Name: analysis of fecal microbiota dynamics in lupus-prone mice using a simple, cost-effective dna isolation method
Uploaded: 2022-05-02T14:00:00
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아르곤 국립 연구소와 협력하는 생물 정보학자의 도움에 감사드립니다. 이 작업은 다양한 NIH 및 내부 보조금으로 지원됩니다.

B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J 마우스의 Cx3cr1 gfp/gfp 유전자좌를 MRL/Lpr-CX3 CR1 gfp/gfp 마우스를 생성하기 위해 10세대 동안 MRL/MpJ-Fas lpr/J(MRL/lpr)로 역교배하였다. 단일 염기 다형성(SNP) 패널을 사용한 게놈 스크리닝은 새로 생성된 마우스의 유전적 배경이 MRL/lpr의 유전적 배경과 97% 이상 동일하다는 것을 확인했습니다. 그 후, 마우스는 버지니아 공대의 기?...

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	<li>Lee, Y. K., Mazmanian, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Has+the+microbiota+played+a+critical+role+in+the+evolution+of+the+adaptive+immune+system.">Has the microbiota played a critical role in the evolution of the adaptive immune system.</a> Science. 330 (6012), 1768-1773 (2010).</li><li>Lee, Y. K., Menezes, J. S., Umesaki, Y., Mazmanian, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proinflammatory+T-cell+responses+to+gut+microbiota+promote+experimental+autoimmune+encephalomyelitis.">Proinflammatory T-cell responses to gut microbiota promote experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 4615-4622 (2011).</li><li>Yeoh, N., Burton, J. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burden+of+serious+infections+in+adults+with+systemic+lupus+erythematosus:+a+national+population-based+study.">Burden of serious infections in adults with systemic lupus erythematosus: a national population-based study.</a> Arthritis Care &amp; Research. 67 (8), 1078-1085 (2015).</li><li>Mu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+lupus+nephritis+by+changes+of+gut+microbiota.">Control of lupus nephritis by changes of gut microbiota.</a> Microbiome. 5 (1), 73 (2017).</li><li>Panek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodology+challenges+in+studying+human+gut+microbiota+-+effects+of+collection,+storage,+DNA+extraction+and+next+generation+sequencing+technologies.">Methodology challenges in studying human gut microbiota - effects of collection, storage, DNA extraction and next generation sequencing technologies.</a> Scientific Reports. 8 (1), 5143 (2018).</li><li>Fiedorov&#225;, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+dna+extraction+methods+on+stool+bacterial+and+fungal+microbiota+community+recovery.">The impact of dna extraction methods on stool bacterial and fungal microbiota community recovery.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 821 (2019).</li><li>Gerasimidis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+DNA+extraction+methodology+on+gut+microbiota+research+applications.">The effect of DNA extraction methodology on gut microbiota research applications.</a> BMC Research Notes. 9, 365 (2016).</li><li>Bukin, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+16S+rRNA+region+choice+on+bacterial+community+metabarcoding+results.">The effect of 16S rRNA region choice on bacterial community metabarcoding results.</a> Scientific Data. 6 (1), 190007 (2019).</li><li>Galloway-Pe&#241;a, J., Hanson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+analysis+of+the+microbiome.">Tools for analysis of the microbiome.</a> Digestive Diseases and Sciences. 65 (3), 674-685 (2020).</li><li>Sharpton, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+the+analysis+of+shotgun+metagenomic+data.">An introduction to the analysis of shotgun metagenomic data.</a> Frontiers in Plant Science. 5, 209 (2014).</li></ol>

균형 잡힌 장내 미생물은 질병으로부터 인체를 보호 할 수 있습니다. 이 균형이 외부 또는 내부 트리거에 의해 중단되면 결과는 치명적일 수 있습니다. 이 방법은 쥐 모델에서 장내 미생물의 역학을 분석하는 방법을 제시합니다. 이 방법은 그룹 간의 비교뿐만 아니라 시간이 지남에 따라 장내 미생물총을 추적하여 장내 미생물총을 방해하는 시간 의존적 요인을 더 잘 식별하는 데에도 적합합니다....

인간과 박테리아는 오랫동안 공존해 왔습니다. 그들은 양적 및 질적 방식으로 숙주 면역 반응에 영향을 미치는 상호 유익한 효과와 상호 의존적 관계를 확립했습니다1. 최근 연구에 따르면 장내 미생물총과 다발성 경화증 2, 류마티스 관절염3, 제2형 당뇨병4, 염증성 장 질환5 및 전신성 홍반성 루푸스(SLE)6를 포함하는 자가면역 질환의 발병기전이 연관되어 있습니다. 그러나 장내 미생물이 이러한자가 면역 질환의 주요 원인인지 또는 2 차 효과인지는 여전히 불분명합니다7. 잠재적으로, 장내 미생물총은 자가면역 질환의 이펙터 단계에서 질병을 악화시키거나이러한 질병의 유도를 조절하는 역할을 할 수 있다8.
암컷 루푸스 경향이 있는 MRL/Mp-Faslpr(MRL/lpr) 마우스에서 장내 dysbiosis가 보고되었으며, 락토바실러스의 상당한 고갈과 함께 장내 미생물총의변화가 관찰되었습니다9. 5 가지 락토 바실러스 균주의 혼합물을 경구 투여했을 때,이 마우스에서 루푸스와 유사한 증상이 크게 약화되어 SLE 병인을 조절하는 데 미생물 총의 필수적인 역할을 시사합니다.
다음의 DNA 추출 기술은 루푸스 경향이있는 마우스에서 쥐 SLE와 유사한 질병의 과정에서 미생물 변동을 추적하고 정 성적 및 정량적으로 분석 할 수있게합니다. 건강한 장내 미생물을 검사하든 dysbiosis를 정의하든 데이터 수집 방법과 정확하고 재현 가능한지 비판적으로 조사하는 것이 중요합니다10. 이 과정에서 모든 단계가 중요합니다. DNA 추출 과정에서 편향을 도입할 수 있는 문제가 있으면 부정확한 미생물 표현이 발생할 수 있으므로 미생물 DNA를 추출하려면 적절한 방법론을 사용해야 합니다. 페놀-클로로포름 방법이 여기에 설명되어 있지만, 특정 경우에 잘 작동하는 박테리아로부터 DNA를 추출하는 시판되는 키트가 있습니다11. 그러나 유용성은 비용과 필요한 샘플 수량에 의해 제한됩니다.
여기에 제시된 프로토콜은 비용 효율적이며 소량의 샘플 만 필요합니다. 모든 종류의 대변 샘플에서 잘 작동하며 시간이 지남에 따라 장내 미생물의 역학과 그룹 간의 비교를 연구하는 데 유용합니다. DNA는 페놀, 클로로포름 및 이소아밀 알코올을 사용하는 알코올 정제 방법으로 분리됩니다. 알코올 기반 추출은 최종 단계에서 DNA가 침전되는 단백질 및 지질 샘플을 세척하고 제거하는 데 도움이 됩니다. 제안 된 방법은 상당히 높은 효율성과 품질을 가지며 박테리아 개체군을 식별하는 데 정확한 것으로 입증되었습니다. 절차 중 한 가지 중요한 점은 DNA 오염이 발생할 수 있으므로 적절한 샘플 처리가 필요하다는 것입니다12.
그런 다음 DNA는 Illumina MiSeq와 같은 16S rRNA 유전자에 대한 차세대 시퀀싱 플랫폼에 의해 분석됩니다. 특히, V4 초가변 영역은 상위 순위 분류군(13)에 대한 더 나은 정량화를 제공하기 위해 분석된다. 후속 생물 정보학 분석은 아웃소싱되고 표준 통계 방법을 사용한 사내 분석이 이어집니다. 다운스트림 시퀀싱에 사용할 수 있는 수많은 오픈 소스 생물정보학 소프트웨어 프로그램이 있으며 수행되는 분석 유형은 관심 있는 특정 생물학적 질문에 따라 크게 달라집니다14. 이 프로토콜은 특히 시퀀싱 이전의 실험 단계에 초점을 맞추고 분변 샘플에서 DNA를 얻기 위한 보다 다양하고 비용 효율적이며 비교 가능하고 효율적인 방법을 제공합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1 mm glass beads</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>11079101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL screw cap tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>3488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% SDS</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>BP1311-1</td>
			<td>SDS 20%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96% Ethanol, Molecular Biology Grade</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T032021000CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Acetate (5 M)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9071</td>
			<td>NH4AC 5M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>005582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bullet Blender storm 24</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>4116-BBY24M</td>
			<td>Homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>C298-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC-Treated Water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine Tetraacetic Acid</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>BP118-500</td>
			<td>EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foil plate seal</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>NC0302491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes-Kimtech 34256</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>06-666C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRL/MpJ-Faslpr/J (MRL/lpr) mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>000485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 2000 spectrophotomer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND2000CLAPTOP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol: chloroform: isoamylalchohol (25:24:1)</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>BP1752I-400</td>
			<td>PCI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale with 4 decimals</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>MS205DU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skirted 96-well plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AB-0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>15528154</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Hydrochloride</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>BP1757-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of fecal microbiota dynamics in lupus-prone mice using a simple, cost-effective dna isolation method

장내 미생물총은 면역 체계를 교육하는 데 중요한 역할을 합니다. 이 관계는 유전적 요인뿐만 아니라 발병을 유발하거나 질병 경과를 악화시킬 수 있는 환경적 요인에 의해 유발되는 자가면역 질환을 이해하는 데 매우 중요합니다. 루푸스가 발생하기 쉬운 MRL/lpr 암컷 마우스에서 장내 미생물총의 역학에 대해 이전에 발표된 연구는 장내 미생물총의 변화가 질병 진행을 어떻게 변화시킬 수 있는지 보여주었습니다. 여기서는자가 면역 연구를 위해 장내 미생물 총에서 대표 샘플을 추출하기위한 프로토콜이 설명됩니다. 미생물 총을 항문에서 채취하여 처리하고, 페놀 - 클로로포름 방법을 사용하여 DNA를 추출하고 알코올 침전으로 정제합니다. PCR이 수행된 후, 정제된 앰플리콘은 아르곤 국립 연구소의 차세대 시퀀싱 플랫폼을 사용하여 시퀀싱됩니다. 마지막으로 16S 리보솜 RNA 유전자 시퀀싱 데이터를 분석합니다. 예를 들어, CX3CR1이 있거나없는 MRL / lpr 마우스의 장내 미생물 비교에서 얻은 데이터가 표시됩니다. 결과는 프로테오박테리아 문과 같은 병원성 박테리아를 포함하는 속과 건강한 공생 미생물총의 일부로 간주되는 비피도박테리움 속에서 상당한 차이를 보여주었습니다. 요약하면, 이 간단하고 비용 효율적인 DNA 분리 방법은 신뢰할 수 있으며 자가면역 질환과 관련된 장내 미생물 변화를 조사하는 데 도움이 될 수 있습니다.

아르곤 국립 연구소의 결과는 자격을 갖춘 생물 정보학자가 분석 한 다음 표준 통계 방법을 사용하여 데이터를 사내 분석합니다. 일반적인 마이크로바이옴 분석에는 샘플의 다른 미생물에 대한 프록시로서 유사한 서열을 작동 분류학적 단위(OTU) 또는 앰플리콘 서열 변이체(ASV)로 클러스터링하는 것이 포함됩니다. 그런 다음 샘플 전체의 OTU 또는 ASV 수를 사용하여 샘플 내(알파) 다양성 및 샘플 간(...

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Analysis of Fecal Microbiota Dynamics in Lupus-Prone Mice Using a Simple, Cost-Effective DNA Isolation Method

이 프로토콜은 자가면역 질환 발병 중 쥐 장내 미생물 변화를 분석하기 위한 간단하고 비용 효율적인 DNA 분리 방법을 제공합니다.

간단하고 비용 효율적인 DNA 분리 방법을 사용한 루푸스 경향 마우스의 분변 미생물 역학 분석

Gut microbiota has an important role in educating the immune system. This relationship is extremely important for understanding autoimmune diseases that ...

제안된 DNA 분리 방법은 자가면역질환 마우스 모델에서 장내 미생물 역학을 연구하는 역할을 할 수 있습니다. 시판되는 키트에 필적하는 분변 샘플로부터 DNA를 얻기 위해 보다 다재다능하고 비용 효율적이며 효율적인 방법이 제안된다. 시작하려면 각 마우스를 케이지에서 개별적으로 꺼내 항문에서 직접 대변 펠릿을 수집하고 처리 될 때까지 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오.멸균되고 깨끗한 집게, 튜브 및 장갑으로 샘플을 처리하십시오. 미리 계량 된 2 밀리리터 스크류 캡 튜브에 냉동 펠릿을 추가하고 분변 중량을 그램 단위로 기록하면 분변 펠릿 당 0.02-0.05 그램 사이 여야합니다. 펠릿에 0.1mm 유리 비드, 500 마이크로 리터의 용해 완충액 및 200 마이크로 리터의 20 % 나트륨 도데 실 설페이트의 얇은 층을 추가하십시오.비드는 균질화기에서 4분 동안 튜브를 두들긴 다음 3-5분 동안 볼텍싱을 했습니다. 기포와 거품을 제거하기 위해 짧은 시간 동안 튜브를 원심 분리하십시오. 미생물군 샘플에서 DNA를 추출하려면 350마이크로리터의 샘플 상청액을 파편 없이 새로운 1.5밀리리터 스냅 캡 튜브로 옮깁니다.500마이크로리터의 페놀:클로로포름:이소아밀 알코올을 25:24:1의 비율로 추가하고 1분 동안 와동시킵니다. 원심분리 후, 180 마이크로리터의 상부 수성 상을 새로운 1.5 밀리리터 스냅 캡 튜브로 옮긴다. 180 마이크로 리터의 클로로포름을 넣고 뒤집어 혼합하십시오.이로부터 180 마이크로 리터의 수성 상을 새로운 스냅 캡 튜브로 옮깁니다. 생물 안전 캐비닛에 180 마이크로 리터의 차가운 이소프로판올과 36 마이크로 리터의 5 몰 암모늄 아세테이트를 추가하십시오. 몇 번 뒤집어 혼합하고 튜브를 얼음 위에 20분 동안 놓습니다.상청액을 버리고, 펠렛을 500 마이크로리터의 차가운 70%에탄올로 수회 세척하였다. 상청액을 버리고 펠릿이 깨끗해질 때까지 20분 동안 티슈 페이퍼에 튜브를 거꾸로 자연 건조시킵니다. 펠릿을 50마이크로리터의 분자 등급 물에 현탁하고 액체를 섭씨 37도에서 10분 동안 가열하여 큰 DNA 펠릿을 완전히 용해시킵니다.가열 후,이 튜브를 3, 400 배 G에서 1 분 동안 원심 분리하여 뚜껑에서 응축 방울을 회수하십시오. 농도를 측정하고, 분광 광도계를 사용하여 260/280 비를 구한다. 양질의 DNA에 대한 비율은 일반적으로 1.8과 2 사이입니다.준비된 샘플을 실온에서 1분 동안 600배 G로 원심분리한 후 섭씨 영하 80도에서 24시간 동안 동결시킨다. 그런 다음 시퀀싱을 위해 마이크로리터당 1에서 50나노그램 범위의 농도를 가진 20마이크로리터의 샘플을 아르곤 국립 연구소로 보냅니다. 수용체 CX3CR1이 결여된 마우스 균주는 야생형 MRL/lpr, MRL/lpr-CX3CR1 GFP/GFP 마우스와 비교하여 장내 미생물 구성이 다르며, 특정 속에서 유의미한 차이를 보이며, 이는 프로테오박테리아 문과 같은 잠재적 병원성 박테리아와 관련이 있습니다.시료 오염에 주의하십시오. 그것은 멸균되어야합니다. 또한 상청액을 새 튜브로 옮길 때 정확하게 피펫팅하는 것이 중요합니다.이 방법은 PCR, 제한 효소 소화 또는 게놈 라이브러리 구성과 같은 분자 분석에 적합합니다. 루푸스에서 우리는 장내 미생물총과 루푸스 진행 사이에 강한 관계가 있음을 입증했습니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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연구

면역학 및 감염병학

Cost-effective Method for Microbial Source Tracking Using Specific Human and Animal Viruses

특정 인간과 동물 바이러스를 사용하여 미생물 소스 추적을위한 비용 효율적인 방법

Microbial contamination of the environment represents a significant health risk. Classical bacterial fecal indicators have shown to have significant ...

A Method for Labeling Vasculature in Embryonic Mice

배아 마우스에 Vasculature을 라벨링하는 방법

The establishment of a functional blood vessel network is an essential part of organogenesis, and is required for optimal organ function. For example, in ...

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A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

에서 DNA 추출을위한 간단한 Chelex 프로토콜<em&gt; 아노펠레스</em&gt; 종.

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Isolation and Genome Analysis of Single Virions using 'Single Virus Genomics'

&#39;단일 바이러스 게놈&#39;을 사용하여 단일 비리의 분리 및 유전체 분석

Whole genome amplification and sequencing of single microbial cells enables genomic characterization without the need of cultivation 1-3. Viruses, which ...

An In Vitro Batch-culture Model to Estimate the Effects of Interventional Regimens on Human Fecal Microbiota

인체 배설물 미생물에 대한 중재 식이요법의 효과를 추정하는 시험관 내 배치 배양 모델

The emerging role of the gut microbiome in several human diseases demands a breakthrough of new tools, techniques and technologies. Such improvements are ...

Analysis of Interactions between Endobiotics and Human Gut Microbiota Using In Vitro Bath Fermentation Systems

체외 목욕 발효 시스템을 사용하여 내분비병제와 인간 장내 미생물 간의 상호 작용 분석

Human intestinal microorganisms have recently become an important target of research in promoting human health and preventing diseases. Consequently, ...

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예방 접종 된 마우스에서 항원 특정 CD8 T 세포의 세포 주기 분석을위한 DNA / Ki67 기반 유동 세포 분석

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Fecal (micro) RNA Isolation

Fecal micro RNA Isolation

분변(마이크로) RNA 분리

It is becoming clear that RNA exists in the gut lumen and feces in animals and humans. The protocol described below isolates total RNA including microRNAs ...

Therapeutic Evaluation of Fecal Microbiota Transplantation in an Interleukin 10-Deficient Mouse Model

인터루킨 10-결핍 마우스 모델에서 분변 미생물 이식의 치료 평가

With the development of microecology in recent years, the relationship between intestinal bacteria and inflammatory bowel disease (IBD) has attracted ...