Name: analysis of fecal microbiota dynamics in lupus-prone mice using a simple, cost-effective dna isolation method
Uploaded: 2022-05-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Fecal Microbiota Dynamics in Lupus-Prone Mice Using a Simple, Cost-Effective DNA Isolation Method at JoVE.com

Apprezziamo l'aiuto dell'Argonne National Laboratory e dei nostri bioinformatici che collaborano. Questo lavoro è supportato da vari NIH e sovvenzioni interne.

Il locus Cx3cr1 gfp/gfp dei topi B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J è stato reincrociato con MRL/MpJ-Fas lpr/J (MRL/lpr) per 10 generazioni per generare topi MRL/lpr-CX 3 CR1 gfp/gfp. Lo screening del genoma utilizzando pannelli di polimorfismo a singolo nucleotide (SNP) ha confermato che il background genetico dei topi di nuova generazione era identico per oltre il 97% a quello di MRL / lpr. Successivamente, i topi sono stati allevati e mantenuti in uno...

<ol>
	<li>Lee, Y. K., Mazmanian, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Has+the+microbiota+played+a+critical+role+in+the+evolution+of+the+adaptive+immune+system.">Has the microbiota played a critical role in the evolution of the adaptive immune system.</a> Science. 330 (6012), 1768-1773 (2010).</li><li>Lee, Y. K., Menezes, J. S., Umesaki, Y., Mazmanian, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proinflammatory+T-cell+responses+to+gut+microbiota+promote+experimental+autoimmune+encephalomyelitis.">Proinflammatory T-cell responses to gut microbiota promote experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 4615-4622 (2011).</li><li>Yeoh, N., Burton, J. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLE:+another+autoimmune+disorder+influenced+by+microbes+and+diet.">SLE: another autoimmune disorder influenced by microbes and diet.</a> Frontiers of Immunology. 6, 608 (2015).</li><li>Tektonidou, M. G., Wang, Z., Dasgupta, A., Ward, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burden+of+serious+infections+in+adults+with+systemic+lupus+erythematosus:+a+national+population-based+study.">Burden of serious infections in adults with systemic lupus erythematosus: a national population-based study.</a> Arthritis Care &amp; Research. 67 (8), 1078-1085 (2015).</li><li>Mu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+lupus+nephritis+by+changes+of+gut+microbiota.">Control of lupus nephritis by changes of gut microbiota.</a> Microbiome. 5 (1), 73 (2017).</li><li>Panek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodology+challenges+in+studying+human+gut+microbiota+-+effects+of+collection,+storage,+DNA+extraction+and+next+generation+sequencing+technologies.">Methodology challenges in studying human gut microbiota - effects of collection, storage, DNA extraction and next generation sequencing technologies.</a> Scientific Reports. 8 (1), 5143 (2018).</li><li>Fiedorov&#225;, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+dna+extraction+methods+on+stool+bacterial+and+fungal+microbiota+community+recovery.">The impact of dna extraction methods on stool bacterial and fungal microbiota community recovery.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 821 (2019).</li><li>Gerasimidis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+DNA+extraction+methodology+on+gut+microbiota+research+applications.">The effect of DNA extraction methodology on gut microbiota research applications.</a> BMC Research Notes. 9, 365 (2016).</li><li>Bukin, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+16S+rRNA+region+choice+on+bacterial+community+metabarcoding+results.">The effect of 16S rRNA region choice on bacterial community metabarcoding results.</a> Scientific Data. 6 (1), 190007 (2019).</li><li>Galloway-Pe&#241;a, J., Hanson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+analysis+of+the+microbiome.">Tools for analysis of the microbiome.</a> Digestive Diseases and Sciences. 65 (3), 674-685 (2020).</li><li>Sharpton, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+the+analysis+of+shotgun+metagenomic+data.">An introduction to the analysis of shotgun metagenomic data.</a> Frontiers in Plant Science. 5, 209 (2014).</li></ol>

Il microbiota intestinale equilibrato può proteggere il corpo umano dalle malattie. Una volta che questo equilibrio viene interrotto da fattori scatenanti esterni o interni, le conseguenze possono essere devastanti. Questo metodo presenta un modo per analizzare la dinamica del microbiota intestinale in modelli murini. Il metodo è adatto non solo per i confronti tra gruppi, ma anche per tracciare il microbiota intestinale nel tempo per identificare meglio i fattori dipendenti dal tempo che interrompono il microbiota int...

Esseri umani e batteri hanno coesistito per molto tempo. Hanno stabilito una relazione codipendente con effetti benefici reciproci che influenza le risposte immunitarie dell'ospite in modi quantitativi e qualitativi1. Studi recenti suggeriscono un'associazione tra la composizione del microbiota intestinale e la patogenesi delle malattie autoimmuni che includono la sclerosi multipla 2, l'artrite reumatoide3, il diabete di tipo2 4, la malattia infiammatoria intestinale5 e il lupus eritematoso sistemico (LES)6. Tuttavia, non è ancora chiaro se il microbiota intestinale sia la causa principale o un effetto secondario di queste malattie autoimmuni7. Potenzialmente, il microbiota intestinale potrebbe esacerbare la malattia durante la fase effettrice dei disturbi autoimmuni o svolgere un ruolo nella regolazione dell'induzione di queste malattie8.
La disbiosi intestinale è stata riportata in topi MRL/Mp-Faslpr (MRL/lpr) femminili inclini al lupus e sono stati osservati cambiamenti del microbiota intestinale con una significativa deplezione di lattobacilli9. Quando una miscela di cinque ceppi di Lactobacillus è stata somministrata per via orale, i sintomi simili al lupus sono stati ampiamente attenuati in questi topi, suggerendo un ruolo essenziale del microbiota nella regolazione della patogenesi del LES.
La seguente tecnica di estrazione del DNA consente di seguire le fluttuazioni del microbiota e analizzarle qualitativamente e quantitativamente durante il decorso della malattia murina simile al LES nei topi inclini al lupus. Sia che si tratti di esaminare il microbiota intestinale sano o di definire la disbiosi, è importante esaminare criticamente come vengono raccolti i dati e se sono accurati e riproducibili10. Ogni fase è fondamentale in questo processo. È necessario utilizzare una metodologia appropriata per estrarre il DNA microbico poiché qualsiasi possibile problema che introduce distorsioni durante il processo di estrazione del DNA potrebbe comportare una rappresentazione microbica imprecisa. Mentre il metodo fenolo-cloroformio è descritto qui, ci sono kit disponibili in commercio per estrarre il DNA da batteri che funzionano bene in casi particolari11. Tuttavia, la loro usabilità è limitata dal costo e dalla quantità di campione richiesta.
Il protocollo qui presentato è conveniente e richiede solo una piccola quantità di campione. Funziona bene con qualsiasi tipo di campione di feci ed è utile nello studio delle dinamiche del microbiota intestinale nel tempo e nei confronti tra gruppi. Il DNA viene isolato con un metodo di purificazione dell'alcol, che utilizza fenolo, cloroformio e alcol isoamilico. L'estrazione a base alcolica aiuta a pulire e rimuovere il campione di proteine e lipidi, dove il DNA viene precipitato nella fase finale. Il metodo proposto ha un'efficienza e una qualità significativamente elevate e si è dimostrato accurato nell'identificazione delle popolazioni batteriche. Una nota critica durante la procedura è che può verificarsi una contaminazione del DNA e quindi è necessaria un'appropriata gestione del campione12.
Il DNA viene quindi analizzato dalle piattaforme Next Generation Sequencing per il gene rRNA 16S, come l'Illumina MiSeq. In particolare, la regione iper-variabile V4 viene analizzata per fornire una migliore quantificazione per i taxa di alto rango13. La successiva analisi bioinformatica viene esternalizzata, seguita da un'analisi interna utilizzando metodi statistici standard. Esistono numerosi programmi software bioinformatici open source disponibili per il sequenziamento a valle e il tipo di analisi eseguite dipende fortemente dalla specifica questione biologica di interesse14. Questo protocollo si concentra specificamente sulle fasi sperimentali prima del sequenziamento e fornisce un metodo più versatile, economico, confrontabile ed efficiente per ottenere DNA da campioni fecali.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1 mm glass beads</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>11079101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL screw cap tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>3488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% SDS</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>BP1311-1</td>
			<td>SDS 20%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96% Ethanol, Molecular Biology Grade</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T032021000CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Acetate (5 M)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9071</td>
			<td>NH4AC 5M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>005582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bullet Blender storm 24</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>4116-BBY24M</td>
			<td>Homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>C298-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC-Treated Water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine Tetraacetic Acid</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>BP118-500</td>
			<td>EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foil plate seal</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>NC0302491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes-Kimtech 34256</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>06-666C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRL/MpJ-Faslpr/J (MRL/lpr) mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>000485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 2000 spectrophotomer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND2000CLAPTOP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol: chloroform: isoamylalchohol (25:24:1)</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>BP1752I-400</td>
			<td>PCI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale with 4 decimals</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>MS205DU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skirted 96-well plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AB-0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>15528154</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Hydrochloride</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>BP1757-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of fecal microbiota dynamics in lupus-prone mice using a simple, cost-effective dna isolation method

Il microbiota intestinale ha un ruolo importante nell'educazione del sistema immunitario. Questa relazione è estremamente importante per comprendere le malattie autoimmuni che non sono solo guidate da fattori genetici, ma anche da fattori ambientali che possono innescare l'insorgenza e / o peggiorare il decorso della malattia. Uno studio precedentemente pubblicato sulla dinamica del microbiota intestinale nei topi femmina MRL / lpr inclini al lupus ha mostrato come i cambiamenti del microbiota intestinale possono alterare la progressione della malattia. Qui, viene descritto un protocollo per estrarre campioni rappresentativi dal microbiota intestinale per studi di autoimmunità. I campioni di microbiota vengono raccolti dall'ano e lavorati, da cui il DNA viene estratto utilizzando un metodo fenolo-cloroformio e purificato mediante precipitazione alcolica. Dopo l'esecuzione della PCR, gli ampliconi purificati vengono sequenziati utilizzando una piattaforma di sequenziamento di nuova generazione presso l'Argonne National Laboratory. Infine, vengono analizzati i dati di sequenziamento del gene RNA ribosomiale 16S. Ad esempio, vengono mostrati i dati ottenuti dai confronti del microbiota intestinale di topi MRL / lpr con o senza CX3CR1. I risultati hanno mostrato differenze significative nei generi contenenti batteri patogeni come quelli del phylum Proteobacteria, così come il genere Bifidobacterium, che è considerato parte del microbiota commensale sano. In sintesi, questo metodo di isolamento del DNA semplice ed economico è affidabile e può aiutare lo studio dei cambiamenti del microbiota intestinale associati alle malattie autoimmuni.

I risultati dell'Argonne National Laboratory sono analizzati da un bioinformatico qualificato, seguito da un'analisi interna dei dati utilizzando metodi statistici standard. Le tipiche analisi del microbioma comportano il raggruppamento di sequenze simili in unità tassonomiche operative (OTU) o varianti di sequenza ampliconica (ASV) come proxy per diversi microrganismi in un campione. I conteggi di OTU o ASV tra i campioni possono quindi essere utilizzati per verificare i cambiamenti nella diversità all'interno del cam...

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Analysis of Fecal Microbiota Dynamics in Lupus-Prone Mice Using a Simple, Cost-Effective DNA Isolation Method

Questo protocollo fornisce un metodo di isolamento del DNA semplice ed economico per l'analisi delle alterazioni del microbiota intestinale murino durante lo sviluppo della malattia autoimmune.

Analisi della dinamica del microbiota fecale in topi inclini al lupus utilizzando un metodo di isolamento del DNA semplice ed economico

Gut microbiota has an important role in educating the immune system. This relationship is extremely important for understanding autoimmune diseases that ...

Il metodo di isolamento del DNA proposto può servire a studiare le dinamiche del microbiota intestinale in modelli murini di malattie autoimmuni. Viene proposto un metodo più versatile, economico ed efficiente per ottenere DNA da campioni fecali paragonabili ai kit disponibili in commercio. Per iniziare, prendi ogni topo individualmente fuori dalla sua gabbia, raccogli un pellet fecale direttamente dall'ano e conservalo a meno 80 gradi Celsius fino a quando non viene elaborato.Elaborare i campioni con pinze, tubi e guanti sterili e puliti. Aggiungere un pellet congelato a un tubo a vite pre-pesato da due millilitri e registrare il peso fecale in grammi, che dovrebbe essere compreso tra 0,02 e 0,05 grammi per pellet fecale. Aggiungere al pellet uno strato sottile di perle di vetro da 0,1 millimetri, 500 microlitri di tampone di lisi e 200 microlitri di solfato di dodecile di sodio al 20%.Bead ha battuto il tubo per quattro minuti in un omogeneizzatore, seguito da tre a cinque minuti di vortice. Centrifugare i tubi per un breve periodo per eliminare le bolle e la schiuma. Per estrarre il DNA dai campioni di microbiota, trasferire 350 microlitri di surnatante del campione in un nuovo tubo a scatto da 1,5 millilitri, senza detriti.Aggiungere 500 microlitri di fenolo:cloroformio:alcool isoamilico, in un rapporto di 25:24:1, e vortice per un minuto. Dopo la centrifugazione, trasferire 180 microlitri della fase acquosa superiore in un nuovo tubo a scatto da 1,5 millilitri. Aggiungere 180 microlitri di cloroformio, capovolgere e mescolare.Da questo, trasferire 180 microlitri della fase acquosa in un nuovo tubo a scatto. In un armadio di biosicurezza, aggiungere 180 microlitri di isopropanolo freddo e 36 microlitri di acetato di ammonio a cinque molari. Capovolgere un paio di volte per mescolare e posizionare il tubo sul ghiaccio per 20 minuti.Scartare il surnatante, seguito dal lavaggio del pellet più volte con 500 microlitri di etanolo freddo al 70%. Scartare il surnatante e asciugare all'aria il tubo capovolto su carta velina per 20 minuti, fino a quando il pellet diventa chiaro. Sospendi il pellet in 50 microlitri di acqua molecolare e riscalda il liquido a 37 gradi Celsius per 10 minuti per sciogliere completamente grandi pellet di DNA.Dopo il riscaldamento, centrifugare questi tubi a 3.400 volte G per un minuto per recuperare le goccioline di condensa dal coperchio. Misurare la concentrazione e ottenere il rapporto 260/280 utilizzando uno spettrofotometro. Un rapporto per il DNA di buona qualità è generalmente compreso tra 1,8 e due.Centrifugare i campioni preparati a 600 volte G per un minuto a temperatura ambiente, prima di congelare a meno 80 gradi Celsius per 24 ore. Quindi, inviare 20 microlitri di campioni con concentrazioni comprese tra uno e 50 nanogrammi per microlitri all'Argonne National Laboratory per il sequenziamento. Il ceppo murino privo del recettore CX3CR1 ha una diversa composizione del microbiota intestinale rispetto ai topi MRL / LPR wild-type, MRL / lpr-CX3CR1 GFP / GFP, mostra differenze significative in alcuni generi, rilevanti per batteri potenzialmente patogeni come quelli nel phylum Proteobacteria.Fare attenzione a contaminare il campione. Deve essere sterile. Inoltre, è importante pipettare con precisione quando si trasferisce il surnatante in un nuovo tubo.Questo metodo è adatto per l'analisi molecolare come la PCR, la digestione enzimatica di restrizione o la costruzione di librerie genomiche. Nel lupus, abbiamo dimostrato una forte relazione tra il microbiota intestinale e la progressione del lupus.

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