Name: analysis of fecal microbiota dynamics in lupus-prone mice using a simple, cost-effective dna isolation method
Uploaded: 2022-05-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Fecal Microbiota Dynamics in Lupus-Prone Mice Using a Simple, Cost-Effective DNA Isolation Method at JoVE.com

Мы ценим помощь Аргоннской национальной лаборатории и наших сотрудничающих биоинформатиков. Эта работа поддерживается различными NIH и внутренними грантами.

Локус Cx3cr1gfp/gfp мышей B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J был перекрещен с MRL/MpJ-Fas lpr/J (MRL/lpr) в течение 10 поколений для генерации мышей MRL/lpr-CX3CR1 gfp/gfp. Скрининг генома с использованием панелей однонуклеотидного полиморфизма (SNP) подтвердил, что генетический фон недавно сген?...

<ol>
	<li>Lee, Y. K., Mazmanian, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Has+the+microbiota+played+a+critical+role+in+the+evolution+of+the+adaptive+immune+system.">Has the microbiota played a critical role in the evolution of the adaptive immune system.</a> Science. 330 (6012), 1768-1773 (2010).</li><li>Lee, Y. K., Menezes, J. S., Umesaki, Y., Mazmanian, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proinflammatory+T-cell+responses+to+gut+microbiota+promote+experimental+autoimmune+encephalomyelitis.">Proinflammatory T-cell responses to gut microbiota promote experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 4615-4622 (2011).</li><li>Yeoh, N., Burton, J. P., Suppiah, P., Reid, G., Stebbings, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+microbiome+in+rheumatic+diseases.">The role of the microbiome in rheumatic diseases.</a> Current Rheumatology Reports. 15 (3), 314 (2013).</li><li>Larsen, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+microbiota+in+human+adults+with+type+2+diabetes+differs+from+non-diabetic+adults.">Gut microbiota in human adults with type 2 diabetes differs from non-diabetic adults.</a> PLoS One. 5 (2), 9085 (2010).</li><li>Alam, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+imbalance+in+inflammatory+bowel+disease+patients+at+different+taxonomic+levels.">Microbial imbalance in inflammatory bowel disease patients at different taxonomic levels.</a> Gut Pathogens. 12 (1), (2020).</li><li>Vieira, S. M., Pagovich, O. E., Kriegel, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diet,+microbiota+and+autoimmune+diseases.">Diet, microbiota and autoimmune diseases.</a> Lupus. 23 (6), 518-526 (2014).</li><li>Mu, Q., Zhang, H., Luo, X. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLE:+another+autoimmune+disorder+influenced+by+microbes+and+diet.">SLE: another autoimmune disorder influenced by microbes and diet.</a> Frontiers of Immunology. 6, 608 (2015).</li><li>Tektonidou, M. G., Wang, Z., Dasgupta, A., Ward, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burden+of+serious+infections+in+adults+with+systemic+lupus+erythematosus:+a+national+population-based+study.">Burden of serious infections in adults with systemic lupus erythematosus: a national population-based study.</a> Arthritis Care &amp; Research. 67 (8), 1078-1085 (2015).</li><li>Mu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+lupus+nephritis+by+changes+of+gut+microbiota.">Control of lupus nephritis by changes of gut microbiota.</a> Microbiome. 5 (1), 73 (2017).</li><li>Panek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodology+challenges+in+studying+human+gut+microbiota+-+effects+of+collection,+storage,+DNA+extraction+and+next+generation+sequencing+technologies.">Methodology challenges in studying human gut microbiota - effects of collection, storage, DNA extraction and next generation sequencing technologies.</a> Scientific Reports. 8 (1), 5143 (2018).</li><li>Fiedorov&#225;, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+dna+extraction+methods+on+stool+bacterial+and+fungal+microbiota+community+recovery.">The impact of dna extraction methods on stool bacterial and fungal microbiota community recovery.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 821 (2019).</li><li>Gerasimidis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+DNA+extraction+methodology+on+gut+microbiota+research+applications.">The effect of DNA extraction methodology on gut microbiota research applications.</a> BMC Research Notes. 9, 365 (2016).</li><li>Bukin, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+16S+rRNA+region+choice+on+bacterial+community+metabarcoding+results.">The effect of 16S rRNA region choice on bacterial community metabarcoding results.</a> Scientific Data. 6 (1), 190007 (2019).</li><li>Galloway-Pe&#241;a, J., Hanson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+analysis+of+the+microbiome.">Tools for analysis of the microbiome.</a> Digestive Diseases and Sciences. 65 (3), 674-685 (2020).</li><li>Sharpton, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+the+analysis+of+shotgun+metagenomic+data.">An introduction to the analysis of shotgun metagenomic data.</a> Frontiers in Plant Science. 5, 209 (2014).</li></ol>

Сбалансированная микробиота кишечника может защитить организм человека от заболеваний. Как только этот баланс нарушается внешними или внутренними триггерами, последствия могут быть разрушительными. Этот метод представляет собой способ анализа динамики кишечной микробиоты в мышины?...

Люди и бактерии сосуществуют уже давно. Они установили созависимую связь с взаимовыгодными эффектами, которая влияет на иммунные реакции хозяина количественными и качественными способами1. Недавние исследования предполагают связь между составом микробиоты кишечника и патогенезом аутоиммунных заболеваний, которые включают рассеянный склероз2, ревматоидный артрит3, диабет 2 типа4, воспалительное заболевание кишечника5 и системную красную волчанку (СКВ)6. Однако является ли микробиота кишечника основной причиной или вторичным эффектом этих аутоиммунных заболеваний, до сих пор неясно7. Потенциально микробиота кишечника может усугубить заболевание во время эффекторной фазы аутоиммунных расстройств или играть роль в регулировании индукции этих заболеваний8.
Сообщалось о дисбактериозе кишечника у самок мышей MRL/Mp-Faslpr (MRL/lpr), а изменения микробиоты кишечника со значительным истощением лактобактерий наблюдались9. Когда смесь из пяти штаммов Lactobacillus вводилась перорально, симптомы, подобные волчанке, были в значительной степени ослаблены у этих мышей, что свидетельствует о существенной роли микробиоты в регулировании патогенеза СКВ.
Следующая методика экстракции ДНК позволяет отслеживать колебания микробиоты и анализировать их качественно и количественно при течении мышиной СКВ-подобной болезни у склонных к волчанке мышей. Независимо от того, следует ли исследовать здоровую микробиоту кишечника или определить дисбактериоз, важно критически изучить, как собираются данные и являются ли они точными и воспроизводимыми10. Каждый шаг имеет решающее значение в этом процессе. Для извлечения микробной ДНК необходимо использовать соответствующую методологию, поскольку любая возможная проблема, приводящая к смещениям в процессе экстракции ДНК, может привести к неточному микробному представлению. Хотя фенол-хлороформный метод описан здесь, существуют коммерчески доступные наборы для извлечения ДНК из бактерий, которые хорошо работают в конкретных случаях11. Однако их удобство использования ограничено стоимостью и необходимым количеством образцов.
Протокол, представленный здесь, является экономически эффективным и требует лишь небольшого количества выборки. Он отлично работает с любым типом образца стула и полезен для изучения динамики микробиоты кишечника с течением времени, а также для сравнения между группами. ДНК выделяют методом очистки спирта, в котором используют фенол, хлороформ и изоамиловый спирт. Экстракция на спиртовой основе помогает очистить и удалить образец белков и липидов, где ДНК выпадает в осадок на заключительном этапе. Предложенный метод обладает значительно высокой эффективностью и качеством и доказал свою точность при выявлении бактериальных популяций. Одним из критических замечаний во время процедуры является то, что может произойти загрязнение ДНК, и, таким образом, требуется соответствующая обработка образцов12.
Затем ДНК анализируется платформами секвенирования следующего поколения для гена 16S рРНК, такими как Illumina MiSeq. В частности, гипервариабельная область V4 анализируется для обеспечения лучшей количественной оценки для высокоранговых таксонов13. Последующий анализ биоинформатики передается на аутсорсинг, за которым следует внутренний анализ с использованием стандартных статистических методов. Существует множество программ биоинформатики с открытым исходным кодом, доступных для последующего секвенирования, и тип выполняемых анализов в значительной степени зависит от конкретного биологического вопроса, представляющего интерес14. Этот протокол фокусируется конкретно на экспериментальных этапах до секвенирования и обеспечивает более универсальный, экономически эффективный, сопоставимый и эффективный метод получения ДНК из образцов фекалий.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1 mm glass beads</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>11079101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL screw cap tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>3488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% SDS</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>BP1311-1</td>
			<td>SDS 20%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96% Ethanol, Molecular Biology Grade</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T032021000CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Acetate (5 M)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9071</td>
			<td>NH4AC 5M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>005582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bullet Blender storm 24</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>4116-BBY24M</td>
			<td>Homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>C298-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC-Treated Water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine Tetraacetic Acid</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>BP118-500</td>
			<td>EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foil plate seal</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>NC0302491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes-Kimtech 34256</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>06-666C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRL/MpJ-Faslpr/J (MRL/lpr) mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>000485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 2000 spectrophotomer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND2000CLAPTOP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol: chloroform: isoamylalchohol (25:24:1)</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>BP1752I-400</td>
			<td>PCI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale with 4 decimals</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>MS205DU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skirted 96-well plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AB-0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>15528154</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Hydrochloride</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>BP1757-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of fecal microbiota dynamics in lupus-prone mice using a simple, cost-effective dna isolation method

Микробиота кишечника играет важную роль в обучении иммунной системы. Эта взаимосвязь чрезвычайно важна для понимания аутоиммунных заболеваний, которые обусловлены не только генетическими факторами, но и факторами окружающей среды, которые могут вызвать начало и / или ухудшить течение заболевания. Ранее опубликованное исследование динамики кишечной микробиоты у самок мышей, склонных к волчанке, показало, как изменения микробиоты кишечника могут изменить прогрессирование заболевания. Здесь описан протокол извлечения репрезентативных образцов из микробиоты кишечника для исследований аутоиммунитета. Образцы микробиоты собирают из ануса и обрабатывают, из которого извлекают ДНК с помощью фенол-хлороформного метода и очищают спиртовым осаждением. После проведения ПЦР очищенные ампликоны секвенируются с помощью платформы секвенирования следующего поколения в Аргоннской национальной лаборатории. Наконец, анализируются данные секвенирования гена рибосомальной РНК 16S. В качестве примера показаны данные, полученные из сравнений кишечной микробиоты мышей MRL/lpr с CX3CR1 или без него. Результаты показали значительные различия в родах, содержащих патогенные бактерии, такие как в типе Proteobacteria, а также в роде Bifidobacterium, который считается частью здоровой комменсальной микробиоты. Таким образом, этот простой, экономически эффективный метод выделения ДНК является надежным и может помочь в исследовании изменений микробиоты кишечника, связанных с аутоиммунными заболеваниями.

Результаты Аргоннской национальной лаборатории анализируются квалифицированным биоинформатиком, после чего проводится внутренний анализ данных с использованием стандартных статистических методов. Типичные анализы микробиома включают кластеризацию аналогичных последовательност...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Fecal Microbiota Dynamics in Lupus-Prone Mice Using a Simple, Cost-Effective DNA Isolation Method at JoVE.com

Analysis of Fecal Microbiota Dynamics in Lupus-Prone Mice Using a Simple, Cost-Effective DNA Isolation Method

Этот протокол обеспечивает простой, экономически эффективный метод выделения ДНК для анализа изменений микробиоты кишечника мышей во время развития аутоиммунного заболевания.

Анализ динамики фекальной микробиоты у мышей, склонных к волчанке, с использованием простого, экономически эффективного метода выделения ДНК

Gut microbiota has an important role in educating the immune system. This relationship is extremely important for understanding autoimmune diseases that ...

Предложенный метод выделения ДНК может служить для изучения динамики кишечной микробиоты в аутоиммунных заболеваниях мышиных моделей. Предлагается более универсальный, экономичный и эффективный метод получения ДНК из образцов фекалий, которые сопоставимы с коммерчески доступными наборами. Для начала выньте каждую мышь индивидуально из своей клетки, соберите фекальную гранулу прямо из ануса и храните ее при минус 80 градусах Цельсия до тех пор, пока она не будет обработана.Обработайте образцы стерильными и чистыми щипцами, трубками и перчатками. Добавьте замороженную гранулу в предварительно взвешенную двухмиллитровую шнековую колпачок и запишите вес фекалий в граммах, который должен составлять от 0,02 до 0,05 г на фекальную гранулу. Добавьте к грануле тонкий слой стеклянных шариков размером 0,1 миллиметра, 500 микролитров лизисного буфера и 200 микролитров 20% додецилсульфата натрия.Шарик взбивает трубку в течение четырех минут в гомогенизаторе, а затем три-пять минут вихря. Центрифугируйте трубки на короткое время, чтобы устранить пузырьки и пену. Чтобы извлечь ДНК из образцов микробиоты, перенесите 350 микролитров образца супернатанта в новую, 1,5 миллилитра защелкивающуюся колпачковую трубку, без какого-либо мусора.Добавьте 500 микролитров фенола:хлороформа:изоамилового спирта в соотношении 25:24:1 и вихрь в течение одной минуты. После центрифугирования переведите 180 микролитров верхней водной фазы в новую, 1,5-миллилитровую трубку с защелкивающейся крышкой. Добавьте 180 микролитров хлороформа, инвертируйте и перемешайте.Из этого переведите 180 микролитров водной фазы в новую трубку с защелкивающимся колпачком. В шкаф биобезопасности добавьте 180 микролитров холодного изопропанола и 36 микролитров пяти молярного ацетата аммония. Переверните его несколько раз, чтобы перемешать, и поместите трубку на лед на 20 минут.Откажитесь от супернатанта с последующим промывкой гранул несколько раз 500 микролитрами холодного 70%-го этанола. Выбросьте супернатант, и высушите на воздухе трубку вверх ногами на папиросной бумаге в течение 20 минут, пока гранула не станет прозрачной. Суспендировать гранулу в 50 микролитрах молекулярной воды и нагревать жидкость при 37 градусах Цельсия в течение 10 минут, чтобы полностью растворить крупные гранулы ДНК.После нагрева центрифугируйте эти трубки в 3, 400 раз G в течение одной минуты, чтобы извлечь капли конденсации из крышки. Измерьте концентрацию и получите соотношение 260/280 с помощью спектрофотометра. Соотношение для ДНК хорошего качества обычно составляет от 1,8 до двух.Центрифугируют подготовленные образцы в 600 раз G в течение одной минуты при комнатной температуре, перед замораживанием при минус 80 градусах Цельсия в течение 24 часов. Затем отправьте 20 микролитров образцов с концентрациями от одного до 50 нанограмм на микролитр в Аргоннскую национальную лабораторию для секвенирования. Штамм мыши, не имеющий рецептора CX3CR1, имеет другой состав кишечной микробиоты по сравнению с мышами MRL/lpr дикого типа, MRL/lpr-CX3CR1 GFP/GFP, показывает значительные различия в определенных родах, относящихся к потенциально патогенным бактериям, таким как протеобактерии типа.Будьте осторожны с загрязнением образца. Он должен быть стерильным. Также важна пипетка с точностью при переносе супернатанта в новую трубку.Этот метод подходит для молекулярного анализа, такого как ПЦР, переваривание ферментов рестрикции или построение геномной библиотеки. При волчанке мы доказали сильную связь между микробиотой кишечника и прогрессированием волчанки.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Comprehensive &amp; Cost Effective Laboratory Monitoring of HIV/AIDS: an African Role Model

Comprehensive & Cost Effective Laboratory Monitoring of HIV/AIDS: an African Role Model

Всеобъемлющее и экономически эффективных лабораторного мониторинга за ВИЧ / СПИД: африканские образцом для подражания

We present the video about assisting anti-retroviral therapy (ART) by an apt laboratory service - representing a South-African role model for economical ...

Cost-effective Method for Microbial Source Tracking Using Specific Human and Animal Viruses

Экономически эффективный метод для отслеживания источника микробного Использование Конкретные человека и животных вирусов

Microbial contamination of the environment represents a significant health risk. Classical bacterial fecal indicators have shown to have significant ...

A Method for Labeling Vasculature in Embryonic Mice

Метод маркировки сосудистую в эмбриональных мышей

The establishment of a functional blood vessel network is an essential part of organogenesis, and is required for optimal organ function. For example, in ...

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

Простой протокол Chelex для выделения ДНК из<em&gt; Anopheles</em&gt; SPP.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for  efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and  vector ...

Isolation and Genome Analysis of Single Virions using 'Single Virus Genomics'

Выделение и анализ генома Единого Вирионы использованием &quot;Единое геномики Вирус&quot;

Whole genome amplification and sequencing of single microbial cells enables genomic characterization without the need of cultivation 1-3. Viruses, which ...

An In Vitro Batch-culture Model to Estimate the Effects of Interventional Regimens on Human Fecal Microbiota

Модель In Vitro Batch-culture для оценки влияния интервенционных режимов на человеческую фекальную микробиоту

The emerging role of the gut microbiome in several human diseases demands a breakthrough of new tools, techniques and technologies. Such improvements are ...

Analysis of Interactions between Endobiotics and Human Gut Microbiota Using In Vitro Bath Fermentation Systems

Анализ взаимодействия между эндобиотики и человека кишки микробиоты использованием в пробирке ванны системы брожения

Human intestinal microorganisms have recently become an important target of research in promoting human health and preventing diseases. Consequently, ...

A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice

Анализ проточной цитометрии на основе ДНК/Ki67 для анализа клеточного цикла антиген-специфических CD8 Т-клеток у вакцинированных мышей

The cell cycle of antigen-specific T cells in vivo has been examined by using a few methods, all of which possess some limitations. Bromodeoxyuridine ...

Fecal (micro) RNA Isolation

Fecal micro RNA Isolation

Выделение фекальной (микро) РНК

It is becoming clear that RNA exists in the gut lumen and feces in animals and humans. The protocol described below isolates total RNA including microRNAs ...

Therapeutic Evaluation of Fecal Microbiota Transplantation in an Interleukin 10-Deficient Mouse Model

Терапевтическая оценка трансплантации фекальной микробиоты в мышиной модели с дефицитом интерлейкина 10

With the development of microecology in recent years, the relationship between intestinal bacteria and inflammatory bowel disease (IBD) has attracted ...