत्र किए जाते हैं और संसाधित किए जाते हैं, जिसमें से डीएनए को फिनोल-क्लोरोफॉर्म विधि का उपयोग करके निकाला जाता है और अल्कोहल वर्षा द्वारा शुद्ध किया जाता है। पीसीआर किए जाने के बाद, आर्गोन नेशनल लेबोरेटरी में अगली पीढ़ी के अनुक्रमण मंच का उपयोग करके शुद्ध एम्प्लिकॉन को अनुक्रमित किया जाता है। अंत में, 16 एस राइबोसोमल आरएनए जीन अनुक्रमण डेटा का विश्लेषण किया जाता है। एक उदाहरण के रूप में, सीएक्स3सीआर 1 के साथ या बिना एमआरएल / एलपीआर चूहों की आंत माइक्रोबायोटा तुलना से प्राप्त डेटा दिखाया गया है। परिणामों ने रोगजनक बैक्टीरिया वाले जेनेरा में महत्वपूर्ण अंतर दिखाया जैसे कि फाइलम प्रोटियोबैक्टीरिया, साथ ही जीनस बिफीडोबैक्टीरियम, जिसे स्वस्थ कॉमेंसल माइक्रोबायोटा का हिस्सा माना जाता है। सारांश में, यह सरल, लागत प्रभावी डीएनए अलगाव विधि विश्वसनीय है और ऑटोइम्यून बीमारियों से जुड़े आंत माइक्रोबायोटा परिवर्तनों की जांच में मदद कर सकती है।

आर्गोन नेशनल लेबोरेटरी के परिणामों का विश्लेषण एक योग्य जैव सूचना विज्ञानी द्वारा किया जाता है, इसके बाद मानक सांख्यिकीय विधियों का उपयोग करके डेटा का इन-हाउस विश्लेषण किया जाता है। विशिष्ट माइक्रोब...

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Analysis of Fecal Microbiota Dynamics in Lupus-Prone Mice Using a Simple, Cost-Effective DNA Isolation Method

यह प्रोटोकॉल ऑटोइम्यून बीमारी के विकास के दौरान मुराइन आंत माइक्रोबायोटा परिवर्तन के विश्लेषण के लिए एक सरल, लागत प्रभावी डीएनए अलगाव विधि प्रदान करता है।

एक सरल, लागत प्रभावी डीएनए अलगाव विधि का उपयोग करके ल्यूपस-प्रवण चूहों में फेकल माइक्रोबायोटा गतिशीलता का विश्लेषण

Gut microbiota has an important role in educating the immune system. This relationship is extremely important for understanding autoimmune diseases that ...

प्रस्तावित डीएनए अलगाव विधि ऑटोइम्यून रोगों माउस मॉडल में आंत माइक्रोबायोटा गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए काम कर सकती है। फेकल नमूनों से डीएनए प्राप्त करने के लिए एक अधिक बहुमुखी, लागत प्रभावी और कुशल विधि प्रस्तावित है जो व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट के बराबर हैं। शुरू करने के लिए, प्रत्येक माउस को व्यक्तिगत रूप से अपने पिंजरे से बाहर निकालें, गुदा से सीधे एक फेकल गोली एकत्र करें और इसे संसाधित होने तक शून्य से 80 डिग्री सेल्सियस नीचे स्टोर करें।बाँझ और साफ बल, ट्यूब और दस्ताने के साथ नमूने को संसाधित करें। एक पूर्व-वजन, दो मिलीलीटर स्क्रू कैप ट्यूब में एक जमे हुए गोली जोड़ें, और ग्राम में फेकल वजन रिकॉर्ड करें, जो 0.02 से 0.05 ग्राम प्रति फेकल गोली के बीच होना चाहिए। गोली में 0.1 मिलीमीटर ग्लास बीड्स की एक पतली परत, लाइसिस बफर के 500 माइक्रोलीटर और 20% सोडियम डोडेसिल सल्फेट के 200 माइक्रोलीटर जोड़ें।बीड ने एक होमोजेनाइज़र में चार मिनट के लिए ट्यूब को हराया, इसके बाद तीन से पांच मिनट का भंवर। बुलबुले और फोम को खत्म करने के लिए ट्यूबों को थोड़े समय के लिए सेंट्रीफ्यूज करें। माइक्रोबायोटा के नमूनों से डीएनए निकालने के लिए, नमूना सतह पर तैरने वाले 350 माइक्रोलीटर को बिना किसी मलबे के एक नए, 1.5 मिलीलीटर स्नैप कैप ट्यूब में स्थानांतरित करें।फिनोल: क्लोरोफॉर्म: आइसोमिल अल्कोहल के 500 माइक्रोलीटर जोड़ें, 25: 24: 1 के अनुपात में, और एक मिनट के लिए भंवर। सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, शीर्ष जलीय चरण के 180 माइक्रोलीटर को एक नए, 1.5 मिलीलीटर स्नैप कैप ट्यूब में स्थानांतरित करें। क्लोरोफॉर्म के 180 माइक्रोलीटर जोड़ें, इनवर्ट करें और मिलाएं।इससे, जलीय चरण के 180 माइक्रोलीटर को एक नए स्नैप कैप ट्यूब में स्थानांतरित करें। एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में, कोल्ड आइसोप्रोपेनॉल के 180 माइक्रोलीटर और पांच मोलर अमोनियम एसीटेट के 36 माइक्रोलीटर जोड़ें। मिश्रण करने के लिए इसे कुछ बार पलटें, और ट्यूब को 20 मिनट के लिए बर्फ पर रखें।सतह पर तैरने वाले को त्याग दें, इसके बाद छर्रों को ठंडे 70% इथेनॉल के 500 माइक्रोलीटर के साथ कई बार धोएं। सतह पर तैरने वाला छोड़ दें, और ट्यूब को 20 मिनट के लिए टिशू पेपर पर उल्टा सुखाएं, जब तक कि गोली स्पष्ट न हो जाए। आणविक ग्रेड पानी के 50 माइक्रोलीटर में गोली को निलंबित करें, और बड़े डीएनए छर्रों को पूरी तरह से भंग करने के लिए 10 मिनट के लिए तरल को 37 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करें।गर्म करने के बाद, ढक्कन से संघनन बूंदों को पुनर्प्राप्त करने के लिए एक मिनट के लिए 3,400 गुना जी पर इन ट्यूबों को सेंट्रीफ्यूज करें। एकाग्रता को मापें, और स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके 260/280 अनुपात प्राप्त करें। अच्छी गुणवत्ता वाले डीएनए के लिए एक अनुपात आम तौर पर 1.8 और दो के बीच होता है।तैयार नमूनों को कमरे के तापमान पर एक मिनट के लिए 600 गुना जी पर सेंट्रीफ्यूज करें, 24 घंटे के लिए शून्य से 80 डिग्री सेल्सियस नीचे ठंड से पहले। फिर, अनुक्रमण के लिए आर्गोन नेशनल लेबोरेटरी को एक से 50 नैनोग्राम प्रति माइक्रोलीटर तक की सांद्रता वाले नमूनों के 20 माइक्रोलीटर भेजें। रिसेप्टर सीएक्स 3सीआर 1 की कमी वाले माउस स्ट्रेन में जंगली प्रकार के एमआरएल / एलपीआर, एमआरएल / एलपीआर-सीएक्स 3 सीआर 1 जीएफपी / जीएफपी चूहों की तुलना में एक अलग आंत माइक्रोबायोटा संरचना होती है, जो संभावित रोगजनक बैक्टीरिया जैसे कि फाइलम प्रोटियोबैक्टीरिया के लिए प्रासंगिक है।नमूने को दूषित करने से सावधान रहें। इसे बाँझ होने की जरूरत है। इसके अलावा, एक नई ट्यूब में सतह पर तैरने वाले को स्थानांतरित करते समय सटीकता के साथ पाइपिंग करना महत्वपूर्ण है।यह विधि पीसीआर, प्रतिबंध एंजाइम पाचन, या जीनोमिक लाइब्रेरी निर्माण जैसे आणविक विश्लेषण के लिए उपयुक्त है। ल्यूपस में, हमने आंत माइक्रोबायोटा और ल्यूपस प्रगति के बीच एक मजबूत संबंध साबित किया।

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