Name: formulating and characterizing an exosome-based dopamine carrier system
Uploaded: 2022-04-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Formulating and Characterizing an Exosome-based Dopamine Carrier System at JoVE.com

Arbejdet blev primært støttet af forskningsmidler fra Yıldız Technical University Scientific Research Projects (TSA-2021-4713).

BEMÆRK: Se materialetabellen for detaljer vedrørende alle materialer og udstyr, der anvendes i denne protokol.
1. Dyrkning og kryopræservering af Whartons gelé mesenkymale stamceller
<ol><li>Fjern WJ-MSC'erne (fra ATCC) fra -80 °C-fryseren. Frø cellerne i en kolbe indeholdende DMEM-F12-medium suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS). De inkuberes ved 37 °C i en inkubator indeholdende 5% CO2.</li>
	<li>Skift kulturmediet hver 2. dag. Pas...

Exosomer er små membranvesikler med dimensioner på 40-200 nm udskilt af de fleste celletyper, fx MSC'er1. I stand til at muliggøre kommunikation mellem celler kan eksosomer komme ind i celler på forskellige måder, såsom endocytose, fagocytose, mikropinocytose, lipidmedieret internalisering og fusion33,44. Sammenlignet med andre nanocarrier-systemer giver lipiderne og kolesterolet, der findes på exosomoverfladen, evnen til at bære b...

Exosomer, bioaktive vesikler med væsentlige træk, varierer i størrelse fra 40 nm til 200 nm. Exosomer stammer fra cellemembranen og dannes på grund af frigivelsen af endosomerne1. Disse strukturer tjener som celle-til-celle-kommunikatorer og interagerer med naboceller for at lette overførslen af aktive molekyler. Exosomer kan isoleres fra mange forskellige kilder. Disse omfatter kropsvæsker såsom plasma, urin, cerebrospinalvæske, spyt samt cellelinjer dyrket under in vitro-betingelser . Exosomer har en vigtig rolle i eliminering af nerveskader takket være de biomakromolekyler, de indeholder, såsom lipider, proteiner og nukleinsyrer2. Glia, som er de understøttende celler i nervesystemet3, overfører proteiner og mikro-RNA'er til neuronernes axoner via exosomer4.
Lipider, der danner myelinskeden, som er et karakteristisk træk ved nerveledning, frigives også fra oligodendrocytter via exosomer 4,5. Exosomer er også involveret i processer som synaptisk plasticitet, neuronal stressrespons, celle-celle-kommunikation og neurogenese i hjernen 6,7. Det faktum, at exosomer besidder nanodimensioner, gør det muligt for dem at passere gennem BBB. Der er en særlig overgangsrute fra den interstitielle væske til cerebrospinalvæsken efter at have trængt ind i denne membran8. Takket være deres overfladeegenskaber kan exosomer interagere effektivt med målceller som et lægemiddelafgivelsessystem og aktivt levere de indlæste lægemidler.
På grund af ekspressionen af forskellige klæbende proteiner (tetraspaniner og integriner) på overfladen af exosomer kan disse ekstracellulære vesikler let interagere og smelte sammen med værtscellemembraner9. Det menes, at exosomer kan bruges som et lægemiddelafgivelsessystem, især til behandling af sygdomme i centralnervesystemet på grund af deres evne til at trænge ind i BBB og deres overfladeegenskaber. Mesenkymale stamcelle (MSC)-afledte exosomer har en lavere risiko for immunafstødning sammenlignet med allogene cellulære terapier, og i denne henseende kan de være en vigtig komponent i cellefrie behandlingsapplikationer10.
Dopamin er et molekyle, hvis mangel i hjernen er det karakteristiske træk ved Parkinsons sygdom (PD), forværres dag for dag11,12,13. Det er kendt, at PD er forbundet med degeneration af dopaminerge neuroner i mesencephalons substantia nigra og tab af motorneuronfunktioner14,15. Døden af dopaminerge neuroner forhindrer levering af neurotransmitteren dopamin til hjernens striatum. Dette resulterer igen i fremkomsten af PD-specifikke symptomer16. Disse symptomer på PD er bradykinesi, postural ustabilitet, stivhed og især hvilende tremor12,13. Selvom PD først blev beskrevet for mere end to århundreder siden, er undersøgelser for at forstå sygdommens patologi og ætiologi stadig i gang, og det accepteres i øjeblikket, at PD er en kompleks systemisk sygdom17. Det forudsiges, at dopaminmangel opstår, og kliniske PD-symptomer observeres, når mere end 80% af neuronerne degenererer18. Ved behandling af sygdommen foretrækkes ufuldstændig dopamintilskud for at reducere motoriske symptomer. In vivo-undersøgelser har vist, at direkte infusion af dopamin i hjernen signifikant reducerer symptomer hos dyr19. Dopaminprækursorer såsom L-DOPA (L-3,4-dihydroxyphenylalanin) og dopaminreceptorlægemidler anvendes i klinikken, fordi direkte infusion af dopamin i hjernen ikke er mulig hos mennesker, og dopamin, der kommer ind i systemet, kan ikke krydse BBB20. Disse typer af stoffer mister deres effektivitet over tid. Der er dog stadig ingen helbredende behandlingsmetode for PD. Derfor er der et stort behov for at udvikle nye terapeutiske strategier og behandlingsmetoder for at afsløre sygdommens patofysiologi og reducere virkningen af PD på patienter.
Eksosombaserede undersøgelser har for nylig tiltrukket opmærksomhed for at indsamle information om både terapeutiske tilgange og patologier af sygdomme i nervesystemet. MSC-afledte exosomer har vist sig at reducere inflammation i nerveskader og bidrage til neuronal regenerering21,22,23. Derudover er det blevet rapporteret, at MSC-afledte exosomsekretomer reducerer apoptose ved at vise neurotrofiske og neuroprotektive virkninger, især på dopaminerge neuroner24,25. Forskning på platforme, hvor exosomer anvendes som terapeutiske lægemiddelleveringssystemer, er intensivt accelereret i de senere år. I talrige undersøgelser er det blevet observeret, at relevante lægemidler let kan indkapsles i exosomer og leveres sikkert i målceller, væv og organer26,27. Forskellige metoder såsom inkubation, fryse / optøningscyklusser, sonikering og ekstrudering kan anvendes til lægemiddelbelastning i exosomer28.
Coincubation med exosomer eller exosomlignende vesikler gør det muligt passivt at indkapsle lipofile små molekyler i disse leveringssystemer28,29,30. Især blev forskellige molekyler såsom curcumin 31, katalase 30, doxorubicin32 og paclitaxel33 effektivt indlæst i exosomer. Det er blevet observeret, at katalaseholdige eksosomer, som har antioxidantaktivitet, effektivt akkumuleret i neuronerne og mikrogliacellerne i hjernen og udviste stærke neuroprotektive aktiviteter30. I samme undersøgelse viste saponin, tilsat til komplekset for at øge belastningseffektiviteten, at øge lægemiddelbelastningsprocenten under inkubation30,34. Der er imidlertid behov for yderligere undersøgelser for at etablere standarderne for lægemiddelbelastning i exosomer.
Dette papir beskriver udviklingen af et nanobærersystem ved indkapsling af dopamin i exosomer, der blev isoleret fra WJ-MSC'er. Alle trin, herunder dyrkning af WJ-MSC'er, isolering og karakterisering af exosomer, lægemiddelbelastningsforsøg, karakterisering af dopaminbelastede eksosomer med forskellige teknikker og in vitro cytotoksicitetsanalyse forklares detaljeret.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m membrane filter</td>
			<td>Aisimo</td>
			<td></td>
			<td>Used for the sterilization process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Aisimo</td>
			<td></td>
			<td>Used for the sterilization process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon tube</td>
			<td>Nest</td>
			<td></td>
			<td>Used in cell culture step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks</td>
			<td>Nest</td>
			<td></td>
			<td>Used in cell culture step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tube</td>
			<td>Nest</td>
			<td></td>
			<td>Used in cell culture step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks</td>
			<td>Nest</td>
			<td></td>
			<td>Used in cell culture step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plates (Falcon, TPP microplates)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td></td>
			<td>Used in cell culture step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>271004-1L</td>
			<td>Used for HPLC analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>NUVE-OT 90L</td>
			<td></td>
			<td>Used for the sterilization process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Cabin</td>
			<td>Hera Safe KS</td>
			<td></td>
			<td>Used for the cell culture process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>CF16RN</td>
			<td>Used in the exosome isolation step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator with Safe Cell UV</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td></td>
			<td>Used for the cell culture process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dopamine hydrochloride H8502-10G</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8502-10G</td>
			<td>Used in exosome dopamine loading</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium/Nutrient Mixture-F12</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>RNBJ7249</td>
			<td>Used as cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum-FBS</td>
			<td>Capricorn</td>
			<td>FBS-16A</td>
			<td>It was used by adding to the cell culture medium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer -80 &#176;C</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MDF-U5386S-PE</td>
			<td>To store cells and the resulting exosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fridge</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MPR-215-PE</td>
			<td>Used to store cell culture and other materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High performance liquid chromatography-HPLC</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>The presence of dopamine from the content of the obtained formulation was investigated.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope- Primovert</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Used to observe cells in cell culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTT Assay</td>
			<td>Biomatik</td>
			<td></td>
			<td>Used to measure cell viability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight NS300</td>
			<td>Malvern panalytical</td>
			<td>Malvern panalytical</td>
			<td>Used for exosome characterization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XPN-100 Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Used in the exosome isolation step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS tablet</td>
			<td>Biomatik</td>
			<td>43602</td>
			<td>In the preparation of the PBS solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin/Streptomycin Solution</td>
			<td>Capricorn</td>
			<td>PB-S</td>
			<td>It was added to the medium to prevent contamination in cell culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Aid</td>
			<td>Isolab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision balance-Kern</td>
			<td>Kern-ABJ220-4NM</td>
			<td></td>
			<td>Used in the preparation of solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q500 Sonicator</td>
			<td>Qsonica, LLC</td>
			<td></td>
			<td>Used to digest exosomes in HPLC analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>47036-50G-F</td>
			<td>It was used by adding it to the total solution in the exosome dopamine loading process.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrostar-Nano-Spectrophotometry</td>
			<td>BMG LABTECH</td>
			<td></td>
			<td>Used for MTT and drug release analyzes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPSS 22</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>statistical package program</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vorteks-FinePCR</td>
			<td>FinePCR-FineVortex</td>
			<td></td>
			<td>Used to mix solutions homogeneously</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath 37 &#176;C-Senova</td>
			<td>Senova</td>
			<td></td>
			<td>Used in cell culture step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wharton&#8217;s jelly mesenchymal stem cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZetaSizer</td>
			<td>Malvern Nano ZS</td>
			<td>Malvern Nano ZS</td>
			<td>Used for exosome characterization</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

formulating and characterizing an exosome-based dopamine carrier system

Exosomer mellem 40 og 200 nm i størrelse udgør den mindste undergruppe af ekstracellulære vesikler. Disse bioaktive vesikler udskilt af celler spiller en aktiv rolle i intercellulær last og kommunikation. Exosomer findes for det meste i kropsvæsker såsom plasma, cerebrospinalvæske, urin, spyt, fostervand, råmælk, modermælk, ledvæske, sæd og pleursyre. I betragtning af størrelsen af exosomer menes det, at de kan spille en vigtig rolle i sygdomme i centralnervesystemet, fordi de kan passere gennem blod-hjerne-barrieren (BBB). Derfor havde denne undersøgelse til formål at udvikle et eksosombaseret nanobærersystem ved at indkapsle dopamin i exosomer isoleret fra Whartons gelémesenkymale stamceller (WJ-MSC'er). Exosomer, der passerede karakteriseringsprocessen, blev inkuberet med dopamin. De dopaminbelastede exosomer blev rekarakteriseret i slutningen af inkubationen. Dopaminbelastede exosomer blev undersøgt i lægemiddelfrigivelse og cytotoksicitetsassays. Resultaterne viste, at dopamin med succes kunne indkapsles i exosomerne, og at de dopaminbelastede exosomer ikke påvirkede fibroblastlevedygtigheden.

Exosom isolering og karakterisering Wharton geléstamceller dyrkes og inkuberes i et serumfrit medium i 48 timer, når kulturen når tilstrækkelig densitet. Efter inkubationens afslutning opbevares supernatanten ved -20 °C. De opsamlede supernatanter fortyndes med PBS og ultracentrifugeres (figur 1). Den opnåede opløsning analyseres ved NTA- og DLS-analyser. Exosomerne steriliseres ved at passere gennem et 0,22 μm filter. Den gennemsnitlige størrelse af de opnåede...

Watch this Scientific Journal Video about Formulating and Characterizing an Exosome-based Dopamine Carrier System at JoVE.com

Formulating and Characterizing an Exosome-based Dopamine Carrier System

Her sigtede vi mod at opnå en formulering ved dopaminindlæsning af de isolerede exosomer af stamceller fra Whartons gelé mesenkymale stamceller. Exosomisolering og karakterisering, lægemiddelbelastning i de resulterende exosomer og den cytotoksiske aktivitet af den udviklede formulering er beskrevet i denne protokol.

Formulering og karakterisering af et eksosombaseret dopaminbærersystem

Exosomes between 40 and 200 nm in size constitute the smallest subgroup of extracellular vesicles. These bioactive vesicles secreted by cells play an ...

Exosomer kan reagere på vesikler udskilt af en celle mellem 14 og 200 nanometer i størrelse og opdelt fra i den intracellulære last og kommunikation, som kommer til den mindste undergruppe af ekstracellulære vesikler. Exosomer, der dannes som et resultat af differentieringen af endosomet, stammer fra cellemembranen. Stamcellerne kan isoleres fra forskellige kilder såsom knoglemarv eller fedtvæv.men voksne vævstørrede stamceller har højere immunogent potentiale Ulemper Springende størrelsen af exosomer, det fortælles, at det har gjort en vigtig rolle i sygdomme i centralnervesystemet, fordi det kan passere igennem til blodhjernebarrieren. Til at begynde med skal du vaske de frøede Whartons gelé mesenkymale stamceller med fem ml PBS. Derefter tilsættes fem ml trypsin EDTA-opløsning, inden kolben anbringes i en inkubator.Efter inkubation samles cellerne og centrifugeres ved 1.500 G i fem minutter. Derefter fjernes supernatanten, og der tilsættes en milliliter DMEM-F12 indeholdende 10% FBS til glasset. Vask dyrkede celler med PBS.Efter vask tilsættes serumfrit DMEM-F12-medium til cellerne og anbringes i inkubatoren. For at isolere exosomerne opsamles det serumfrie medie og centrifugeres ved 300 G ved fire grader Celsius i 10 minutter. Supernatanten overføres til et andet glas og behandles ved seriecentrifugering ved højere hastigheder.Efter den endelige centrifugering fjernes supernatanten langsomt, og pelletsen opløses i 1 ml PBS. Bland ved hvirvelstrøm og fortsæt med ultracentrifugering ved 110.000 G i 70 minutter ved fire grader Celsius. Tilsæt tre ml PBS til exosomsuspensionen opsamlet tidligere ved ultracentrifugering og steriliser den fortyndede suspension ved filtrering ved hjælp af et 0,22 mikron filter.Overfør derefter 500 mikroliter af den steriliserede exosomsuspension til et andet rør. Derefter tilsættes sekventielt 500 mikroliter 0,5 milligram pr. milliliter dopaminopløsning og saponin i den steriliserede suspension. Efter inkubation ultracentrifugeres suspensionen.Prøven kan enten bruges til NTA- og DLS-analyse til at karakterisere dopaminbelastede exosomer eller opbevares ved minus 20 grader Celsius indtil videre brug. I NTA-analysen blev den gennemsnitlige størrelse af Wharton geléafledte exosomer bestemt til at være 98 nanometer og dopaminbelastede exosomer til at være 110 nanometer. Antallet af nanopartikler afsløret af NTA- og DLS-analyser var i overensstemmelse med hinanden.Zeta-potentialet for Wharton-geléafledte exosomer blev målt som minus 15,7 og dopaminbelastede exosomer som minus 17,6 millivolt. HPLC-analysen af de dopaminbelastede exosomer detekterede toppen for dopamin efter 6,45 minutter. Den kumulative lægemiddelfrigivelsesprofil afslørede, at 74,8% af indkapslet dopamin blev frigivet fra exosomerne inden for de første otte timer.Cytotoksiciteten af de dopaminbelastede og frie exosomer på fibroblaster blev undersøgt. Selvom de dopaminbelastede exosomer ikke viste nogen cytotoksiske virkninger, nedsatte saponin fibroblastlevedygtigheden. MTT-analysen viste øget cellelevedygtighed, når fibroblasterne blev behandlet med de dopaminbelastede exosomer.Den statistiske signifikans af resultaterne blev evalueret ved at udføre envejs anova. Derudover blev de cytotoksiske virkninger af forskellige koncentrationer af frie exosomer undersøgt på fibroblasterne. Fibroblastlevedygtigheden var højere med frie exosomer i en koncentration på 25 mikroliter pr. Milliliter.Det er virkelig vigtigt for centralnervesystemet er patientens størrelser, spille rolle i processer som plasticitet, neurorespons, side til side kommunikation og neurogenese i hjernen. Derudover er der takket være overfladen af eksosomer, det siger, blevet observeret, at de kan interagere med målcellemedicin og aktivitet leveret under lægemidlet Er en afslutning. For første gang i studiet udviklede vi en ny lægemiddelformulering ved at indkapsle dopamin i stamcelleafledte exosomer.Han foreslog, at denne formulering vil være så lovende til behandling af Parkinsons sygdom.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

An Experimental System to Study Mechanotransduction in Fetal Lung Cells

Et eksperimentelt system til Studieinformationen Mechanotransduction i føtale lungeceller

Mechanical forces generated in utero by repetitive breathing-like movements and by fluid distension are critical for normal lung development. A key ...

Methods for Characterizing the Co-development of Biofilm and Habitat Heterogeneity

Metoder til karakterisering af fælles udvikling af Biofilm og nye levesteder

Biofilms are surface-attached microbial communities that have complex structures and produce significant spatial heterogeneities. Biofilm development is ...

Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications

Design og implementering af en automatiseret lysende, Dyrkning, og Sampling System for Mikrobiel optogenetic Applications

Optogenetic systems utilize genetically-encoded proteins that change conformation in response to specific wavelengths of light to alter cellular ...

Targeted Plasma Membrane Delivery of a Hydrophobic Cargo Encapsulated in a Liquid Crystal Nanoparticle Carrier

Målrettet plasmamembran Levering af en hydrofob Cargo indkapslet i en Liquid Crystal Nanopartikel Carrier

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. ...

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

Kendetegner celle Migration inden for tre-dimensionelle In Vitro sår miljøer

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on ...

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Syntese af smitsomme Bakteriofager i en E. coli -baseret celle-gratis Expression System

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

An Orbital Shaking Culture of Mammalian Cells in O-shaped Vessels to Produce Uniform Aggregates

En Orbital ryster kultur i pattedyrsceller i O-formede fartøjer til at producere Uniform aggregeringer

Suspension cultures of mammalian cell aggregates are required for various applications in medical and biotechnological fields. The disposable bag-based ...

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

En ny kirurgisk teknik som et fundament for In Vivo delvis lever ingeniør i rotten

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver ...

Real-time Visualization and Analysis of Chondrocyte Injury Due to Mechanical Loading in Fully Intact Murine Cartilage Explants

Real-time visualisering og analyse af Chondrocyt skade som følge af mekanisk belastning i fuldt intakt Murine brusk Explants

Homeostasis of articular cartilage depends on the viability of resident cells (chondrocytes). Unfortunately, mechanical trauma can induce widespread ...

Screening and Identification of Small Peptides Targeting Fibroblast Growth Factor Receptor2 using a Phage Display Peptide Library

Screening og identifikation af små peptider rettet mod fibroblast vækstfaktor Receptor2 ved hjælp af et Phage display peptid bibliotek

The human Fibroblast Growth Factor Receptor (FGFR) family comprises four members, namely, FGFR1, FGFR2, FGFR3, and FGFR4, that are involved in various ...