Name: analysis of fecal microbiota dynamics in lupus-prone mice using a simple, cost-effective dna isolation method
Uploaded: 2022-05-02T14:00:00
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Agradecemos la ayuda del Laboratorio Nacional de Argonne y nuestros bioinformáticos colaboradores. Este trabajo es apoyado por varios NIH y subvenciones internas.

El locus Cx3cr1 gfp/gfp de ratones B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J se cruzó con MRL/MpJ-Fas lpr/J (MRL/lpr) durante 10 generaciones para generar ratones MRL/lpr-CX 3 CR1 gfp/gfp. El cribado del genoma utilizando paneles de polimorfismo de nucleótido único (SNP) confirmó que el fondo genético de los ratones recién generados era más del 97% idéntico al de MRL / lpr. Después de eso, los ratones fueron criados y mantenidos en un ambiente específi...

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	<li>Lee, Y. K., Mazmanian, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Has+the+microbiota+played+a+critical+role+in+the+evolution+of+the+adaptive+immune+system.">Has the microbiota played a critical role in the evolution of the adaptive immune system.</a> Science. 330 (6012), 1768-1773 (2010).</li><li>Lee, Y. K., Menezes, J. S., Umesaki, Y., Mazmanian, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proinflammatory+T-cell+responses+to+gut+microbiota+promote+experimental+autoimmune+encephalomyelitis.">Proinflammatory T-cell responses to gut microbiota promote experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 4615-4622 (2011).</li><li>Yeoh, N., Burton, J. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLE:+another+autoimmune+disorder+influenced+by+microbes+and+diet.">SLE: another autoimmune disorder influenced by microbes and diet.</a> Frontiers of Immunology. 6, 608 (2015).</li><li>Tektonidou, M. G., Wang, Z., Dasgupta, A., Ward, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burden+of+serious+infections+in+adults+with+systemic+lupus+erythematosus:+a+national+population-based+study.">Burden of serious infections in adults with systemic lupus erythematosus: a national population-based study.</a> Arthritis Care &amp; Research. 67 (8), 1078-1085 (2015).</li><li>Mu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+lupus+nephritis+by+changes+of+gut+microbiota.">Control of lupus nephritis by changes of gut microbiota.</a> Microbiome. 5 (1), 73 (2017).</li><li>Panek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodology+challenges+in+studying+human+gut+microbiota+-+effects+of+collection,+storage,+DNA+extraction+and+next+generation+sequencing+technologies.">Methodology challenges in studying human gut microbiota - effects of collection, storage, DNA extraction and next generation sequencing technologies.</a> Scientific Reports. 8 (1), 5143 (2018).</li><li>Fiedorov&#225;, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+dna+extraction+methods+on+stool+bacterial+and+fungal+microbiota+community+recovery.">The impact of dna extraction methods on stool bacterial and fungal microbiota community recovery.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 821 (2019).</li><li>Gerasimidis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+DNA+extraction+methodology+on+gut+microbiota+research+applications.">The effect of DNA extraction methodology on gut microbiota research applications.</a> BMC Research Notes. 9, 365 (2016).</li><li>Bukin, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+16S+rRNA+region+choice+on+bacterial+community+metabarcoding+results.">The effect of 16S rRNA region choice on bacterial community metabarcoding results.</a> Scientific Data. 6 (1), 190007 (2019).</li><li>Galloway-Pe&#241;a, J., Hanson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+analysis+of+the+microbiome.">Tools for analysis of the microbiome.</a> Digestive Diseases and Sciences. 65 (3), 674-685 (2020).</li><li>Sharpton, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+the+analysis+of+shotgun+metagenomic+data.">An introduction to the analysis of shotgun metagenomic data.</a> Frontiers in Plant Science. 5, 209 (2014).</li></ol>

Una microbiota intestinal equilibrada puede proteger al cuerpo humano de las enfermedades. Una vez que este equilibrio se ve interrumpido por desencadenantes externos o internos, las consecuencias pueden ser devastadoras. Este método presenta una forma de analizar la dinámica de la microbiota intestinal en modelos murinos. El método es adecuado no solo para comparaciones entre grupos, sino también para rastrear la microbiota intestinal a lo largo del tiempo para identificar mejor los factores dependientes del tiempo ...

Los seres humanos y las bacterias han coexistido durante mucho tiempo. Han establecido una relación codependiente con efectos beneficiosos mutuos que influye en las respuestas inmunes del huésped de manera cuantitativa y cualitativa1. Estudios recientes sugieren una asociación entre la composición de la microbiota intestinal y la patogénesis de enfermedades autoinmunes que incluyen la esclerosis múltiple 2, la artritis reumatoide3, la diabetes tipo2 4, la enfermedad inflamatoria intestinal5 y el lupus eritematoso sistémico (LES)6. Sin embargo, aún no está claro si la microbiota intestinal es la causa principal o un efecto secundario de estas enfermedades autoinmunes7. Potencialmente, la microbiota intestinal podría exacerbar la enfermedad durante la fase efectora de los trastornos autoinmunes o desempeñar un papel en la regulación de la inducción de estas enfermedades8.
Se ha descrito disbiosis intestinal en ratones hembra propensos al lupus MRL/Mp-Faslpr (LMR/lpr), y se observaron cambios en la microbiota intestinal con un agotamiento significativo de los lactobacilos9. Cuando se administró por vía oral una mezcla de cinco cepas de Lactobacillus, los síntomas similares al lupus se atenuaron en gran medida en estos ratones, lo que sugiere un papel esencial de la microbiota en la regulación de la patogénesis del LES.
La siguiente técnica de extracción de ADN permite seguir las fluctuaciones de la microbiota y analizarlas cualitativa y cuantitativamente durante el curso de la enfermedad murina similar al LES en ratones propensos al lupus. Ya sea para examinar la microbiota intestinal sana o definir la disbiosis, es importante examinar críticamente cómo se recopilan los datos y si son precisos y reproducibles10. Cada paso es crítico en este proceso. Se debe utilizar una metodología adecuada para extraer ADN microbiano, ya que cualquier posible problema que introduzca sesgos durante el proceso de extracción de ADN podría resultar en una representación microbiana inexacta. Si bien el método fenol-cloroformo se describe aquí, existen kits disponibles comercialmente para extraer ADN de bacterias que funcionan bien en casos particulares11. Sin embargo, su usabilidad está limitada por el costo y la cantidad de muestra requerida.
El protocolo presentado aquí es rentable y requiere solo una pequeña cantidad de muestra. Funciona bien con cualquier tipo de muestra de heces y es útil para estudiar la dinámica de la microbiota intestinal a lo largo del tiempo, así como las comparaciones entre grupos. El ADN se aísla con un método de purificación de alcohol, que utiliza fenol, cloroformo y alcohol isoamílico. La extracción a base de alcohol ayuda a limpiar y eliminar la muestra de proteínas y lípidos, donde el ADN se precipita en el paso final. El método propuesto tiene una eficiencia y calidad significativamente altas y ha demostrado ser preciso en la identificación de poblaciones bacterianas. Una nota crítica durante el procedimiento es que la contaminación del ADN puede ocurrir, y por lo tanto se requiere un manejo adecuado de la muestra12.
Luego, el ADN es analizado por las plataformas de secuenciación de próxima generación para el gen 16S rRNA, como el Illumina MiSeq. En particular, la región hipervariable V4 se analiza para proporcionar una mejor cuantificación de los taxones de alto rango13. El análisis bioinformático posterior se subcontrata, seguido de un análisis interno utilizando métodos estadísticos estándar. Existen numerosos programas de software bioinformático de código abierto disponibles para la secuenciación posterior, y el tipo de análisis realizados depende en gran medida de la cuestión biológica específica de interés14. Este protocolo se centra específicamente en los pasos experimentales previos a la secuenciación y proporciona un método más versátil, rentable, comparable y eficiente para obtener ADN de muestras fecales.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1 mm glass beads</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>11079101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL screw cap tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>3488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% SDS</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>BP1311-1</td>
			<td>SDS 20%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96% Ethanol, Molecular Biology Grade</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T032021000CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Acetate (5 M)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9071</td>
			<td>NH4AC 5M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>005582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bullet Blender storm 24</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>4116-BBY24M</td>
			<td>Homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>C298-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC-Treated Water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine Tetraacetic Acid</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>BP118-500</td>
			<td>EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foil plate seal</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>NC0302491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes-Kimtech 34256</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>06-666C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRL/MpJ-Faslpr/J (MRL/lpr) mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>000485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 2000 spectrophotomer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND2000CLAPTOP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol: chloroform: isoamylalchohol (25:24:1)</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>BP1752I-400</td>
			<td>PCI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale with 4 decimals</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>MS205DU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skirted 96-well plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AB-0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>15528154</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Hydrochloride</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>BP1757-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of fecal microbiota dynamics in lupus-prone mice using a simple, cost-effective dna isolation method

La microbiota intestinal tiene un papel importante en la educación del sistema inmunológico. Esta relación es extremadamente importante para comprender las enfermedades autoinmunes que no solo son impulsadas por factores genéticos, sino también por factores ambientales que pueden desencadenar la aparición y / o empeorar el curso de la enfermedad. Un estudio publicado anteriormente sobre la dinámica de la microbiota intestinal en ratones hembra LMR/lpr propensos al lupus mostró cómo los cambios en la microbiota intestinal pueden alterar la progresión de la enfermedad. Aquí, se describe un protocolo para extraer muestras representativas de la microbiota intestinal para estudios de autoinmunidad. Las muestras de microbiota se recogen del ano y se procesan, de las cuales se extrae el ADN utilizando un método de fenol-cloroformo y se purifica mediante precipitación de alcohol. Después de realizar la PCR, los amplicones purificados se secuencian utilizando una plataforma de secuenciación de próxima generación en el Laboratorio Nacional de Argonne. Finalmente, se analizan los datos de secuenciación del gen de ARN ribosómico 16S. Como ejemplo, se muestran los datos obtenidos de las comparaciones de la microbiota intestinal de ratones LMR/lpr con o sin CX3CR1. Los resultados mostraron diferencias significativas en géneros que contienen bacterias patógenas, como las del filo Proteobacteria, así como el género Bifidobacterium, que se considera parte de la microbiota comensal sana. En resumen, este método de aislamiento de ADN simple y rentable es confiable y puede ayudar a la investigación de los cambios en la microbiota intestinal asociados con enfermedades autoinmunes.

Los resultados del Laboratorio Nacional de Argonne son analizados por un bioinformático calificado, seguido de un análisis interno de los datos utilizando métodos estadísticos estándar. Los análisis típicos del microbioma implican la agrupación de secuencias similares en unidades taxonómicas operativas (OTU) o variantes de secuencia de amplicón (ASV) como un proxy para diferentes microorganismos en una muestra. Los recuentos de OTU o ASV en todas las muestras se pueden usar para verificar los cambios en la dive...

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Analysis of Fecal Microbiota Dynamics in Lupus-Prone Mice Using a Simple, Cost-Effective DNA Isolation Method

Este protocolo proporciona un método de aislamiento de ADN simple y rentable para el análisis de alteraciones de la microbiota intestinal murina durante el desarrollo de enfermedades autoinmunes.

Análisis de la dinámica de la microbiota fecal en ratones propensos al lupus utilizando un método de aislamiento de ADN simple y rentable

Gut microbiota has an important role in educating the immune system. This relationship is extremely important for understanding autoimmune diseases that ...

El método de aislamiento de ADN propuesto puede servir para estudiar la dinámica de la microbiota intestinal en modelos de ratón con enfermedades autoinmunes. Se propone un método más versátil, rentable y eficiente para obtener ADN de muestras fecales que son comparables a los kits disponibles comercialmente. Para comenzar, saque cada ratón individualmente de su jaula, recoja un pellet fecal directamente del ano y guárdelo a menos 80 grados centígrados hasta que se procese.Procese las muestras con pinzas, tubos y guantes estériles y limpios. Agregue un pellet congelado a un tubo de tapón de rosca de dos mililitros previamente pesado y registre el peso fecal en gramos, que debe estar entre 0.02 y 0.05 gramos por pellet fecal. Agregue al pellet una capa delgada de perlas de vidrio de 0.1 milímetros, 500 microlitros de tampón de lisis y 200 microlitros de dodecil sulfato de sodio al 20%.Bead batió el tubo durante cuatro minutos en un homogeneizador, seguido de tres a cinco minutos de vórtice. Centrifugar los tubos durante un corto tiempo para eliminar las burbujas y la espuma. Para extraer ADN de las muestras de microbiota, transfiera 350 microlitros de sobrenadante de muestra a un nuevo tubo de tapa a presión de 1,5 mililitros, sin residuos.Agregue 500 microlitros de fenol: cloroformo: alcohol isoamílico, en una proporción de 25: 24: 1, y vórtice durante un minuto. Después de la centrifugación, transfiera 180 microlitros de la fase acuosa superior a un nuevo tubo de tapa a presión de 1,5 mililitros. Añadir 180 microlitros de cloroformo, invertir y mezclar.A partir de esto, transfiera 180 microlitros de la fase acuosa a un nuevo tubo de tapa a presión. En un gabinete de bioseguridad, agregue 180 microlitros de isopropanol frío y 36 microlitros de acetato de amonio molar. Invierta varias veces para mezclar y coloque el tubo en hielo durante 20 minutos.Deseche el sobrenadante, seguido de lavar los pellets varias veces con 500 microlitros de etanol frío al 70%. Deseche el sobrenadante y seque al aire el tubo boca abajo sobre papel de seda durante 20 minutos, hasta que el pellet se aclare. Suspenda el pellet en 50 microlitros de agua de grado molecular y caliente el líquido a 37 grados centígrados durante 10 minutos para disolver completamente los gránulos de ADN grandes.Después de calentar, centrifugar estos tubos a 3, 400 veces G durante un minuto para recuperar las gotas de condensación de la tapa. Mida la concentración y obtenga la relación 260/280 utilizando un espectrofotómetro. Una proporción para el ADN de buena calidad es generalmente entre 1,8 y dos.Centrifugar las muestras preparadas a 600 veces G durante un minuto a temperatura ambiente, antes de congelar a menos 80 grados centígrados durante 24 horas. Luego, envíe 20 microlitros de muestras con concentraciones que van de uno a 50 nanogramos por microlitro al Laboratorio Nacional de Argonne para su secuenciación. La cepa de ratón que carece del receptor CX3CR1 tiene una composición de microbiota intestinal diferente en comparación con los ratones LMR/lpr de tipo salvaje, ratones MRL/lpr-CX3CR1 GFP/GFP, muestra diferencias significativas en ciertos géneros, relevantes para bacterias potencialmente patógenas como las del filo Proteobacteria.Tenga cuidado con la contaminación de la muestra. Tiene que ser estéril. Además, es importante pipetear con precisión al transferir el sobrenadante en un tubo nuevo.Este método es adecuado para análisis moleculares como PCR, digestión de enzimas de restricción o construcción de bibliotecas genómicas. En el lupus, probamos una fuerte relación entre la microbiota intestinal y la progresión del lupus.

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