Name: formulating and characterizing an exosome-based dopamine carrier system
Uploaded: 2022-04-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Formulating and Characterizing an Exosome-based Dopamine Carrier System at JoVE.com

这项工作主要由耶尔德兹技术大学科学研究项目 （TSA-2021-4713） 提供的研究资金支持。

注意：有关本协议中使用的所有材料和设备的详细信息，请参阅 材料表 。
1. 沃顿果冻间充质干细胞的培养和冷冻保存
<ol><li>从-80°C冰箱中取出WJ-MSC（来自ATCC）。将细胞接种到含有补充有 10% 胎牛血清 （FBS） 的 DMEM-F12 培养基的烧瓶中。将它们在37°C下在含有5%CO2的培养箱中孵育。</li>
	<li>每 2 天更换一次培养基。当细胞达到 80% 汇合度时传?...

外泌体是大多数细胞类型分泌的尺寸为 40-200 nm 的小膜囊泡，例如 MSCs1。外泌体能够实现细胞之间的通讯，可以以不同的方式进入细胞，例如内吞作用、吞噬作用、微胞饮作用、脂质介导的内化和融合33,44。与其他纳米载体系统相比，在外泌体表面发现的脂质和胆固醇赋予了携带亲水性和疏水性分子的能力，胆固醇末端的氢键允许紧密?...

外泌体是具有显着特征的生物活性囊泡，大小范围为 40 nm 至 200 nm。外泌体起源于细胞膜，是由于内体1 的释放而形成的。这些结构充当细胞间的通讯器，并与相邻细胞相互作用，以促进活性分子的转移。外泌体可以从许多不同的来源分离出来。这些包括体液，如血浆、尿液、脑脊液、唾液，以及在 体外 条件下培养的细胞系。外泌体在消除神经损伤方面发挥着重要作用，这要归功于它们所含的生物大分子，如脂质、蛋白质和核酸2。胶质是神经系统3 的支持细胞， 通过 外泌体4 将蛋白质和微 RNA 转移到神经元的轴突。
形成髓鞘的脂质是神经传导的特征，也通过外泌体从少突胶质细胞中释放出来 4,5。外泌体还参与突触可塑性、神经元应激反应、细胞间通讯和大脑神经发生等过程 6,7。外泌体具有纳米尺寸的事实使它们能够通过BBB。穿透该膜后，从间质液到脑脊液有一条特殊的过渡途径8。由于其表面特性，外泌体可以作为药物递送系统与靶细胞有效相互作用，并主动递送负载的药物。
由于各种粘附蛋白（四跨膜蛋白和整合素）在外泌体表面的表达，这些细胞外囊泡可以很容易地与宿主细胞膜相互作用和融合9。人们认为外泌体可以用作药物递送系统，特别是在治疗中枢神经系统疾病时，因为它们能够穿透BBB及其表面特性。与同种异体细胞疗法相比，间充质干细胞 （MSC） 衍生的外泌体具有较低的免疫排斥风险，在这方面，它们可以成为无细胞治疗应用的重要组成部分10.
多巴胺是一种分子，其大脑中的缺乏是帕金森病（PD）的特征，每天都在恶化11,12,13。众所周知，PD与中脑黑质中多巴胺能神经元的变性和运动神经元功能的丧失有关14,15。多巴胺能神经元的死亡阻止了神经递质多巴胺向脑纹状体的供应。这反过来又导致PD特异性症状的出现16。帕金森病的这些症状是运动迟缓、姿势不稳、僵硬，尤其是静止性震颤12,13。尽管帕金森病在两个多世纪前首次被描述，但了解该疾病的病理学和病因学的研究仍在进行中，目前人们认为帕金森病是一种复杂的全身性疾病17。据预测，当超过80%的神经元退化时，会发生多巴胺缺乏症，并观察到临床PD症状18。在疾病的治疗中，优选不完全的多巴胺补充以减轻运动症状。体内研究表明，将多巴胺直接注入大脑可显着减轻动物的症状19.多巴胺前体如L-DOPA（L-3,4-二羟基苯丙氨酸）和多巴胺受体药物在临床上使用，因为人类不可能将多巴胺直接输注到大脑中，并且进入系统的多巴胺不能穿过BBB20。这些类型的药物会随着时间的推移而失去效力。然而，目前尚无针对帕金森病的根治性治疗方法，因此，开发新的治疗策略和治疗方式以揭示疾病的病理生理学并减少帕金森病对患者的影响是非常必要的。
最近，基于外泌体的研究因收集有关神经系统疾病的治疗方法和病理学的信息而引起了人们的关注。MSC 衍生的外泌体已被证明可以减少神经损伤中的炎症并有助于神经元再生21,22,23。此外，据报道，MSC 衍生的外泌体分泌组通过显示神经营养和神经保护作用来减少细胞凋亡，尤其是对多巴胺能神经元24,25。近年来，对将外泌体用作治疗性药物递送系统的平台的研究急剧加快。在许多研究中，已经观察到相关药物可以很容易地封装到外泌体中并安全地递送至靶细胞、组织和器官中 26,27。孵育、冻融循环、超声处理和挤压等不同方法可用于将药物加载到外泌体中28。
与外泌体或外泌体样囊泡共孵育可使亲脂性小分子被动封装到这些递送系统中28,29,30。特别是姜黄素31、过氧化氢酶30、多柔比星32和紫杉醇33等多种分子被有效地装载到外泌体中。据观察，具有抗氧化活性的含过氧化氢酶的外泌体在大脑的神经元和小胶质细胞中有效积累，并表现出很强的神经保护活性30。在同一项研究中，发现添加到复合物中以增加负载效率的皂苷在孵育期间增加了载药百分比30,34。然而，需要进一步的研究来建立外泌体的药物负荷标准。
本文描述了通过将多巴胺封装到从 WJ-MSC 中分离的外泌体中来开发纳米载体系统。详细解释了所有步骤，包括WJ-MSCs的培养、外泌体的分离和表征、载药实验、用各种技术表征多巴胺负载的外泌体以及 体外 细胞毒性分析。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m membrane filter</td>
			<td>Aisimo</td>
			<td></td>
			<td>Used for the sterilization process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Aisimo</td>
			<td></td>
			<td>Used for the sterilization process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon tube</td>
			<td>Nest</td>
			<td></td>
			<td>Used in cell culture step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks</td>
			<td>Nest</td>
			<td></td>
			<td>Used in cell culture step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tube</td>
			<td>Nest</td>
			<td></td>
			<td>Used in cell culture step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks</td>
			<td>Nest</td>
			<td></td>
			<td>Used in cell culture step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plates (Falcon, TPP microplates)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td></td>
			<td>Used in cell culture step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>271004-1L</td>
			<td>Used for HPLC analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>NUVE-OT 90L</td>
			<td></td>
			<td>Used for the sterilization process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Cabin</td>
			<td>Hera Safe KS</td>
			<td></td>
			<td>Used for the cell culture process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>CF16RN</td>
			<td>Used in the exosome isolation step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator with Safe Cell UV</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td></td>
			<td>Used for the cell culture process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dopamine hydrochloride H8502-10G</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8502-10G</td>
			<td>Used in exosome dopamine loading</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium/Nutrient Mixture-F12</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>RNBJ7249</td>
			<td>Used as cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum-FBS</td>
			<td>Capricorn</td>
			<td>FBS-16A</td>
			<td>It was used by adding to the cell culture medium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer -80 &#176;C</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MDF-U5386S-PE</td>
			<td>To store cells and the resulting exosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fridge</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MPR-215-PE</td>
			<td>Used to store cell culture and other materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High performance liquid chromatography-HPLC</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>The presence of dopamine from the content of the obtained formulation was investigated.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope- Primovert</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Used to observe cells in cell culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTT Assay</td>
			<td>Biomatik</td>
			<td></td>
			<td>Used to measure cell viability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight NS300</td>
			<td>Malvern panalytical</td>
			<td>Malvern panalytical</td>
			<td>Used for exosome characterization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XPN-100 Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Used in the exosome isolation step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS tablet</td>
			<td>Biomatik</td>
			<td>43602</td>
			<td>In the preparation of the PBS solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin/Streptomycin Solution</td>
			<td>Capricorn</td>
			<td>PB-S</td>
			<td>It was added to the medium to prevent contamination in cell culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Aid</td>
			<td>Isolab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision balance-Kern</td>
			<td>Kern-ABJ220-4NM</td>
			<td></td>
			<td>Used in the preparation of solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q500 Sonicator</td>
			<td>Qsonica, LLC</td>
			<td></td>
			<td>Used to digest exosomes in HPLC analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>47036-50G-F</td>
			<td>It was used by adding it to the total solution in the exosome dopamine loading process.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrostar-Nano-Spectrophotometry</td>
			<td>BMG LABTECH</td>
			<td></td>
			<td>Used for MTT and drug release analyzes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPSS 22</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>statistical package program</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vorteks-FinePCR</td>
			<td>FinePCR-FineVortex</td>
			<td></td>
			<td>Used to mix solutions homogeneously</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath 37 &#176;C-Senova</td>
			<td>Senova</td>
			<td></td>
			<td>Used in cell culture step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wharton&#8217;s jelly mesenchymal stem cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZetaSizer</td>
			<td>Malvern Nano ZS</td>
			<td>Malvern Nano ZS</td>
			<td>Used for exosome characterization</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

formulating and characterizing an exosome-based dopamine carrier system

大小在 40 到 200 nm 之间的外泌体构成了细胞外囊泡的最小亚群。这些由细胞分泌的生物活性囊泡在细胞间货物和通讯中起着积极作用。外泌体主要存在于体液中，如血浆、脑脊液、尿液、唾液、羊水、初乳、母乳、关节液、精液和胸膜酸。考虑到外泌体的大小，人们认为它们可能在中枢神经系统疾病中发挥重要作用，因为它们可以穿过血脑屏障 （BBB）。因此，本研究旨在通过将多巴胺封装到从沃顿果冻间充质干细胞（WJ-MSCs）中分离的外泌体中来开发一种基于外泌体的纳米载体系统。通过表征过程的外泌体与多巴胺一起孵育。负载多巴胺的外泌体在孵育结束时重新表征。在药物释放和细胞毒性测定中研究了多巴胺负载的外泌体。结果表明，多巴胺可以成功地包封在外泌体内，并且负载多巴胺的外泌体不影响成纤维细胞的活力。

外泌体分离和表征 当培养物达到足够的密度时，将沃顿果冻干细胞培养并在无血清培养基中孵育48小时。孵育结束后，将上清液储存在-20°C。 将收集的上清液用PBS稀释并进行超速离心（图1）。通过NTA和DLS分析分析得到的溶液。外泌体通过0.22μm过滤器进行灭菌。获得的外泌体的平均大小被确定为 98 nm（视频 1）。离心结束时获得约100?...

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Formulating and Characterizing an Exosome-based Dopamine Carrier System

在这里，我们旨在通过从沃顿果冻间充质干细胞中分离的干细胞外泌体的多巴胺负载来获得一种制剂。外泌体分离和表征，药物加载到所得外泌体中，以及所开发制剂的细胞毒性活性在本方案中描述。

基于外泌体的多巴胺载体系统的配方和表征

Exosomes between 40 and 200 nm in size constitute the smallest subgroup of extracellular vesicles. These bioactive vesicles secreted by cells play an ...

外泌体可能对大小在 14 到 200 纳米之间的细胞分泌的囊泡产生反应，并从细胞内货物和通讯中分裂出来，这是细胞外囊泡的最小亚群。由于内体分化而形成的外泌体起源于细胞膜。干细胞可以从不同的来源（如骨髓或脂肪组织）中分离出来。但成体组织干燥干细胞具有更高的免疫原性潜力，外泌体的大小，据说它在中枢神经系统疾病中发挥着重要作用，因为它可以穿过血脑屏障。首先，用五毫升PBS洗涤接种的沃顿氏果冻间充质干细胞。然后加入 5 毫升胰蛋白酶 EDTA 溶液，然后将烧瓶放入培养箱中。孵育后，收集细胞并以 1， 500 G 离心 5 分钟。然后除去上清液，向试管中加入一毫升含有10%FBS的DMEM-F12。用PBS洗涤培养的细胞。洗涤后，向细胞中加入无血清的DMEM-F12培养基，并将其置于培养箱中。要分离外泌体，收集无血清培养基，并在 4 摄氏度下以 300 G 离心 10 分钟。将上清液转移到另一个试管中，并通过以更高的速度连续离心进行处理。最终离心后，缓慢除去上清液，将沉淀溶解在一毫升PBS中。涡旋混合，在4摄氏度下以110， 000 G进行超速离心70分钟。将3毫升PBS加入先前通过超速离心收集的外泌体悬浮液中，并使用0.22微米过滤器过滤对稀释的悬浮液进行灭菌。然后将 500 微升灭菌的外泌体悬浮液转移到另一个管中。接下来，依次将 500 微升每毫升 0.5 毫克的多巴胺溶液和皂苷加入灭菌的悬浮液中。孵育后超速离心悬浮液。该样品可用于 NTA 和 DLS 分析以表征多巴胺负载的外泌体，或储存在零下 20 摄氏度直至进一步使用。在NTA分析中，沃顿果冻衍生的外泌体的平均大小被确定为98纳米，多巴胺负载的外泌体为110纳米。NTA和DLS分析揭示的纳米颗粒数量彼此一致。沃顿果冻衍生外泌体的 zeta 电位测量为负 15.7，多巴胺负载外泌体为负 17.6 毫伏。负载多巴胺外泌体的HPLC分析在6.45 min处检测到多巴胺的峰值。累积药物释放曲线显示，74.8%的包封多巴胺在前8小时内从外泌体释放。研究了多巴胺负载和游离外泌体对成纤维细胞的细胞毒性。尽管负载多巴胺的外泌体没有表现出任何细胞毒性作用，但皂苷降低了成纤维细胞的活力。MTT 测定显示，当用负载多巴胺的外泌体处理成纤维细胞时，细胞活力增加。通过单因素方差分析评估结果的统计学意义。此外，还研究了不同浓度的游离外泌体对成纤维细胞的细胞毒性作用。成纤维细胞活力更高，游离外泌体浓度为每毫升 25 微升。对于中枢神经系统来说，患者的大小、在可塑性、神经反应、左右交流和大脑神经发生等过程中的作用非常重要。此外，由于外泌体的表面，它说，已经观察到它们可以与靶细胞药物相互作用，并且在药物递送过程中的活性是完成的。在这项研究中，我们首次通过将多巴胺封装到干细胞衍生的外泌体中来开发一种新的药物制剂。他提出，这种制剂在治疗帕金森病方面将非常有希望。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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科研

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