Name: formulating and characterizing an exosome-based dopamine carrier system
Uploaded: 2022-04-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Formulating and Characterizing an Exosome-based Dopamine Carrier System at JoVE.com

Les travaux ont été principalement financés par des fonds de recherche fournis par les projets de recherche scientifique de l’Université technique de Yıldız (TSA-2021-4713).

REMARQUE : Voir le tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux et équipements utilisés dans ce protocole.
1. Culture et cryoconservation des cellules souches mésenchymateuses de la gelée de Wharton
<ol><li>Retirez les WJ-MSC (de l’ATCC) du congélateur à -80 °C. Semez les cellules dans une fiole contenant du milieu DMEM-F12 complété par 10 % de sérum de veau fœtal (FBS). Incubez-les à 37 °C dans un incubateur contenant ...

Les exosomes sont de petites vésicules membranaires de dimensions de 40 à 200 nm sécrétées par la plupart des types de cellules, par exemple, les CSM1. Capables de permettre la communication entre les cellules, les exosomes peuvent pénétrer dans les cellules de différentes manières telles que l’endocytose, la phagocytose, la micropinocytose, l’internalisation à médiation lipidique et la fusion33,44. Par rapport à d’autres...

Les exosomes, des vésicules bioactives aux caractéristiques significatives, ont une taille comprise entre 40 nm et 200 nm. Les exosomes proviennent de la membrane cellulaire et se forment en raison de la libération des endosomes1. Ces structures servent de communicateurs de cellule à cellule et interagissent avec les cellules voisines pour faciliter le transfert de molécules actives. Les exosomes peuvent être isolés à partir de nombreuses sources différentes. Il s’agit notamment des fluides corporels tels que le plasma, l’urine, le liquide céphalo-rachidien, la salive, ainsi que des lignées cellulaires cultivées dans des conditions in vitro . Les exosomes jouent un rôle important dans l’élimination des lésions nerveuses, grâce aux biomacromolécules qu’ils contiennent, telles que les lipides, les protéines et les acides nucléiques2. Les glies, qui sont les cellules de soutien du système nerveux3, transfèrent des protéines et des micro-ARN aux axones des neurones via les exosomes4.
Les lipides formant la gaine de myéline, qui sont un élément caractéristique de la conduction nerveuse, sont également libérés par les oligodendrocytes via les exosomes 4,5. Les exosomes sont également impliqués dans des processus tels que la plasticité synaptique, la réponse neuronale au stress, la communication cellule-cellule et la neurogenèse dans le cerveau 6,7. Le fait que les exosomes possèdent des dimensions nanométriques leur permet de passer à travers la BHE. Il existe une voie de transition spéciale entre le liquide interstitiel et le liquide céphalo-rachidien après avoir pénétré cette membrane8. Grâce à leurs propriétés de surface, les exosomes peuvent interagir efficacement avec les cellules cibles en tant que système d’administration de médicaments et délivrer activement les médicaments chargés.
En raison de l’expression de diverses protéines adhésives (tétraspanines et intégrines) à la surface des exosomes, ces vésicules extracellulaires peuvent facilement interagir et fusionner avec les membranes des cellules hôtes9. On pense que les exosomes peuvent être utilisés comme système d’administration de médicaments, en particulier dans le traitement des maladies du système nerveux central en raison de leur capacité à pénétrer dans la BHE et de leurs propriétés de surface. Les exosomes dérivés de cellules souches mésenchymateuses (CSM) présentent un risque de rejet immunitaire plus faible que les thérapies cellulaires allogéniques et, à cet égard, ils peuvent constituer un élément important des applications de traitement sans cellules10.
La dopamine est une molécule dont la carence dans le cerveau est le trait caractéristique de la maladie de Parkinson (MP), s’aggravant de jour en jour11,12,13. On sait que la maladie de Parkinson est associée à la dégénérescence des neurones dopaminergiques dans la substance noire du mésencéphale et à la perte des fonctions des motoneurones14,15. La mort des neurones dopaminergiques empêche l’apport du neurotransmetteur dopamine au striatum cérébral. Ceci, à son tour, entraîne l’apparition de symptômes spécifiques à la maladie de Parkinson16. Ces symptômes de la maladie de Parkinson sont la bradykinésie, l’instabilité posturale, la rigidité et surtout les tremblements au repos12,13. Bien que la maladie de Parkinson ait été décrite pour la première fois il y a plus de deux siècles, les études visant à comprendre la pathologie et l’étiologie de la maladie sont toujours en cours et il est actuellement admis que la maladie de Parkinson est une maladie systémique complexe17. Il est prédit qu’une carence en dopamine se produit et que des symptômes cliniques de la maladie de Parkinson sont observés lorsque plus de 80 % des neurones dégénèrent18. Dans le traitement de la maladie, une supplémentation incomplète en dopamine est préférée pour réduire les symptômes moteurs. Des études in vivo ont montré que l’infusion directe de dopamine dans le cerveau réduit considérablement les symptômes chez les animaux19. Les précurseurs de la dopamine tels que la L-DOPA (L-3,4-dihydroxyphénylalanine) et les médicaments à base de récepteurs de la dopamine sont utilisés en clinique parce que la perfusion directe de dopamine dans le cerveau n’est pas possible chez l’homme et que la dopamine entrant dans le système ne peut pas traverser le BHS20. Ces types de médicaments perdent de leur efficacité avec le temps. Cependant, il n’existe toujours pas d’approche curative pour la maladie de Parkinson. Il est donc absolument nécessaire de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques et modalités de traitement pour révéler la physiopathologie de la maladie et réduire l’impact de la maladie de Parkinson sur les patients.
Les études basées sur les exosomes ont récemment attiré l’attention pour la collecte d’informations sur les approches thérapeutiques et les pathologies des maladies du système nerveux. Il a été démontré que les exosomes dérivés de CSM réduisent l’inflammation des lésions nerveuses et contribuent à la régénération neuronale21,22,23. De plus, il a été rapporté que les sécrétomes d’exosomes dérivés de CSM réduisent l’apoptose en montrant des effets neurotrophiques et neuroprotecteurs, en particulier sur les neurones dopaminergiques24,25. La recherche sur les plateformes dans lesquelles les exosomes sont utilisés comme systèmes d’administration de médicaments thérapeutiques s’est intensifiée ces dernières années. Dans de nombreuses études, il a été observé que les médicaments pertinents peuvent être facilement encapsulés dans des exosomes et administrés en toute sécurité dans les cellules, les tissus et les organes cibles26,27. Différentes méthodes telles que l’incubation, les cycles de congélation/décongélation, la sonication et l’extrusion pourraient être utilisées pour le chargement du médicament dans les exosomes28.
La coincubation avec des exosomes ou des vésicules de type exosome permet d’encapsuler passivement de petites molécules lipophiles dans ces systèmes d’administration28,29,30. En particulier, diverses molécules telles que la curcumine31, la catalase 30, la doxorubicine 32 et le paclitaxel33 ont été efficacement chargées dans les exosomes. Il a été observé que les exosomes contenant de la catalase, qui ont une activité antioxydante, s’accumulaient efficacement dans les neurones et les cellules microgliales du cerveau et présentaient de fortes activités neuroprotectrices30. Dans la même étude, la saponine, ajoutée au complexe pour augmenter l’efficacité de la charge, a augmenté le pourcentage de charge du médicament pendant l’incubation30,34. Cependant, d’autres études sont nécessaires pour établir les normes de charge des médicaments dans les exosomes.
Cet article décrit le développement d’un système de nanotransporteurs par encapsulation de la dopamine dans des exosomes qui ont été isolés à partir de CSM-WJ. Toutes les étapes, y compris la culture des CSM-WJ, l’isolement et la caractérisation des exosomes, les expériences de chargement de médicaments, la caractérisation des exosomes chargés en dopamine avec diverses techniques et l’analyse de cytotoxicité in vitro sont expliquées en détail.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m membrane filter</td>
			<td>Aisimo</td>
			<td></td>
			<td>Used for the sterilization process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Aisimo</td>
			<td></td>
			<td>Used for the sterilization process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon tube</td>
			<td>Nest</td>
			<td></td>
			<td>Used in cell culture step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks</td>
			<td>Nest</td>
			<td></td>
			<td>Used in cell culture step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tube</td>
			<td>Nest</td>
			<td></td>
			<td>Used in cell culture step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks</td>
			<td>Nest</td>
			<td></td>
			<td>Used in cell culture step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plates (Falcon, TPP microplates)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td></td>
			<td>Used in cell culture step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>271004-1L</td>
			<td>Used for HPLC analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>NUVE-OT 90L</td>
			<td></td>
			<td>Used for the sterilization process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Cabin</td>
			<td>Hera Safe KS</td>
			<td></td>
			<td>Used for the cell culture process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>CF16RN</td>
			<td>Used in the exosome isolation step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator with Safe Cell UV</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td></td>
			<td>Used for the cell culture process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dopamine hydrochloride H8502-10G</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8502-10G</td>
			<td>Used in exosome dopamine loading</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium/Nutrient Mixture-F12</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>RNBJ7249</td>
			<td>Used as cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum-FBS</td>
			<td>Capricorn</td>
			<td>FBS-16A</td>
			<td>It was used by adding to the cell culture medium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer -80 &#176;C</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MDF-U5386S-PE</td>
			<td>To store cells and the resulting exosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fridge</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MPR-215-PE</td>
			<td>Used to store cell culture and other materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High performance liquid chromatography-HPLC</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>The presence of dopamine from the content of the obtained formulation was investigated.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope- Primovert</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Used to observe cells in cell culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTT Assay</td>
			<td>Biomatik</td>
			<td></td>
			<td>Used to measure cell viability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight NS300</td>
			<td>Malvern panalytical</td>
			<td>Malvern panalytical</td>
			<td>Used for exosome characterization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XPN-100 Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Used in the exosome isolation step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS tablet</td>
			<td>Biomatik</td>
			<td>43602</td>
			<td>In the preparation of the PBS solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin/Streptomycin Solution</td>
			<td>Capricorn</td>
			<td>PB-S</td>
			<td>It was added to the medium to prevent contamination in cell culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Aid</td>
			<td>Isolab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision balance-Kern</td>
			<td>Kern-ABJ220-4NM</td>
			<td></td>
			<td>Used in the preparation of solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q500 Sonicator</td>
			<td>Qsonica, LLC</td>
			<td></td>
			<td>Used to digest exosomes in HPLC analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>47036-50G-F</td>
			<td>It was used by adding it to the total solution in the exosome dopamine loading process.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrostar-Nano-Spectrophotometry</td>
			<td>BMG LABTECH</td>
			<td></td>
			<td>Used for MTT and drug release analyzes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPSS 22</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>statistical package program</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vorteks-FinePCR</td>
			<td>FinePCR-FineVortex</td>
			<td></td>
			<td>Used to mix solutions homogeneously</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath 37 &#176;C-Senova</td>
			<td>Senova</td>
			<td></td>
			<td>Used in cell culture step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wharton&#8217;s jelly mesenchymal stem cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZetaSizer</td>
			<td>Malvern Nano ZS</td>
			<td>Malvern Nano ZS</td>
			<td>Used for exosome characterization</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

formulating and characterizing an exosome-based dopamine carrier system

Les exosomes d’une taille comprise entre 40 et 200 nm constituent le plus petit sous-groupe de vésicules extracellulaires. Ces vésicules bioactives sécrétées par les cellules jouent un rôle actif dans la cargaison et la communication intercellulaires. Les exosomes se trouvent principalement dans les fluides corporels tels que le plasma, le liquide céphalo-rachidien, l’urine, la salive, le liquide amniotique, le colostrum, le lait maternel, le liquide articulaire, le sperme et l’acide pleural. Compte tenu de la taille des exosomes, on pense qu’ils peuvent jouer un rôle important dans les maladies du système nerveux central car ils peuvent traverser la barrière hémato-encéphalique (BHE). Par conséquent, cette étude visait à développer un système de nanotransporteurs à base d’exosomes en encapsulant la dopamine dans des exosomes isolés des cellules souches mésenchymateuses gelées de Wharton (WJ-MSCs). Les exosomes qui ont passé le processus de caractérisation ont été incubés avec de la dopamine. Les exosomes chargés en dopamine ont été recaractérisés en fin d’incubation. Les exosomes chargés de dopamine ont été étudiés dans des tests de libération de médicaments et de cytotoxicité. Les résultats ont montré que la dopamine pouvait être encapsulée avec succès dans les exosomes et que les exosomes chargés de dopamine n’affectaient pas la viabilité des fibroblastes.

Isolement et caractérisation des exosomes Les cellules souches gelées de Wharton sont cultivées et incubées dans un milieu sans sérum pendant 48 h lorsque la culture atteint une densité suffisante. Après la fin de l’incubation, le surnageant est stocké à -20 °C. Les surnageants collectés sont dilués avec du PBS et soumis à une ultracentrifugation (Figure 1). La solution obtenue est analysée par des analyses NTA et DLS. Les exosomes sont stérilisés en pa...

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Formulating and Characterizing an Exosome-based Dopamine Carrier System

Ici, nous avons cherché à obtenir une formulation par chargement dopaminergique des exosomes isolés de cellules souches issues des cellules souches mésenchymateuses gelées de Wharton. L’isolement et la caractérisation des exosomes, la charge du médicament dans les exosomes résultants et l’activité cytotoxique de la formulation développée sont décrits dans ce protocole.

Formulation et caractérisation d’un système de transport de dopamine à base d’exosomes

Exosomes between 40 and 200 nm in size constitute the smallest subgroup of extracellular vesicles. These bioactive vesicles secreted by cells play an ...

Les exosomes peuvent réagir aux vésicules sécrétées par une cellule d’une taille comprise entre 14 et 200 nanomètres, et se séparer de la cargaison intracellulaire et de la communication, qui se trouve dans le plus petit sous-groupe de vésicules extracellulaires. Les exosomes, qui se forment à la suite de la différenciation de l’endosome, proviennent de la membrane cellulaire. Les cellules souches peuvent être isolées à partir de différentes sources telles que la moelle osseuse ou les tissus adipeux.mais les cellules souches séchées des tissus adultes ont un potentiel immunogène plus élevé Inconvénients de la taille des exosomes, on dit qu’ils jouent un rôle important dans la maladie du système nerveux central car ils peuvent passer à travers la barrière hémato-encéphalique. Pour commencer, lavez les cellules souches mésenchymateuses de gelée de Wharton ensemencées avec cinq millilitres de PBS. Ajoutez ensuite cinq millilitres de solution d’EDTA de trypsine avant de placer le flacon dans un incubateur.Après incubation, prélever les cellules et centrifuger à 1 500 g pendant cinq minutes. Retirez ensuite le surnageant et ajoutez un millilitre de DMEM-F12 contenant 10% FBS dans le tube. Laver les cellules cultivées avec du PBS.Après le lavage, ajoutez le milieu DMEM-F12 sans sérum aux cellules et placez-le dans l’incubateur. Pour isoler les exosomes, prélever le milieu sans sérum et centrifuger à 300 G à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Transférez le surnageant dans un autre tube et traitez-le par centrifugation en série à des vitesses plus élevées.Après la centrifugation finale, retirez lentement le surnageant et dissolvez la pastille dans un millilitre de PBS. Mélanger par vortex et procéder à l’ultracentrifugation à 110 000 G pendant 70 minutes à quatre degrés Celsius. Ajouter trois millilitres de PBS à la suspension d’exosomes prélevée précédemment par ultracentrifugation et stériliser la suspension diluée par filtration à l’aide d’un filtre de 0,22 micron.Transférez ensuite 500 microlitres de la suspension d’exosomes stérilisée dans un autre tube. Ensuite, séquentiellement, ajoutez 500 microlitres de solution de dopamine à 0,5 milligramme par millilitre et de saponine dans la suspension stérilisée. Après l’incubation, ultracentrifuger la suspension.L’échantillon peut être utilisé pour l’analyse NTA et DLS afin de caractériser les exosomes chargés en dopamine ou stocké à moins 20 degrés Celsius jusqu’à une utilisation ultérieure. Dans l’analyse NTA, la taille moyenne des exosomes dérivés de la gelée de Wharton a été déterminée à 98 nanomètres et les exosomes chargés en dopamine à 110 nanomètres. Les nombres de nanoparticules révélés par les analyses NTA et DLS étaient cohérents entre eux.Le potentiel zêta des exosomes dérivés de la gelée de Wharton a été mesuré à moins 15,7 et les exosomes chargés en dopamine à moins 17,6 millivolts. L’analyse HPLC des exosomes chargés en dopamine a détecté le pic de dopamine à 6,45 minutes. Le profil de libération cumulatif du médicament a révélé que 74,8 % de la dopamine encapsulée a été libérée par les exosomes au cours des huit premières heures.La cytotoxicité des exosomes libres et chargés en dopamine sur les fibroblastes a été étudiée. Bien que les exosomes chargés en dopamine n’aient pas démontré d’effets cytotoxiques, la saponine a diminué la viabilité des fibroblastes. Le test MTT a montré une viabilité cellulaire accrue lorsque les fibroblastes ont été traités avec les exosomes chargés en dopamine.La signification statistique des résultats a été évaluée en effectuant une anova à un facteur. De plus, les effets cytotoxiques de différentes concentrations d’exosomes libres ont été étudiés sur les fibroblastes. La viabilité des fibroblastes était plus élevée avec des exosomes libres à la concentration de 25 microlitres par millilitre.Il est très important pour le système nerveux central que la taille des patients joue un rôle dans des processus tels que la plasticité, la réponse neurologique, la communication latérale et la neurogenèse dans le cerveau. De plus, grâce à la surface des exosomes, il a été observé qu’ils peuvent interagir avec le médicament de la cellule cible et l’activité délivrée pendant le médicament est un achèvement. Pour la première fois dans le cadre de l’étude, nous avons mis au point une nouvelle formulation de médicament en encapsulant de la dopamine dans des exosomes dérivés de cellules souches.Il a suggéré que cette formulation sera très prometteuse pour le traitement de la maladie de Parkinson.

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